QuEChERS/液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定豬肉中賽拉嗪及其代謝產(chǎn)物2，6-二甲基苯胺

張譯文，任蘇瑜，翟明燕，何 欣，譚 峰

（大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室，遼寧 大連 116024）

賽拉嗪是一種α受體激動劑，可直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，起到鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和麻醉效果，常作為肌肉注射鎮(zhèn)靜劑、止痛藥和肌肉松弛劑用于動物的基礎(chǔ)麻醉［1－2］。賽拉嗪在動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為2，6-二甲基苯胺（DMA），其可引起高鐵血紅蛋白癥，對中樞神經(jīng)和肝臟有一定損傷，嚴(yán)重時造成昏迷、休克，且具有基因毒性和致癌作用，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)將DMA列為2B類致癌物［3－4］。因此，動物源性食品中賽拉嗪和DMA的分析具有重要意義。

目前，賽拉嗪和DMA的分析主要采用液相色譜和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［1，5－8］。如高雪和崔晶晶等［5－6］對血液和尿液中的賽拉嗪及DMA含量進(jìn)行了檢測。Zheng等［7］測定了動物組織中賽拉嗪和DMA的殘留量。由于生物樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，樣品前處理過程尤為關(guān)鍵。目前生物樣品常用的前處理方法為液液萃取、固相萃取等，這些前處理方法操作較復(fù)雜且有機溶劑用量較多。QuEChERS是一種操作簡便、快速的樣品前處理技術(shù)，廣泛用于生物、食品及環(huán)境樣品的凈化處理［9－11］。本文將QuEChERS方法用于豬肉樣品中賽拉嗪和DMA的前處理，考察了不同提取溶劑、吸附劑種類及用量對目標(biāo)物回收率的影響，建立了豬肉中賽拉嗪及DMA的QuEChERS/液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS/MS）測定方法。該法具有簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點，可用于市售豬肉樣品中賽拉嗪及DMA的篩查。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent RPLC/6410B液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（美國安捷倫科技有限公司），KQ－20DE超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器公司），D-130勻漿機（德國Wiggens公司），VM-02U渦旋儀（美國Crystal公司），BSA224S電子天平（德國Sartorius公司），H1750離心機（湖南湘儀公司），Smart-S15實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰公司），WD-12氮吹儀（杭州奧盛公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，Sigma－Aldrich公司），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），賽拉嗪和DMA標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%，Dr.Ehrenstorfer公司）；C18吸附劑（50μm）和N-丙基乙二胺（PSA，40～63μm）均購于天津博納艾杰爾科技有限公司；豬肉樣品購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 液相色譜－質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜分析在Agilent RPLC/6410B液相色譜－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜上完成。色譜柱為Waters C18（100mm×2.1 mm，3.5 μm），柱溫為40℃，進(jìn)樣體積為10μL，流速為0.25 mL/min。流動相：A相為0.1 %甲酸－水溶液，B相為0.1 %甲酸－乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～0.5 min，20% B，0.5 ～4min，20%～70%B；4～4.01 min，70%～20%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子采集模式，霧化氣壓力為0.31 MPa，干燥氣溫度為250℃，干燥氣流速為14L/min，鞘氣溫度為350℃，鞘氣流速為12L/min，毛細(xì)管電壓為4kV，噴嘴電壓為1kV，碰撞解離電壓為120V，掃描范圍為m/z50～500，定量分析采用多反應(yīng)監(jiān)測模式。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱量賽拉嗪和DMA標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg于10.0 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容，配制得到質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20℃冷藏保存。

1.4 樣品前處理

1.4.1 QuEChERS法 稱取勻漿后的豬肉組織5g（“2.2.1 ”進(jìn)行提取方法比較時均使用0.25 g）于離心管中，加入賽拉嗪和DMA混標(biāo)溶液，使每種待測物的含量均為100μg/kg，渦旋后加入2%乙酸－乙腈溶液使總體積為20mL，勻漿1min，渦旋振蕩，然后加入3g無水Na2SO4和1g NaCl［12－13］，超聲1min，離心并收集全部上清液。向其中加入50mg PSA和100mg C18吸附劑，渦旋并超聲1min，于4℃離心得上清液，取2mL提取液氮吹至近干，用1mL初始流動相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后待LC－MS/MS分析。

1.4.2 液液萃取法 稱取勻漿后的豬肉組織0.25 g于離心管中，加入混標(biāo)溶液，使每種待測物的含量均為300μg/kg，渦旋混勻后，加入2%乙酸－乙腈溶液使總體積為3mL，勻漿1min，渦旋振蕩，離心收集上清液，殘渣用乙腈洗滌，重復(fù)提取1次，合并上清液。向其中加入2mL乙腈飽和的正己烷，水平振蕩提取5min，收集下層，相同步驟用正己烷重復(fù)提取2次，合并提取液后氮吹至近干，用1mL初始流動相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后待LC－MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜－質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化

