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    快速固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中25種磺酰脲類及磺酰胺類除草劑殘留

    2021-10-17 07:58:42朱富強吳樹棟韓巖君郭宇鵬
    分析測試學(xué)報 2021年9期
    關(guān)鍵詞:磺隆草魚乙腈

    朱富強,吳樹棟,韓巖君,郭宇鵬

    (濱州市檢驗檢測中心,山東 濱州 256600)

    磺酰脲類和磺酰胺類除草劑在世界農(nóng)藥市場中占有重要地位,兩者應(yīng)用范圍廣、用量大,對于水稻、玉米、大豆、小麥、甜菜、油菜等作物的雜草防治具有良好效果[1-3]?;酋k孱惓輨┖突酋0奉惓輨┰谑┯眠^程中易通過地表徑流和滲透進入水環(huán)境中,污染養(yǎng)殖水體,進而影響水體生物的生長發(fā)育,造成水產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患,危害消費者健康。我國農(nóng)業(yè)部公告第2032號[4]規(guī)定,于2015年12月31日起全面禁止使用氯磺隆,于2017年7月1日起全面禁止使用胺苯磺隆及甲磺隆,并在GB2763-2019[5]中規(guī)定了多種磺酰脲類及磺酰胺類除草劑在食品中的最大殘留限量,但尚未制定在動物源性食品中的最大殘留限量。日本肯定列表制度中規(guī)定了動物源性食品中磺酰脲類及磺酰胺類除草劑的最大殘留限量[6],如噻吩磺隆及苯磺隆在豬肉等肉類中的最大殘留限量為0.01 mg/kg,磺?;锹≡隰~類、軟體動物、甲殼綱動物中的最大殘留限量為0.005 mg/kg,唑嘧磺草胺在雞肉、肝臟、蛋和奶中的最大殘留限量為0.1 mg/kg。因此,建立水產(chǎn)品中磺酰脲類及磺酰胺類除草劑的檢測方法,對于保障進出口貿(mào)易、保護人民健康具有重要意義。

    目前,文獻報道的水產(chǎn)品等動物源性食品中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[7-8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[9-10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11-12]、液相色譜法(HPLC)[13-14]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[15-16]等,樣品凈化方式通常采用固相萃取法(SPE)[17-18]和QuEChERS法等[19-20]。傳統(tǒng)的SPE方法操作費時、步驟繁瑣,影響結(jié)果穩(wěn)定性和檢驗效率,不能滿足大批量樣品的高通量、快速檢測要求。QuEChERS法具有便捷、高效、適用范圍寬等優(yōu)點,但凈化效果往往不如SPE法,且在實際應(yīng)用過程中需對各吸附凈化劑(如N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠、石墨化碳黑等)以及鹽析劑的用量進行優(yōu)化[15-16,19-20]。SHIMSEN QVet-NM+固相萃取柱使用新一代的固相萃取吸附劑,無需活化、淋洗、洗脫,可直接將提取液上樣在正壓下過濾除去雜質(zhì),實現(xiàn)通過式一步凈化,過程簡便、高效。本文針對不同基質(zhì)類型的水產(chǎn)品,采用SHIMSEN QVet-NM+固相萃取柱凈化,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測定樣品中25種磺酰脲及磺酰胺類農(nóng)藥殘留。該方法凈化效率高、操作便捷,且靈敏度高、準(zhǔn)確性好,可為水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險監(jiān)控提供借鑒與參考。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司);AccucoreTMaQ C18色譜柱(2.1 mm×50mm×2.6 μm,美國Thermo Fisher公司);Shim-pack GIST C18色譜柱、MultiS-100渦旋混合器(島津(上海)實驗器材有限公司);3-18K5離心機(德國Sigma公司);CP225D電子分析天平(德國Sartorius公司);Milli-Q Advantage A10超純水儀(美國Millipore公司)。

