葡萄糖-6-磷酸功能化親水磁探針：有效分離富集糖肽/磷酸肽的雙用途親和材料

王柏純，袁雨欣，閆迎華，丁傳凡，唐科奇

（浙江省先進(jìn)質(zhì)譜技術(shù)與分子檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院質(zhì)譜技術(shù)與應(yīng)用研究院，寧波315211）

蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs），特別是糖基化和磷酸化［1，2］，在許多重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而一個(gè)特定的生物過(guò)程通常由不同類型的PTMs共同調(diào)控［3］，即PTM交互作用.糖基化和磷酸化之間的相互作用就是這種PTM交互作用的典型例子.例如，糖蛋白糖鏈的末端經(jīng)常會(huì)發(fā)生唾液酸化修飾［4］，而越來(lái)越多證據(jù)表明在腫瘤細(xì)胞表面這種唾液酸化糖蛋白的表達(dá)增加.唾液酸化修飾水平的變化與磷酸化存在著相互作用［5，6］，因此，糖基化和磷酸化的高效分離分析研究將有助于闡明相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理［7］.質(zhì)譜（MS）是目前應(yīng)用最廣泛的準(zhǔn)確識(shí)別和定位糖基化/磷酸化位點(diǎn)的平臺(tái)［8］.然而，由于大量未修飾肽的共存，直接利用MS進(jìn)行這2種PTMs的研究存在極大的限制，需要在MS分析前對(duì)生物樣品中的糖肽/磷酸肽進(jìn)行有效富集［9，10］.

金屬氧化物親和層析（MOAC）［11］和固定化金屬親和層析（IMAC）是目前最主要的捕捉磷酸肽的策略［12，13］.其中，基于MOAC技術(shù)的二氧化鈦（TiO2）由于比其它金屬氧化物具有更強(qiáng)的磷酸肽富集能力而被廣泛使用［14，15］.親水作用液相色譜法（HILIC）具有無(wú)偏富集糖肽的性能且易于與MS聯(lián)用，因此也成為糖肽富集最常用的方法之一［16，17］.迄今，已開(kāi)發(fā)出諸多親水探針用于糖肽的濃縮研究［18］.碳水化合物是自然界中最豐富的物質(zhì)，也是人體主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中最廉價(jià)的一種［19］，具有優(yōu)良的生物相容性和親水性［20］.殼聚糖［21］、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸（G6P）等碳水化合物［22，23］已被成功用于制備親水探針.作為一種容易獲得的生命代謝物，具有優(yōu)異親水性的G6P可以通過(guò)其磷酸基團(tuán)和金屬陽(yáng)離子之間的親和原理與金屬氧化物（如TiO2）結(jié)合，以構(gòu)建能夠同時(shí)高效富集糖肽/磷酸肽的功能化探針［24］.

多巴胺可以沉積在各種有機(jī)或無(wú)機(jī)基底表面，從而形成具有獨(dú)特親水性的天然膠黏劑聚多巴胺（PDA）［25，26］.此外，在水熱反應(yīng)中，PDA中的質(zhì)子化氮原子可以與金屬離子結(jié)合并介導(dǎo)其水解過(guò)程，充當(dāng)有機(jī)或無(wú)機(jī)基底與納米氧化物顆粒之間的偶聯(lián)連接劑［27］.因此，這種具有獨(dú)特親水性的天然膠黏劑因其多功能的表面改性和加工性能而被用于開(kāi)發(fā)新型功能化材料［28，29］.

