高效液相親水作用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定人尿液中煙堿及其9種代謝物

丁 麗，趙繼俊，陳志浩，蔣錦鋒，葉長(zhǎng)文，陳 宸，賀 琛，趙 閣

（中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001）

煙堿（Nicotine，NIC）是煙草中的主要生物堿，約占煙草生物堿總量的90%以上。卷煙抽吸時(shí)，約有40%的煙堿直接轉(zhuǎn)移至卷煙的主流煙氣和側(cè)流煙氣中［1］。人類吸入煙氣后，煙堿主要代謝為可替寧（COT）以及少量的煙堿氮氧化物（NNO）、降煙堿（NNIC）和煙堿糖苷（NIC－G）。COT進(jìn)一步代謝為反-3′-羥基可替寧（OHCOT）、可替寧氮氧化物（CNO）、可替寧糖苷（COT－G）和降可替寧（NCOT）。OHCOT可進(jìn)一步代謝為反-3′-羥基可替寧糖苷（OHCOT－G）。此外，人尿液中還有其他煙堿代謝物，但僅占煙堿代謝物總量的10%以下［2］。因此，同時(shí)測(cè)定人尿液中煙堿及其代謝物能有效評(píng)估煙堿的暴露情況［3］。

光度法［4－6］、免疫法［7－8］和色譜法［9－16］已被應(yīng)用于人體體液中煙堿及其代謝物的測(cè)定。其中，氣相色譜－質(zhì)譜法和液相色譜－質(zhì)譜法由于其優(yōu)越的靈敏度和選擇性而被廣泛應(yīng)用于人體體液中煙堿及其代謝物的測(cè)定。NIC和COT主要采用氣相色譜－質(zhì)譜法［9－12］直接檢測(cè)，OHCOT需經(jīng)衍生化后由氣相色譜－質(zhì)譜法檢測(cè)，糖苷類（COT－G和OHCOT－G）主要通過(guò)氣相色譜－質(zhì)譜間接測(cè)定由β-葡萄糖苷酶水解后的苷元得到其含量［9，11］。液相色譜－質(zhì)譜法更便捷，可直接用于煙堿代謝物，包括糖苷類代謝物的測(cè)定［13－18］。本課題組曾報(bào)道了一種液相色譜－質(zhì)譜法檢測(cè)尿液中煙堿及其9種代謝物的方法［13］，尿液用水稀釋后直接進(jìn)樣，然而由于COT－G在反相柱中保留較弱，出峰較早（保留時(shí)間為1.96 min），基質(zhì)效應(yīng)影響大，導(dǎo)致尿液樣品中該峰的峰形差。因此，本文嘗試用親水作用色譜分離煙堿及其代謝物以改善COT－G的分離度，提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度。親水作用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜已應(yīng)用于吸食無(wú)煙氣煙草制品的冰球運(yùn)動(dòng)員尿液中NIC、COT和OHCOT的同時(shí)檢測(cè)［19］，顯示出較好的分離度、峰形以及較高的靈敏度，但該方法前處理較繁瑣。

本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)煙堿及上述9種代謝物的溶劑直接稀釋結(jié)合高效液相親水作用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。該方法的前處理簡(jiǎn)單，且親水作用色譜改善了COT－G的分離效果，高有機(jī)相比例的流動(dòng)相提高了質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。該方法適用于大批量樣品的檢測(cè)，為評(píng)價(jià)人類卷煙煙氣暴露量提供了一種快速、靈敏的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；API4000液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Atlantis HILIC Silica色譜柱（3.0 mm×100mm，3.0 μm，美國(guó)安捷倫公司）；Milli－Q50超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；CP2245分析天平（感量0.0001 g，德國(guó)Sartorius公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

超純水（電導(dǎo)率≥18.2 MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色譜純，迪馬公司）；甲酸銨（色譜純，安譜公司）；NIC、NIC－G、COT、COT－G、OHCOT、OHCOT－G、NNIC、NCOT、CNO、NNO、NNIC－D4、COTD3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4（色譜純，加拿大TRC試劑公司）。

尿液樣品來(lái)自招募的自愿者，自愿者按照自身的消費(fèi)習(xí)慣抽吸卷煙，取24h尿樣，棄去晨尿，尿液收集于潔凈容器中于－18℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取適量NNIC、COT、NCOT、OHCOT、CNO、COT－G、NIC－G、OHCOT－G、NNO和NIC，用甲醇配成質(zhì)量濃度分別為20、300、20、400、50、200、200、200、100、300μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－18℃避光保存。