    甲醇、乙腈(HPLC級,德國Merck公司);甲酸(純度>99%,美國ACS恩科化學(xué)公司);超純水(電阻率≥18.2 MΩ?cm);SHIMSEN QVet-NM+固相萃取柱(5mL/5g)、SHIMSEN QuEChERS提取鹽包(含1g氯化鈉、4g硫酸鎂、0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物、1g無水檸檬酸鈉,島津(上海)實驗器材有限公司);尼龍針式濾器(0.22 μm,上海安譜科技有限公司)。

    標(biāo)準(zhǔn)品:醚磺?。?00μg/mL)、甲酰胺磺隆(100μg/mL)、氯酯磺草胺(100μg/mL)、玉嘧磺?。?000μg/mL)購自AccuStandard公司;甲基噻吩磺隆、吡嘧磺隆的質(zhì)量濃度均為100μg/mL,購自ANPEL公司;氟唑嘧磺草胺的質(zhì)量濃度為100μg/mL,購自BePure公司;氟磺隆、氟嘧磺隆、氟胺磺隆、五氟磺草胺、雙氯磺草胺、醚苯磺隆、甲磺隆、雙氟磺草胺、氯磺隆、四唑嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆的質(zhì)量濃度均為100μg/mL,購自First Standard公司;苯磺?。?00μg/mL)購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;氯嘧磺隆的質(zhì)量濃度為100μg/mL,購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;咪唑磺隆、嘧啶磺隆、磺酰磺隆、乙氧嘧磺隆、胺苯磺隆的純度均≥99%,購自Dr.Ehrenstorfer公司,各準(zhǔn)確稱取10.0 mg,用甲醇稀釋定容至100mL容量瓶中,配成質(zhì)量濃度均為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20℃避光保存。

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    各準(zhǔn)確移取一定量25種待測化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液至50mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容至刻度,配制成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,于-20℃低溫保存。臨用前,用空白樣品提取液配制成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    1.3 樣品前處理

    分別取草魚、鯉魚、鯽魚、克氏原螯蝦、南美白對蝦、文蛤的可食部分進行均質(zhì),準(zhǔn)確稱取2g試樣(精確至0.01 g)至50mL離心管中,加入10.0 mL超純水,渦旋1min,再準(zhǔn)確加入10.0 mL乙腈,渦旋提取5min,然后加入SHIMSEN QuEChERS提取鹽包,劇烈振搖1min,以8000r/min離心5min。取5mL上清液通過SHIMSEN QVet-NM+固相萃取柱,以1滴/s的流速加壓萃取,收集濾液,準(zhǔn)確吸取500μL濾液與500μL超純水混合,過0.22 μm有機微孔濾膜后,待測。

    1.4 色譜與質(zhì)譜條件

    色譜條件:Shim-pack GIST C18色譜柱(2.1 mm×50mm×2.0 μm);柱溫為40℃;進樣體積為5μL;流速為0.40 mL/min;流動相:A為0.1 %甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序為:0~2.8 min,10%~70% B;2.8 ~2.9 min,70%~95% B;2.9 ~3.9 min,95% B;3.9 ~4.0 min,95%~10% B;4.0 ~6.0 min,10%B。

    質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)源,正、負(fù)離子模式同時掃描;多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);離子源溫度:150℃;毛細(xì)管電壓:2.00 kV;脫溶劑氣溫度:600℃;脫溶劑氣流量:1000L/h;錐孔反吹氣流量:150L/h;碰撞氣流量:0.15 mL/min。25種除草劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 儀器條件的選擇

    2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 以0.1 %甲酸水溶液-乙腈(30∶70)為流動相,采用流動注射的方式,對待測化合物的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。在電噴霧正、負(fù)離子同時監(jiān)測模式下,優(yōu)化離子源溫度、脫溶劑氣溫度、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓等參數(shù),使目標(biāo)物母離子的響應(yīng)信號強度達到最佳,并進行二級質(zhì)譜掃描,確定定性離子和定量離子,在多反應(yīng)監(jiān)測模式下優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