本文在Fe3O4磁芯上利用逐層修飾法構(gòu)建了新型G6P功能化親水磁探針Fe3O4@PDA@TiO2@G6P.易修飾的Fe3O4對(duì)外磁場(chǎng)具有較強(qiáng)的響應(yīng)性，能夠簡(jiǎn)化固液分離過(guò)程；PDA可以作為偶聯(lián)連接劑在探針表面修飾金屬氧化物TiO2；引入的TiO2不僅可以作為后續(xù)官能化G6P的錨定位點(diǎn)，而且能夠通過(guò)MOAC技術(shù)有效富集磷酸肽；G6P的官能化賦予了納米球高親水性的表面，從而可實(shí)現(xiàn)糖肽的捕捉.這種結(jié)合MOAC和HILIC技術(shù)所構(gòu)建的雙用途功能化親水磁探針能夠?qū)崿F(xiàn)糖肽/磷酸肽的同時(shí)分離富集，將在多種PTMs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中顯示出巨大的應(yīng)用前景.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O，純度97%）、無(wú)水乙酸鈉（純度99%）、多巴胺鹽酸鹽（純度98%）、碳酸氫銨（NH4HCO3，純度＞99%）和氨水（35%）均購(gòu)自J&K Scientific百靈威科技公司；三羥甲基氨基甲烷（純度≥99.9%）、乙醇（A.R.級(jí)，純度95%）、異丙醇（Isopropanol，純度≥99.5%）、三氟乙酸（TFA，純度99%）、磷酸（H3PO4，A.R.級(jí)，純度≥85%）和乙二醇（A.R.級(jí)，純度98%）均購(gòu)自Macklin公司；鈦酸四丁酯（TBOT，純度97%）、β-酪蛋白（β-casein）、乙腈（ACN，純度≥99.9%）、牛血清白蛋白（BSA，純度＞98%）、碘乙酰胺（IAA，純度98%）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、胰蛋白酶（Trypsin）、葡萄糖-6-磷酸（G6P，純度≥98%）、二硫蘇糖醇（DTT，純度≥95%）和2，5-二羥基苯甲酸（DHB，純度≥99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司.所有溶液均采用Milli-Q超純水配制.

XL-30型掃描電子顯微鏡（荷蘭Philips公司）；JEOL 2011型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；D/MAX2500型X射線衍射儀（日本Rigaku公司）；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)尼高力公司）；Autoflex maX MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）.

1.2 Fe3O4@PDA@TiO2@G6P的合成

1.2.1 Fe3O4磁芯的合成將FeCl3·6H2O（2.7 g）加入乙二醇（150 mL）中，經(jīng)超聲獲得黃色透明液體；加入無(wú)水乙酸鈉（7.2 g）并攪拌30 min；將混合物轉(zhuǎn)移至帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓水熱反應(yīng)釜中，于200℃加熱16 h；將溶液冷卻至室溫，通過(guò)磁分離技術(shù)收集獲得的Fe3O4磁芯，用去離子水和乙醇各洗滌3次，于50℃下真空干燥過(guò)夜.

1.2.2 Fe3O4@PDA的合成將多巴胺鹽酸鹽（400 mg）加入去離子水（25 mL）中得到溶液A；將三羥甲基氨基甲烷（30.25 mg）和Fe3O4（100 mg）加入離子水（25 mL）/乙醇（25 mL）混合溶液中得到溶液B.將溶液A和B混合，常溫下攪拌16 h；通過(guò)磁分離技術(shù)收集獲得的Fe3O4@PDA，用去離子水和乙醇各洗滌3次，于70℃下真空干燥過(guò)夜.

1.2.3 Fe3O4@PDA@TiO2的合成在超聲作用下將Fe3O4@PDA（100 mg）分散于異丙醇（80 mL）中；加入三乙胺（0.06 mL）并攪拌2 min；加入TBOT（3.6 mL）后，將混合物轉(zhuǎn)移至帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓水熱反應(yīng)釜中，于200℃加熱24 h；通過(guò)磁分離技術(shù)收集獲得的Fe3O4@PDA@TiO2，用乙醇洗滌，于50℃下真空干燥過(guò)夜.

1.2.4 Fe3O4@PDA@TiO2@G6P的合成將Fe3O4@PDA@TiO2（80 mg）分散于含ACN（25 mL）、去離子水（25 mL）和TFA（50 μL）的混合溶液中；加入G6P（50 mg）并于25℃反應(yīng)6 h；通過(guò)磁分離技術(shù)收集獲得的Fe3O4@PDA@TiO2@G6P，用去離子水和乙醇各洗滌3次，于50℃下真空干燥過(guò)夜.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的酶解和實(shí)際樣品的預(yù)處理

1.3.1 HRP及β-casein的酶解將HRP或β-casein（各1 mg）加入到去離子水（100 μL）中，于100℃變性10 min；待混合物冷卻到室溫，加入NH4HCO3緩沖溶液（50 mmol/L，100 μL）和Trypsin（1 μg/μL，25 μL），將混合溶液在37℃下酶解16 h；將蛋白酶解物于?20℃儲(chǔ)存待用.