分別準(zhǔn)確稱取適量NNIC－D4、COT－D3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、0.2 、2、0.2 、2、2、2、1、2mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于－18℃避光保存。

準(zhǔn)確移取適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈/甲醇混合溶劑（體積比3∶1）配制成NNIC－D4、COT－D3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4的質(zhì)量濃度分別為1、2、0.2 、2、0.2 、2、2、2、1、2μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，于－18℃避光保存。

準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，加入200μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，用乙腈/甲醇混合溶劑（3∶1）配制成NNIC和NCOT的質(zhì)量濃度為0.2 ～20ng/mL，CNO為0.5 ～50ng/mL，NNO為1～100ng/mL，COT－G、NIC－G和OHCOT－G為2～200ng/mL，NIC和COT為3～300ng/mL，OHCOT為4～400ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于－18℃避光保存。

1.2.2 樣品前處理尿液于室溫下解凍后取500μL，加入200μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，用乙腈/甲醇混合溶劑（3∶1）定容至10mL，充分混合后，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，待分析。

1.2.3 分析條件 色譜柱：Atlantis HILIC Silica柱（3.0 mm×100mm，3.0 μm）；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.30 mL/min。流動(dòng)相：A為10mmol/L甲酸銨水溶液（用甲酸調(diào)至pH3.0 ），B為乙腈；進(jìn)樣前，色譜柱平衡16min。梯度洗脫程序：0～11min，95%～30%B；11～13min，30%～95%B；13～16min，保持95%B。

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；霧化氣（N2）：3.45 ×105Pa；輔助加熱氣（N2）：3.45 ×105Pa；氣簾氣（N2）：6.89 ×104Pa；電噴霧電壓：5000V；干燥溫度：500℃；掃描時(shí)間：40ms；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。煙堿及其代謝物的定量離子對(duì)（Q1/Q3）、去簇電壓（DP）、碰撞能（CE）及保留時(shí)間（RT）見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)分析物及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)與保留時(shí)間Table1 MS parameters and retention times of the analytes and internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

尿液直接稀釋進(jìn)樣是比較簡(jiǎn)單的前處理方法。采用C18柱分離煙堿及其代謝物時(shí)，可采用水作為稀釋溶劑［13］。而采用親水作用色譜柱分離煙堿及其代謝物，水并不是理想的樣品稀釋劑，因?yàn)樗娜軇?qiáng)度大于乙腈，若進(jìn)樣溶劑的溶劑強(qiáng)度大于初始流動(dòng)相，會(huì)造成色譜峰形擴(kuò)展。在親水作用色譜中，乙腈是很好的樣品稀釋劑，能保證良好的色譜峰形，但部分煙堿及其代謝物的重復(fù)性較差，其中NCOT、NIC－G的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）大于10%，這可能是由于分析物在乙腈中的溶解度不高所致［20］?？紤]到分析物能溶于甲醇，且在HILIC色譜系統(tǒng)中甲醇的溶劑強(qiáng)度小于水，因此，本實(shí)驗(yàn)以乙腈/甲醇混合溶劑（體積比3∶1）為稀釋劑，考察了不同的稀釋比例（5、10、20、30倍）對(duì)目標(biāo)物色譜峰形的影響。結(jié)果表明：不同的稀釋比例導(dǎo)致進(jìn)樣溶劑的組分和分析物濃度不同，因此對(duì)色譜峰形和靈敏度均有影響。尤其是出峰較早的COT、NCOT和OHCOT的色譜峰形受樣品溶劑強(qiáng)度的影響較大，以COT為例（如圖1），當(dāng)稀釋倍數(shù)為5和10倍時(shí)，峰擴(kuò)展較嚴(yán)重，當(dāng)稀釋倍數(shù)為20和30倍時(shí)，色譜峰形較好。綜合考慮分析物的色譜峰形和檢測(cè)靈敏度，最終選擇稀釋比例為20倍。

圖1 COT在不同稀釋倍數(shù)下的色譜峰Fig.1 Chromatographic peaks of COT at different dilution times

2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

在親水作用色譜中，為降低分析物和固定相硅醇基之間的靜電相互作用，保持流動(dòng)相的pH值和固定相硅醇基離子化狀態(tài)的穩(wěn)定，通常建議流動(dòng)相具有一定的緩沖能力。文獻(xiàn)顯示，pH3.0 的甲酸銨水溶液由于其自身的緩沖能力、對(duì)高比例乙腈的互溶性和有利于提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的特點(diǎn)，是親水作用色譜首選的流動(dòng)相［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用pH3.0 的甲酸銨水溶液為水相流動(dòng)相。