    2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 分別考察了AccucoreTM aQ C18色譜柱(2.1 mm×50mm×2.6 μm)和Shimpack GIST C18色譜柱(2.1 mm×50mm×2.0 μm)對25種待測化合物的分離效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用后者作為分離柱時各待測化合物的峰響應(yīng)值更高,且保留時間更為合理,故選用Shim-pack GIST C18色譜柱為分離柱。由于待測物大部分在正離子模式下測定,酸性條件有利于離子化,可增強其響應(yīng)值,故流動相A相采用0.1%甲酸水溶液。比較了乙腈、甲醇作為流動相B相對目標(biāo)物色譜分離行為的影響。結(jié)果表明,以甲醇作為流動相B相時,25種待測化合物的峰響應(yīng)值普遍較低,且乙氧嘧磺隆、醚磺隆的峰形拖尾明顯;以乙腈作為流動相B相時,25種待測化合物的峰響應(yīng)值均高于甲醇,且峰形尖銳,因此采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相。MRM模式下25種待測化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/L)的總離子流圖(TIC)見圖1。

    圖1 MRM模式下25種待測化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/L)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of25analytes mixed standard solution(10μg/L)in MRM mode

    2.2 樣品提取方法的優(yōu)化

    本實驗嘗試采用甲醇、乙腈作為提取溶劑,結(jié)果顯示,由于水產(chǎn)品為高蛋白樣品,直接加入強極性有機溶劑后使蛋白質(zhì)迅速失水變性,導(dǎo)致樣品迅速結(jié)塊,影響待測化合物的提取效率。在加入提取溶劑前,加水稀釋使樣品分散均勻有利于待測化合物的提取。

    進一步以陰性草魚樣品為實驗對象,在待測化合物加標(biāo)水平為10μg/kg條件下,首先加入10mL水使樣品分散,再分別加入10mL的不同提取溶劑(甲醇、1%甲酸甲醇、乙腈及1%甲酸乙腈),然后加入QuEChERS提取鹽包進行鹽析,考察各提取溶劑對待測化合物的提取效率。結(jié)果表明,經(jīng)甲醇或1%甲酸甲醇提取后,鹽析效果差,無法分層,且所得提取液較為渾濁,待測化合物的回收率普遍較低(0%~45.6%),其原因可能在于甲醇水溶液對干擾物的溶解能力強,共萃物較多,影響了待測化合物的測定。采用乙腈或1%甲酸乙腈作為提取溶劑時各待測化合物的回收率均大于62%,且兩者無明顯差異。為節(jié)約成本、安全環(huán)保,最終選用乙腈作為提取溶劑。

    2.3 樣品凈化方式的選擇

    經(jīng)乙腈提取后的樣品溶液中含有大量磷脂等脂溶性化合物,會干擾待測化合物測定,且影響儀器性能。為降低基質(zhì)干擾,提高方法的準(zhǔn)確性和靈敏度,減少對色譜柱、質(zhì)譜檢測器的污染,須對樣品進行有效的凈化處理。SHIMSEN QVet固相萃取柱包括QVet-AG+、QVet-HP+、QVet-NM+等型號,前兩者主要應(yīng)用于高極性化合物,后者的適用范圍寬,可應(yīng)用于不同類型化合物的凈化。考慮到待測化合物的理化性質(zhì),因此選擇SHIMSEN QVet-NM+快速固相萃取柱對提取液進行凈化。采用通過式固相萃取凈化策略,將5mL樣品提取溶液直接加載至固相萃取柱以除去磷脂等雜質(zhì),過程簡便、快速、高效。為考察其凈化效果,參考文獻[21]的方法,通過采集m/z184前體離子,得到磷脂類化合物的含量信息。圖2為經(jīng)SHIMSEN QVet-NM+固相萃取柱凈化前后空白草魚樣品溶液的m/z184的TIC圖,可見,經(jīng)凈化后有效去除了磷脂類化合物,表明該方法的凈化效果顯著。

    圖2 采用快速固相萃取柱凈化前(A)和凈化后(B)的空白草魚樣品檢測效果比較Fig.2 Comparison of blank grass carp samples before(A)and after(B)rapid solid phase extraction