1.3.2 BSA的酶解將BSA（2 mg）和NH4HCO3緩沖溶液（50 mmol/L，385 μL）的混合物于100℃變性5 min；加入DTT（200 mmol/L，5 μL）并于60°C放置30 min；將IAA（400 mmol/L，10 μL）加入混合物中，并于37℃黑暗條件下反應(yīng)60 min；加入Trypsin（1 μg/μL，50 μL），將混合溶液于37℃酶解16 h；將蛋白酶解物于?20℃儲(chǔ)存待用.

1.3.3 唾液樣品的前處理在低溫環(huán)境下將人唾液（2 mL）加入到含TFA（0.2%）的水溶液（2 mL）中；在5438g轉(zhuǎn)速下離心10 min并收集上層清液；將上層清液于?20℃保存待用.

1.4 Fe3O4@PDA@TiO2@G6P對(duì)糖肽/磷酸肽的富集實(shí)驗(yàn)

將500 μg Fe3O4@PDA@TiO2@G6P分散于200 μL含有HRP酶解物（1.25 pmol/μL）的上樣緩沖液［V（ACN）∶V（H2O）∶V（TFA）=90∶9∶1］，在恒溫混勻儀上于37 °C振動(dòng)30 min.隨后，用洗滌緩沖液［V（ACN）∶V（H2O）∶V（H3PO4）=85∶14.5∶0.5］沖洗材料3次后，加入10 μL脫附緩沖液［V（ACN）∶V（H2O）∶V（TFA）=30∶69.9∶0.1］并于37°C振動(dòng)30 min，將捕捉到糖肽的洗脫.然后，取上層清液待檢測(cè).

磷酸肽的富集過(guò)程與糖肽類似.將500 μg Fe3O4@PDA@TiO2@G6P分散于200 μL含有β-casein酶解物（1 pmol/μL）的上樣緩沖液［V（ACN）∶V（H2O）∶V（TFA）=50∶49.9∶0.1］中，在恒溫混勻儀上于37°C振動(dòng)30 min；用洗滌緩沖液［V（ACN）∶V（H2O）∶V（TFA）=50∶49.9∶0.1］沖洗材料3次后，加入10 μL脫附緩沖液（0.4 mol/L氨水溶液）并于37°C振動(dòng)15 min，將捕捉到的糖肽洗脫.然后，取上層清液待檢測(cè).

1.5 基質(zhì)輔助激光解吸?飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI?TOF MS)分析

將DHB（1 mg）溶解于含ACN（20 μL）、去離子水（79.9 μL）和TFA（0.1 μL）的混合溶液中制得糖肽的基質(zhì)；將DHB（2 mg）溶于含ACN（50 μL）、去離子水（49 μL）和H3PO4（1 μL）的混合溶液中制得磷酸肽的基質(zhì).將洗脫液（1 μL）和基質(zhì)（1 μL）混合，進(jìn)行MALDI-TOF MS分析［Nd：YAG激光（383 nm），正離子模式，加速電壓20 kV，重復(fù)頻率1000 Hz］.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的合成及表征

Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針的合成路線如Scheme 1所示.通過(guò)水熱反應(yīng)合成Fe3O4磁芯；隨后，在室溫堿性條件下，在Fe3O4表面包裹PDA層；然后，以修飾的PDA層為偶聯(lián)連接劑接枝TiO2；最后，以接枝的TiO2為錨定位點(diǎn)官能化G6P，成功構(gòu)建了新型功能化親水磁探針Fe3O4@PDA@TiO2@G6P.