根據(jù)待測物分子結(jié)構(gòu)，賽拉嗪和DMA中均含有氨基，易質(zhì)子化帶正電荷，因此采用正離子模式。以乙腈－水為流動相，并在流動相中添加0.1 %甲酸，以提供質(zhì)子化所需H+。對流動相梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，實驗發(fā)現(xiàn)采用“1.2”所示的簡單梯度洗脫程序，賽拉嗪和DMA即能實現(xiàn)很好的分離，整個分析過程可在4min完成（圖1A）。

為準(zhǔn)確定性樣品中的賽拉嗪和DMA，每個化合物須有2個定性離子。通過對賽拉嗪和DMA的二級譜圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)賽拉嗪碎裂后產(chǎn)生的碎片離子中，以m/z為90.3 和164.3 的碎片離子信號最強且穩(wěn)定；而DMA以m/z為105.4 和107.4 的碎片離子信號最強且穩(wěn)定，因此分別選擇上述碎片離子作為賽拉嗪和DMA的定性離子，與母離子構(gòu)成定性離子對（如表1），對樣品中賽拉嗪和DMA進(jìn)行確認(rèn)。此外，分別選擇m/z為90.3 和105.4 兩個碎片離子作為賽拉嗪和DMA的定量離子。進(jìn)樣質(zhì)量濃度為100μg/L時，賽拉嗪和DMA碎片離子的提取離子色譜圖分別為圖1B和C。

圖1 賽拉嗪和DMA的總離子流圖（A）及賽拉嗪（B）和DMA（C）碎片離子的提取離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of xylazine and DMA（A）and extracted ion chromatograms of xylazine（B）and DMA（C）

表1 賽拉嗪及DMA的質(zhì)譜分析參數(shù)Table1 Analytical parameters of tandem mass spectrometry for xylazine and DMA

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的選擇 將市購豬肉組織絞碎后按“1.4 ”兩種方法進(jìn)行溶劑提取、凈化處理，結(jié)果未檢出賽拉嗪和DMA，因此采用該樣品制備基質(zhì)空白溶液。首先對比分析了液液萃取法和QuEChERS法對豬肉中賽拉嗪和DMA的提取、凈化效果及回收率，豬肉組織取樣量均為0.25 g，提取溶劑體積為3mL。結(jié)果顯示，使用液液萃取法獲得的樣品背景較復(fù)雜，出現(xiàn)較多雜峰，干擾賽拉嗪和DMA的定量分析，目標(biāo)物的回收率為39.4 %～70.3 %。而采用QuEChERS法的除雜效果明顯，色譜圖的峰形較好，賽拉嗪和DMA的回收率為78.1 %～81.9 %，高于液液萃取法的回收率。因此實驗選擇QuEChERS法對樣品進(jìn)行前處理。

2.2.2 提取溶劑的優(yōu)化常見的提取溶劑有甲醇、正己烷、乙酸乙酯和乙腈等。研究表明，提取過程中加入微量有機酸（如甲酸、乙酸）能夠促進(jìn)目標(biāo)物在水相和有機相之間的分配和轉(zhuǎn)移［12］。考慮到豬肉樣品中大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)在乙腈或甲醇體系中有較好的沉淀效果，且目標(biāo)物在乙腈和甲醇中的溶解度高，因此分別考察了乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、乙腈－2%乙酸（HAc）、甲醇－2%乙酸作為提取溶劑時的效果。向空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使每種待測物的含量均為100μg/kg，按照“1.4.1”中QuEChERS方法以上述4種溶劑提取樣品后測定。結(jié)果顯示，4種溶劑對賽拉嗪的提取效率為67.3 %～88.9 %，而對DMA的提取效率較低，僅為9.3 %～36.5 %。其中以乙腈－2%乙酸為提取溶劑時賽拉嗪和DMA的提取效果最好（圖2）。因此，選擇乙腈－2%乙酸作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對賽拉嗪和DMA回收率的影響Fig.2 Effects of extraction reagents on the recoveries of xylazine and DMA

