藍(lán)色熒光碳量子點(diǎn)的制備應(yīng)用于石菖蒲中有效成分細(xì)辛醚的檢測*

楊春艷 達(dá)瓦 靳貴林 益西拉姆 羅珍 馮明科

（西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000）

石菖蒲（拉丁學(xué)名：Acorus tatarinowii），屬天南星科、菖蒲屬禾草狀多年生草本植物，其根莖具氣味。葉全緣，排成二列，肉穗花序（佛焰花序），花梗綠色，佛焰苞葉狀。根莖常作藥用。

當(dāng)前對于石菖蒲的研究注重于其煎煮液和揮發(fā)油的藥理研究，并取得了相應(yīng)的成果。研究報(bào)道石菖蒲的煎煮液和揮發(fā)油提取物具有良好的藥理活性，具體體現(xiàn)在：（1）作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)：臨床上表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜、抗驚厥、降溫及治療癲癇的作用。（2）作用于心血管系統(tǒng)：臨床常用于冠心病、肺心病等屬于痰濁氣滯之胸痹者的治療。（3）作用于消化系統(tǒng)：石菖蒲煎劑內(nèi)服能促進(jìn)消化液的分泌及制止胃腸異常發(fā)酵，并有緩解腸管平滑肌痙攣的作用［2-4］。

但是對于其含量測定與成分檢測的研究相對較少，目前對于石菖蒲揮發(fā)油的分析檢測方法，主要采取GC-MS 分析手段進(jìn)行組分研究和檢測，其缺點(diǎn)在于設(shè)備儀器復(fù)雜、操作繁瑣、成本高等特點(diǎn)，對于石菖蒲這種藥材的后續(xù)研究帶來不便。因此所開展的研究重點(diǎn)在于建立一系列特異性的熒光探針對其中不同組分進(jìn)行特異性識(shí)別，具體而言就是建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析檢測方法，對石菖蒲中有效成分細(xì)辛醚進(jìn)行含量測定。這對于建立石菖蒲的持續(xù)研究開展提供了基本條件，進(jìn)一步可以促進(jìn)藏藥研究方法的標(biāo)準(zhǔn)化與國際化。

1 材料和方法

1.1 所用試劑及儀器

尿素、二甲雙胍、對苯并醌、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、苯胺、苯甲酸、間苯二酚、異煙肼、葡萄糖、煙酸、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、對硝基苯酚、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)金屬離子(Mg2+,K+、Ca2+,Sr2+,Fe3+,Na+,Ni2+)、甲醇(MEOH)、乙醇(ETOH)、正丙醇、丙酮(DMK)、二甲亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、四氫呋喃(THF)和氯化鈉來自Dingguo 昌盛生物技術(shù)有限公司有限公司(中國，北京)。超純水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程采用Aquapro超純水系統(tǒng)(中國成都)。

所有的熒光光譜分析都是通過日立F-7000 熒光分光光度計(jì)(日本東京)進(jìn)行測定，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5/5nm，檢測池為1cm×1cm。紫外/可見吸收光譜由紫外-2450 分光光度計(jì)測定(日本東京)，采用ES‐CALAB 250 的X 射線光電子能譜儀完成元素分析(日本東京)，傅里葉變換紅外能譜儀對官能團(tuán)進(jìn)行探索（日本東京）。Zetasizer 納米動(dòng)態(tài)光散射(DLS)儀器(Malvern,England)測定碳量子點(diǎn)的尺寸分布。恒溫水浴(DF-101s)購自鞏義儀器有限公司(中國鞏義)，pHS-3C數(shù)字pH計(jì)用于測定溶液的pH值（中國上海），絕對PL 量子產(chǎn)率光譜儀C11347(日本Hamamatsu)用于測定量子產(chǎn)率，碳量子點(diǎn)的粉末通過PiloFD8-4.3V(美國Charlotte)中進(jìn)行凍干后獲得。

1.2 碳量子點(diǎn)的合成

0.5g 尿素和1.0 g 二甲雙胍溶解在6 mL 的水中，將混合溶液依次轉(zhuǎn)移到25mL 內(nèi)襯聚四氟乙烯的不銹鋼高壓釜，隨后在180℃下反應(yīng)6 h。冷卻至室溫后將粗產(chǎn)物溶解于10mL 超純水中。將之前的溶液以3000 rpm 離心3min，將上清液用0.22mm 濾膜過濾以此除去較大的產(chǎn)物。再通過100MWCO的透析膜透析12h，最后通過凍干得到灰色的CDs粉末［5-7］。

1.3 樣品檢測

將兩個(gè)平行的200 μL 的CDs (1 mg/ mL)和800μL 的DMF 依次加入1.5 mL 的樣品管中。然后將200μL 的待測品(10-4 M)加入到之前的溶液中并進(jìn)行充分渦旋反應(yīng)。然后將上述混合物分別孵育5分鐘后進(jìn)行熒光測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs的表征