Scheme 1 Synthetic path of Fe3O4@PDA@TiO2@G6P

Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針的掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、能量色散X射線譜（EDX）和X射線粉末衍射（XRD）分析結(jié)果如圖1所示.由圖1（A）可見(jiàn)，獲得的Fe3O4@PDA@TiO2@G6P粒徑均勻，約為350 nm，且納米球表面粗糙，證明PDA和TiO2已成功修飾.從圖1（B）中可以觀察到納米球的核殼結(jié)構(gòu)，F(xiàn)e3O4磁芯的粒徑約為220 nm，PDA層厚度約為35 nm，TiO2層厚度約為30 nm，且PDA和TiO2層均勻涂附在Fe3O4表面，表明納米球已成功構(gòu)建.在納米球的EDX譜圖［圖1（C）］中可以觀察到碳（C）、氮（N）、氧（O）、磷（P）、鈦（Ti）和鐵（Fe）元素，其中Fe，N，Ti和P的存在分別說(shuō)明了Fe3O4，PDA，TiO2和G6P的存在.在Fe3O4@PDA@TiO2@G6P的XRD譜圖［圖1（D）］中，30.1°（220），35.5°（311），57.0°（511）和62.4°（440）處的峰表明存在Fe3O4；25.2°（101），47.6°（200），54.0°（105）和75.4°（215）處的峰表明存在TiO2.

Fig.1 SEM image(A),TEM image(B),EDX spectrum(C)and powder XRD pattern(D)of Fe3O4@PDA@TiO2@G6P

Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）如圖2所示.586和1630 cm?1處的峰分別歸屬于Fe—O—Fe和C=N的振動(dòng)，證明Fe3O4和PDA的成功制備；在接枝TiO2后，500~700 cm?1之間增強(qiáng)的寬帶是由Ti—O—Ti的伸縮振動(dòng)引起的，證明TiO2的成功引入；進(jìn)一步官能化G6P后，在1085 cm?1處出現(xiàn)了1個(gè)新的歸屬于P—O的伸縮振動(dòng)峰，證明G6P的成功修飾.FTIR結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針的成功構(gòu)建.

2.2 Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針富集糖肽的性能

利用HRP評(píng)估了該探針富集糖肽的能力，具體富集流程如Scheme 2所示.可見(jiàn)，該材料通過(guò)G6P與糖肽之間的親水相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽的捕捉，通過(guò)TiO2與磷酸根之間強(qiáng)的作用實(shí)現(xiàn)磷酸肽的選擇性富集.在未經(jīng)富集便直接檢測(cè)的情況下，從1.25 pmol/μL的HRP酶解物中僅檢測(cè)到5個(gè)糖肽的信號(hào)［圖3（A）］，且非糖肽信號(hào)占據(jù)主導(dǎo)譜，極大地抑制了糖肽的信號(hào).而在使用該探針特異性富集糖肽后，出現(xiàn)了23個(gè)屬于糖肽的信號(hào)［圖3（B）］，且糖肽信號(hào)占據(jù)主導(dǎo)譜，富集的糖肽的詳細(xì)信息示于表S1（見(jiàn)本文支持信息）中.質(zhì)譜圖中幾乎不存在非糖肽的信號(hào)，表明Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針具有優(yōu)異的富集糖肽的能力.

Scheme 2 Workflow of the enrichment of glycopeptides/phosphopeptides by Fe3O4@PDA@TiO2@G6P

通過(guò)從不同含量的HRP酶解物中富集糖肽研究了該探針的檢出限.當(dāng)將HRP酶解物的含量稀釋至10 fmol/μL時(shí)［圖S1（A），見(jiàn)本文支持信息］，可檢測(cè)到12個(gè)屬于糖肽的信號(hào)且占據(jù)主導(dǎo)譜；進(jìn)一步將含量稀釋至1 fmol/μL時(shí)［圖S1（B），見(jiàn)本文支持信息］，質(zhì)譜圖中仍出現(xiàn)7個(gè)糖肽信號(hào)且?guī)缀醪淮嬖诜翘请男盘?hào)；即使含量低至0.1 fmol/μL［圖S1（C），見(jiàn)本文支持信息］，探針依舊能捕捉到5個(gè)糖肽，表明Fe3O4@PDA@TiO2@G6P對(duì)糖肽具有較低的檢出限.