    2.4 進樣溶劑的優(yōu)化

    凈化后所得濾液的溶劑為乙腈,將濾液直接上機測試,發(fā)現(xiàn)所有待測化合物的峰形較寬、峰前拖尾,峰面積重現(xiàn)性較差,其原因為樣品溶劑的洗脫強度大于流動相的洗脫強度,溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰變形及柱效降低。本文采用稀釋法減小溶劑效應(yīng),經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn),取500μL濾液與500μL超純水混合后進樣分析,所有待測化合物的峰形均正常,且不會對檢出限造成較大影響,故最終采用將濾液用超純水稀釋1倍后進樣分析。

    2.5 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

    在LC-MS/MS分析中,基質(zhì)效應(yīng)(ME)是影響定性定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一。計算公式為:ME=(基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率/溶劑配制校準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%[22]。|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng),20%≤|ME|≤50%為中等程度基質(zhì)效應(yīng),|ME|>50%為強基質(zhì)效應(yīng)。由表2可知,25種待測化合物在草魚、南美白對蝦、文蛤中均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME<0);在草魚基質(zhì)中,玉嘧磺隆、氯磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆表現(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng);在南美白對蝦基質(zhì)中,苯磺隆、玉嘧磺隆、磺?;锹 ⒓谆锹?、醚苯磺隆、氟磺隆表現(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng);在文蛤基質(zhì)中,氟唑嘧磺草胺、甲基噻吩磺隆、苯磺隆、醚磺隆、磺酰磺隆表現(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng)。其余待測化合物在草魚、南美白對蝦、文蛤基質(zhì)中均為弱基質(zhì)效應(yīng)。為確保結(jié)果準(zhǔn)確性,選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法進行定量分析。

    表2 25種待測化合物在草魚、南美白對蝦及文蛤中的基質(zhì)效應(yīng)Table2 Matrix effects(ME)of25analytes in grass carp,penaeus vannamei and meretrix meretrix

    2.6 線性關(guān)系與檢出限

    分別采用草魚、南美白對蝦、文蛤空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為0.20 ~50μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照前述的儀器條件進行測定,以待測化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X,μg/L),峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以不同加標(biāo)水平下空白基質(zhì)樣品的儀器響應(yīng)為基準(zhǔn),按信噪比S/N=3計算檢出限(LOD),S/N=10計算定量下限(LOQ)。在3種空白樣品中,25種待測化合物在0.20 ~50μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.994 ;LOD為0.30 ~1.3 μg/kg,LOQ為1.2 ~5.0 μg/kg。以草魚空白基質(zhì)為例,結(jié)果見表3。

    表3 草魚空白基質(zhì)中25種待測化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table3 Linear equations,correlation coefficients(r2),LODs,LOQs,recoveries and RSDs(n=6)of25analytes in blank grass carp

    2.7 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

    取草魚、南美白對蝦、文蛤空白基質(zhì)樣品,進行低、中、高3個濃度水平的加標(biāo)回收實驗,按上述實驗條件進行測定,每個加標(biāo)水平平行分析6次,計算各目標(biāo)物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,該方法在草魚空白基質(zhì)中3個加標(biāo)水平下的回收率為62.7 %~117%,RSD為1.5 %~18%;在南美白對蝦空白基質(zhì)中的回收率為66.1 %~122%,RSD為1.8 %~17%;在文蛤空白基質(zhì)中的回收率為76.4 %~115%,RSD為0.72 %~11%。以草魚為例,各待測化合物的回收率和RSD見表3。

    2.8 實際樣品的測定

    應(yīng)用本方法對本實驗室在監(jiān)督抽檢中留存的10份水產(chǎn)品(包括草魚、鯉魚、鯽魚、克氏原螯蝦、南美白對蝦、文蛤)進行了測定,結(jié)果顯示所有樣品均未檢出待測化合物。

    3 結(jié) 論

    本文結(jié)合快速固相萃取技術(shù),以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了水產(chǎn)品中25種磺酰脲類和磺酰胺類農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法前處理簡便快速、凈化效果顯著,且靈敏度高、準(zhǔn)確性好,能夠準(zhǔn)確地對水產(chǎn)品中上述25種農(nóng)藥殘留進行定性定量分析,為水產(chǎn)品等動物源性食品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測與控制提供了一種新的可行途徑。

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