實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，由于各分析物偏堿性，所以采用正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。在正離子模式下，以流動(dòng)注射的方式對(duì)各分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液（lμg/mL）進(jìn)行全掃描，確定了各分析物的母離子（［M+H］+），然后分別以［M+H］+選擇對(duì)應(yīng)的子離子（碎片），選取信號(hào)較強(qiáng)、無(wú)互相干擾的碎片作為定量離子。最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式優(yōu)化霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣、電噴霧電壓和干燥溫度等質(zhì)譜分析參數(shù)，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。在“1.2.3”分析條件下，尿液中煙堿及其9種代謝物與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 煙堿及其代謝物與同位素內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of nicotine，its metabolites and deuterated internal standards

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中的背景雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)電離所致的質(zhì)譜信號(hào)增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象，會(huì)影響樣品定量的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，通過(guò)空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)斜率比為80%～120%時(shí)，表明基質(zhì)作用較小［21］。將目標(biāo)物的空白基質(zhì)和純?nèi)軇w積比3∶1的乙腈/甲醇混合溶劑）按照“1.2.1”配成相同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法進(jìn)行分析（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明：基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值為94%～110%，說(shuō)明本方法的基質(zhì)效應(yīng)小，該前處理方法結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)能有效減少基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限 采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，取“1.2.1 ”配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物與相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，煙堿及其9種代謝物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.997 。分別按信噪比（S/N）為3和10的質(zhì)量濃度確定檢出限（LOD）與定量下限（LOQ），得到10種目標(biāo)物的LOD和LOQ分別為0.03 ～0.24 ng/mL和0.10 ～0.80 ng/mL（見(jiàn)表2）。

表2 10種目標(biāo)物的基質(zhì)和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系、斜率比值、檢出限和定量下限Table2 Linear relations，slope ratios of ten analytes in the solvent and urine matrix，LODs and LOQs

2.3.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差用空白基質(zhì)加入低、中和高水平的煙堿及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察方法在不同加標(biāo)水平下的回收率。其中，中等加標(biāo)水平相當(dāng)于吸煙者尿液中的煙堿及其代謝物濃度。對(duì)中等水平加標(biāo)樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行測(cè)定，以日內(nèi)和日間RSD考察方法的精密度（見(jiàn)表3）。結(jié)果表明，低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為81.9 %～110%，日內(nèi)和日間RSD為0.50 %～6.7 %，符合生物樣品的分析要求。

表3 煙堿及其代謝物的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率Table3 Intra-day and inter-day RSDs and recoveries of nicotine and its metabolites

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)采集的172個(gè)卷煙消費(fèi)者的尿液樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，由于所吸卷煙焦油含量不同且存在個(gè)體代謝差異，所采尿液中煙堿及其9種代謝物的質(zhì)量濃度存在差異，平均質(zhì)量濃度及其范圍如下：NIC、COT、OHCOT、NIC－G、COT－G、OHCOT－G、NNIC、NCOT、NNO、CNO的平均質(zhì)量濃度為814.2 、1182.2 、2384.7 、603.8 、1733.3 、657.4 、33.6 、19.1 、259.7 、159.9 ng/mL，范圍分別為0～4260ng/mL、9.1 ～3580ng/mL、0～8460ng/mL、8.2 ～2180ng/mL、10.3 ～6360ng/mL、9.0 ～2373.5 ng/mL、0～137.8 ng/mL、0.4 ～60ng/mL、0～1118ng/mL、0～638ng/mL。以每種代謝物占煙堿及其代謝物總量的百分比計(jì)算，NIC為8.7 %、COT為17.3 %、OHCOT為30.4 %、NIC－G為7.9 %、COT－G為21.1 %、OHCOT－G為8.6 %、NNIC為0.4 %、NCOT為0.3 %、NNO為3.4 %，CNO為1.9 %，與文獻(xiàn)［14，22］報(bào)道數(shù)據(jù)的一致性較好。

3 結(jié) 論

本文建立了同時(shí)檢測(cè)人尿液中煙堿及其9種代謝物的高效液相親水作用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。采用體積比為3∶1的乙腈/甲醇混合溶劑將尿液樣品稀釋20倍，過(guò)0.22 μm濾膜后直接進(jìn)樣分析。親水作用色譜不僅改善了分析物的峰形，且高有機(jī)相比例流動(dòng)相的使用提高了質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度。該方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好，適合大批量尿液中煙堿及其9種代謝物的檢測(cè)。