Fig.2 FTIR spectra of Fe3O4@PDA(a),Fe3O4@PDA@TiO2(b)and Fe3O4@PDA@TiO2@G6P(c)

Fig.3 MALDI?TOF mass spectra of HRP digests

通過(guò)改變HRP酶解物和BSA的質(zhì)量比研究了探針的選擇性.當(dāng)HRP酶解物與BSA的質(zhì)量比為1∶100時(shí)［圖S2（A），見(jiàn)本文支持信息］，質(zhì)譜圖顯示了13個(gè)屬于糖肽的信號(hào)，且非糖肽信號(hào)極低；當(dāng)二者質(zhì)量比增加到1∶250和1∶500后［圖S2（B）和（C），見(jiàn)本文支持信息］，雖然非糖肽信號(hào)的干擾增強(qiáng)了，但仍分別檢測(cè)到了6個(gè)和5個(gè)糖肽的信號(hào)且占據(jù)主導(dǎo)譜；在質(zhì)量比增加到1∶1000時(shí)［圖S2（D），見(jiàn)本文支持信息］，納米球依舊富集到了3個(gè)糖肽，表明該探針對(duì)糖肽具有良好的選擇性，并且可以從半復(fù)雜樣品中捕獲糖肽.

通過(guò)從1.25 pmol/μL的HRP酶解物中富集糖肽研究了探針的可重復(fù)利用性，該實(shí)驗(yàn)共重復(fù)10次.在每個(gè)循環(huán)之前，使用脫附緩沖液和上樣緩沖液洗滌納米球.由圖S3（A）~（D）（見(jiàn)本文支持信息）可知，盡管探針已經(jīng)重復(fù)使用10次，但其富集能力幾乎與最初時(shí)相同，表明該納米材料具有良好的可重復(fù)利用性.在控制合成納米球的條件完全相同的情況下，重新制備了2份不同批次的材料用于從1.25 pmol/μL的HRP酶解物中富集糖肽，考察了材料的制備重現(xiàn)性.由圖S3（A），（E）和（F）（見(jiàn)本文支持信息）可知，新合成的2批納米球的富集能力與第一批納米球的富集能力幾乎相同，表明Fe3O4@PDA@TiO2@G6P具有較強(qiáng)的可重復(fù)制備性.

通過(guò)使用不同量的納米材料（25~150 μg）從相同量的HRP酶解物（30 μg）溶液中富集糖肽研究了探針的負(fù)載量.隨著Fe3O4@PDA@TiO2@G6P納米材料用量的增加（圖S4，見(jiàn)本文支持信息），5種納米球捕獲糖肽的強(qiáng)度緩慢增至穩(wěn)定值，即當(dāng)納米材料的用量為100 μg時(shí)達(dá)到飽和.通過(guò)計(jì)算得到此時(shí)納米球?qū)μ请牡呢?fù)載量約為300 mg/g，表明該探針具有較大的負(fù)載量.

2.3 Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針富集磷酸肽的性能

利用β-casein評(píng)估了Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針富集磷酸肽的能力.未經(jīng)納米球富集時(shí)，從1 pmol/μL的β-casein酶解物中僅能檢測(cè)到1個(gè)強(qiáng)度極低的磷酸肽的信號(hào)［圖4（A）］，而非磷酸肽的信號(hào)占據(jù)主導(dǎo)譜.在使用納米球特異性富集磷酸肽后，質(zhì)譜圖由磷酸肽的信號(hào)占據(jù)主導(dǎo)譜且出現(xiàn)了8條磷酸肽的信號(hào)［圖4（B）］，說(shuō)明該探針具有優(yōu)異的富集磷酸肽的能力，富集到的磷酸肽的詳細(xì)信息示于表S2（見(jiàn)本文支持信息）.