2.2.3 吸附劑種類與用量的優(yōu)化PSA是一種極性吸附劑，對目標(biāo)物的保留機理為弱陰離子交換（水溶性基質(zhì)）、極性相互作用（非極性有機基質(zhì)）、螯合作用，可有效去除脂肪酸、有機酸、極性色素和糖，廣泛用于農(nóng)殘樣品的前處理［13－14］。C18的疏水性強，對非極性組分有吸附作用，主要用于反相萃取，適用于非極性到中等極性的化合物。實驗考察了PSA（75mg）、C18（75mg）、PSA/C18（25mg/50mg）分別作為吸附劑對賽拉嗪和DMA回收率的影響。按照“1.4.1 ”中QuEChERS方法進(jìn)行前處理，結(jié)果如圖3所示，使用上述3種吸附劑時，賽拉嗪的回收率為70.6 %～77.1 %，差異較??；而DMA使用PSA和C18混合吸附劑的回收率為59.9 %，明顯高于單獨使用PSA或C18的回收率（15.9 %和48.0 %）。因此，實驗選擇PSA/C18混合吸附劑進(jìn)行樣品凈化處理。

圖3 吸附劑種類對賽拉嗪與DMA回收率的影響Fig.3 Effects of adsorbents on the recoveries of xylazine and DMA

進(jìn)一步對比了PSA/C18（10mg/20mg、25mg/50mg和50mg/100mg）不同用量組合條件下賽拉嗪和DMA的回收率。結(jié)果顯示，上述3種條件下賽拉嗪的回收率為89.1 %～90.4 %，DMA的回收率為59.9 %～79.3 %。實驗選擇PSA和C18的用量分別為50mg和100mg，此時兩目標(biāo)物的回收率總體較好。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在液相色譜－質(zhì)譜分析時，基質(zhì)效應(yīng)常對分析過程有顯著干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性?？紤]到豬肉中含有較多蛋白質(zhì)和脂肪，本文考察了賽拉嗪和DMA在空白樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。分別用純乙腈溶劑和空白基質(zhì)溶液稀釋賽拉嗪和DMA樣品的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，制備成不同質(zhì)量濃度的系列溶液，然后按照本方法進(jìn)行測定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度做校正曲線，并以2種曲線斜率的比值作為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，賽拉嗪與DMA的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.86 和0.89 ，均表現(xiàn)為弱抑制效應(yīng)。為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高準(zhǔn)確性和重復(fù)性，實驗采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線對目標(biāo)物進(jìn)行定量。

2.4 方法學(xué)評價

向空白基質(zhì)溶液中加入不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4.1”方法進(jìn)行前處理后測定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積對其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到賽拉嗪和DMA的線性范圍均為0.2 ～500μg/L。以3倍信噪比時的質(zhì)量濃度作為檢出限（LOD），以10倍信噪比時的質(zhì)量濃度作為定量下限（LOQ），計算得到賽拉嗪和DMA的LOD分別為0.05 、0.15 μg/L，LOQ分別為0.16 、0.50 μg/L，換算成以樣品質(zhì)量計算LOD分別為0.10 、0.30 μg/kg，LOQ分別為0.32 、1.00 μg/kg（見表2）。

為考察方法的回收率，取不同質(zhì)量濃度賽拉嗪和DMA的混標(biāo)溶液加入勻漿后的肉類樣品，使不同樣品間目標(biāo)物的含量為10、100、1000μg/kg，每個加標(biāo)樣品設(shè)6個平行組。經(jīng)前處理及LC－MS/MS測定后，計算得到賽拉嗪和DMA的回收率分別為95.6 %～108%和70.3 %～79.5 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.6 %～2.8 %和3.1 %～5.0 %（見表2）。

Compound Linear range（μg/L）0.2 ～500 0.2 ～500 r2 Xylazine DMA 0.993 0.99 8 LOD（μg/kg）0.10 0.3 0 LOQ（μg/kg）0.32 1.0 0 Added10μg/kg Recovery（%）95.6 70.3 RSD（%）2.8 5.0 Added100μg/kg Recovery（%）108 72.7 RSD（%）2.6 4.2 Added1000μg/kg Recovery（%）100 79.5 RSD（%）2.8 3.1

2.5 實際樣品的檢測

為驗證本方法的實用性和可靠性，在當(dāng)?shù)厣虉鲞x擇10個豬肉樣品，按照本方法對樣品進(jìn)行凈化后分析其中賽拉嗪和DMA的殘留。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品均未檢出賽拉嗪，但在1個樣品中檢出DMA，其含量為1.13μg/kg。圖4為該樣品的色譜圖。

圖4 實際樣品測定的色譜圖Fig.4 Chromatogram of an actual sample

3 結(jié) 論

本文建立了QuEChERS/液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定豬肉中賽拉嗪及其代謝產(chǎn)物DMA的分析方法，并優(yōu)化了提取溶劑、吸附劑種類和用量以及色譜、質(zhì)譜分析條件。所建立的方法操作簡單、分析速度快，回收率高，對賽拉嗪和DMA的檢出限分別為0.10 、0.30 μg/kg，能夠滿足實際樣品分析的要求。該方法成功應(yīng)用于市售豬肉中賽拉嗪和DMA殘留的檢測。