Fig.4 MALDI?TOF mass spectra of β?casein digests

采用與糖肽類似的方法研究了該探針對(duì)磷酸肽的檢出限和選擇性.當(dāng)將β-casein酶解物的含量稀釋至2 fmol/μL時(shí)，雖然質(zhì)譜圖的信號(hào)強(qiáng)度有所下降，但幾乎不存在非磷酸肽的信號(hào)，且顯示了7條磷酸肽的信號(hào)［圖S5（A），見(jiàn)本文支持信息］；進(jìn)一步將含量稀釋至0.2 fmol/μL時(shí)，依舊出現(xiàn)了6個(gè)屬于磷酸肽的信號(hào)且?guī)缀醪淮嬖诜橇姿犭男盘?hào)［圖S5（B），見(jiàn)本文支持信息］；即使β-casein酶解物的含量低至0.02 fmol/μL，納米球依然捕捉到了4個(gè)磷酸肽［圖S5（C），見(jiàn)本文支持信息］，表明Fe3O4@PDA@TiO2@G6P對(duì)磷酸肽具有較低的檢出限.當(dāng)β-casein酶解物與BSA的摩爾比為1∶100時(shí)，檢測(cè)到8條屬于磷酸肽的信號(hào)，質(zhì)譜圖幾乎不存在非磷酸肽的信號(hào)［圖S5（D），見(jiàn)本文支持信息］；當(dāng)兩者的摩爾比增加到1∶500時(shí)，質(zhì)譜圖中磷酸肽信號(hào)減少到5條，但譜圖幾乎不存在非磷酸肽的信號(hào)［圖S5（E），見(jiàn)本文支持信息］；在將摩爾比增加到1∶1000后，雖然存在較強(qiáng)的非磷酸肽的干擾，但納米球仍捕捉到了4個(gè)磷酸肽［圖S5（F），見(jiàn)本文支持信息］，表明Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針對(duì)磷酸肽具有良好的選擇性.

通過(guò)從1 pmol/μL的β-casein酶解物中富集磷酸肽研究了探針的可重復(fù)利用性.在每次循環(huán)前均使用磷酸肽富集過(guò)程中使用的脫附緩沖液和上樣緩沖液洗滌納米球，共進(jìn)行了10次循環(huán).由圖S6（A）~（C）（見(jiàn)本文支持信息）可知，在經(jīng)過(guò)10次重復(fù)使用后，探針對(duì)磷酸肽的富集能力幾乎與第一次循環(huán)的結(jié)果相同，表明探針具有良好的可重復(fù)利用性.隨后，將進(jìn)行過(guò)10次磷酸肽富集循環(huán)的納米球再次用于選擇性捕捉糖肽［圖S6（D），見(jiàn)本文支持信息］，結(jié)果與未進(jìn)行磷酸肽富集而直接選擇性捕捉糖肽的結(jié)果類似［圖4（B）］，表明探針表面的G6P在磷酸肽富集的洗脫過(guò)程中并未被洗掉.同時(shí)，利用重新制備的2份不同批次的材料從1 pmol/μL的β-casein酶解物中富集磷酸肽研究了探針的制備重現(xiàn)性.新合成的2批納米球的富集能力［圖S6（E）和（F），見(jiàn)本文支持信息］與第一批納米球的富集能力［圖S6（A）］幾乎相同，表明探針具有較強(qiáng)的可重復(fù)制備性.

2.4 Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針用于同時(shí)富集糖肽/磷酸肽

通過(guò)從含有HRP酶解物和β-casein酶解物混合物中捕捉糖肽/磷酸肽研究了探針同時(shí)富集糖肽/磷酸肽的能力.參考文獻(xiàn)［11，25，30］報(bào)道，選擇可能利用HILIC和MOAC機(jī)制同時(shí)富集糖肽/磷酸肽的最佳條件，即在吸附過(guò)程中采用上樣緩沖液［V（ACN）∶V（H2O）∶V（TFA）=90∶7∶3］，在洗滌過(guò)程中采用洗滌緩沖液［V（ACN）∶V（H2O）∶V（H3PO4）=85∶14.5∶0.5］，在分步脫附過(guò)程中先后采用體積比為30∶70的ACN/H2O組成的洗滌緩沖液和0.4 mol/L氨水溶液進(jìn)行洗脫，在同時(shí)脫附過(guò)程中采用0.4 mol/L氨水溶液進(jìn)行洗脫.在直接檢測(cè)含有HRP酶解物和β-casein酶解物混合物的情況下，質(zhì)譜圖中僅出現(xiàn)了1個(gè)磷酸肽和2個(gè)糖肽的峰且豐度極低［圖5（A）］.在經(jīng)過(guò)探針同時(shí)富集并分步脫附后，出現(xiàn)23個(gè)糖肽和8個(gè)磷酸肽的信號(hào)并占據(jù)主導(dǎo)譜［圖5（B）和（C）］，與上述單獨(dú)富集糖肽/磷酸肽時(shí)的結(jié)果吻合.在研究該探針同時(shí)富集及脫附的能力時(shí)，共捕捉到21個(gè)糖肽和6個(gè)磷酸肽［圖5（D）］的信號(hào)，說(shuō)明探針具有良好的同時(shí)富集糖肽和磷酸肽的能力.

Fig.5 MALDI?TOF mass spectra of the mixture of HRP and β?casein digests

2.5 Fe3O4@PDA@TiO2@G6P對(duì)唾液中糖肽/磷酸肽的富集和檢測(cè)

唾液是一種便于采集和無(wú)創(chuàng)的良好生物樣本，其中含有大量?jī)?nèi)源性糖肽和磷酸肽.使用該探針捕獲唾液樣品中的糖肽和磷酸肽，以探究其實(shí)際應(yīng)用潛力.在對(duì)唾液樣品中內(nèi)源性的糖肽進(jìn)行富集之前，質(zhì)譜圖中非糖肽的信號(hào)占主導(dǎo)地位［圖6（A）］.利用探針處理后，共鑒定出34個(gè)糖肽［圖6（B）和（C）］，富集到的糖肽的詳細(xì)信息列于表S3（見(jiàn)本文支持信息）.此外，磷酸肽的富集結(jié)果與糖肽類似，即對(duì)唾液樣品中內(nèi)源性的磷酸肽進(jìn)行富集前，譜圖中非磷酸肽的信號(hào)占主導(dǎo)地位［圖6（D）］；在使用納米球進(jìn)行富集后，質(zhì)譜圖顯示出36個(gè)屬于磷酸肽的信號(hào)［圖6（E）和（F）］，富集到的磷酸肽的詳細(xì)信息列于表S4（見(jiàn)本文支持信息）.上述結(jié)果表明，該探針在實(shí)際生物樣品的應(yīng)用中具有廣闊的前景.

綜上所述，本文構(gòu)建了一種結(jié)合HILIC和MOAC技術(shù)的葡萄糖-6-磷酸功能化雙用途親水磁探針Fe3O4@PDA@TiO2@G6P，并通過(guò)SEM，TEM，EDX，XRD和FTIR對(duì)其進(jìn)行了表征.所制備的探針平均粒徑約為350 nm，修飾的PDA和TiO2層均勻涂附在Fe3O4表面形成良好的核殼結(jié)構(gòu)，具有強(qiáng)磁感應(yīng)及高親水性等優(yōu)點(diǎn).基于HILIC技術(shù)官能化的G6P適用于高選擇性捕獲糖肽，顯示出低的檢出限（0.1 fmol/μL）、高的選擇性［m（HRP）∶m（BSA）=1∶1000］、良好的重復(fù)性（10次循環(huán)）和高的負(fù)載量（300 mg/g）；基于MOAC技術(shù)接枝的TiO2不僅可以作為G6P的錨定位點(diǎn)，而且可以高效捕捉磷酸肽，顯示出低的檢出限（0.02 fmol/μL）和高的選擇性［n（β-casein）∶n（BSA）=1∶1000］.研究結(jié)果還表明，該探針具有同時(shí)富集糖肽和磷酸肽的能力.使用Fe3O4@PDA@TiO2@G6P探針選擇性地從復(fù)雜的生物樣品（唾液）中富集糖肽/磷酸肽時(shí)，共鑒定出34個(gè)糖肽和36個(gè)磷酸肽，表明該雙用途納米材料具有適用于實(shí)際樣品分析的能力，將在多種PTMs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中顯示出巨大的應(yīng)用前景.

Fig.6 MALDI?TOF mass spectra of glycopeptides(A―C)and phosphopeptides(D―F)captured from human saliva

支持信息見(jiàn)http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210256.