首先對所制備的CDs 進(jìn)行表征，CDs 在400nm 激發(fā)時(shí)表現(xiàn)出最大發(fā)射波長465 nm 的藍(lán)色熒光(圖2A)。可以觀察到CDs 在365 nm 的紫外下發(fā)出藍(lán)色熒光(Fig 1 a,b)。通過測得CDs 的熒光壽命計(jì)算是7.42 ns(圖1 B),以及最終的絕對測量量子產(chǎn)率是34.52%.同時(shí)CDs 的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)在280 nm 到325 nm 范圍內(nèi)降低，闡明了CDs 的熒光發(fā)射依賴于激發(fā)(圖S1)。同時(shí)在280 nm 處測量CDs 的紫外-可見吸收光譜(圖S2)，說明C=O 鍵存在n-π*電子躍遷。此外通過HRTEM 圖像顯示所制備的CDs 類似于球形，通過DLS 可以測得直徑主要位于4nm～9 nm 范圍內(nèi)，闡述了所合成的CDs 是均勻的且具備良好分散性。隨后通過FTIR 和XPS對CDs的組成和主要官能團(tuán)進(jìn)行了表征。其中FTIR 光譜在3352 cm-1處出現(xiàn)了O-H 的伸縮振動(dòng)，在1675cm-1處出現(xiàn)了C=O 的伸縮振動(dòng)。同樣，1450cm-1處的峰與C-H 的彎曲振動(dòng)有關(guān)，也與C-O 在1086 cm-1處的峰有關(guān)(圖1D)。此外，在XPS 表征結(jié)果中還觀察到C1s，O1s和N1s三種元素。碳和氧的含量分別為21.96%、58.75%和10.29%，闡明了制備的CDs主要由C，O，N 組成(圖2A)。C1s 譜的分峰表明存在C-C (284.78 eV)、C-O (286.38 eV)、O-C=O (288.67 eV)和C=O(288.90 eV)四種類型的碳鍵(圖3C)。同樣，O1s光譜顯示了O=C-O 在529.89 eV,C=O 在531.22 eV,C-O 在533.42 eV(圖3D)。XPS 結(jié)果表明，制備的CDs主要具有-COOH，-OH，-C=O 的官能團(tuán)，這與FTIR結(jié)果一致［8-9］。

圖1 (A)CDs的激發(fā)以發(fā)射以及在(a)日光及(b)365 nm紫外光下的圖譜；(B)CDs的熒光量子產(chǎn)率；(C)CDs的H-TEM成像及粒徑分布直方圖；(D)CDs的紅外吸收光譜

圖2 (A)CDs的XPS元素總譜；(B)C1s;(C)O1s;(D)N1s 不同元素的XPS分峰

2.2 合成條件優(yōu)化

通過實(shí)驗(yàn)對CDs的合成進(jìn)行了優(yōu)化，如圖3所示，CDs的熒光強(qiáng)度隨檸檬酸(圖3A)以及二甲雙胍的量相關(guān)(圖3B)，并且隨著反應(yīng)時(shí)間(圖3C)和以及反應(yīng)溫度(圖3D)的變化而變化，說明CDs 的合成受到這些條件的調(diào)控。因此，0.5 g 尿素和1.0 g 二甲雙胍，6h 以及180℃為制備CDs的最佳條件。

圖3 (A)檸檬酸及(B)二甲雙胍合成用量的優(yōu)化；(C)合成時(shí)間以及(D)合成溫度的優(yōu)化

2.3 建立分析策略

由于所制備的碳量子點(diǎn)的表面富含氨基羧基羥基以及環(huán)氧基等負(fù)電性基團(tuán)，因此基于此本研究探究CDs 是否能與潛在靶標(biāo)相互作用。同時(shí)，細(xì)辛醚的結(jié)構(gòu)中多個(gè)基團(tuán)以及氧原子，因此該分子可能存在較大的電負(fù)性，二者可能存在相互作用并導(dǎo)致碳量子點(diǎn)的熒光信號發(fā)生改變。因此將細(xì)辛醚(4×10-3～4.82×10-7M)濃度梯度加入1 mg/mL 的CDs 中進(jìn)行熒光光譜掃描，可以明顯看出，隨著待測樣品濃度的提升而熒光強(qiáng)度開始下降，4×10-4M的細(xì)辛醚的加入使得熒光強(qiáng)度猝滅僅為原強(qiáng)度的10%。基于此建立起通過碳量子點(diǎn)檢測細(xì)辛醚的方法，通過測定得到線性范圍為為8×10-7～4×10-4M(R2=0.988)，檢測限為20.68 nM，信噪比為3。驗(yàn)證了該方法具有較寬的線性響應(yīng)范圍和較低的檢測限，較之其他分析方法，通過熒光碳量子點(diǎn)分析細(xì)辛醚含量的方法具有較好的線性［10-13］。

2.4 檢測機(jī)理

本研究對檢測機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的探索。對于碳量子點(diǎn)熒光猝滅，先前文獻(xiàn)報(bào)道主要是由于量子尺寸效應(yīng)導(dǎo)致，因此通過探究細(xì)辛醚的引入是否導(dǎo)致粒徑的變化來論證。將4×10-3M 的細(xì)辛醚加入1mg/L 的CDs溶液中并充分?jǐn)嚢杌旌?，隨后通過H-TEM 和DLS對其粒徑進(jìn)行表征，通過表征引入待測物后粒徑平均分布在400nm～560 nm 之間，因此可以推斷由于細(xì)辛醚的加入碳量子點(diǎn)發(fā)生聚合，從而導(dǎo)致水合粒徑的增加，可以推斷量子效應(yīng)導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅。隨后通過對加入待測物前后引起的電勢的變化，可以看出待測物的加入使得溶液電負(fù)性從2.3 mV 降至-2.4 mV，即引入細(xì)辛醚后發(fā)生了電勢的變化，因此可以推斷由于二者存在電勢差，所制備的CDs 與待測物之間通過電子之間的相互作用力發(fā)生聚集，進(jìn)而導(dǎo)致監(jiān)測體系的熒光發(fā)生猝滅，從而實(shí)現(xiàn)了通過CDs對細(xì)辛醚進(jìn)行分析檢測。

圖4 (A)加入不同濃度的細(xì)辛醚后掃描得到的CDs的熒光光譜;(B)F-F0引入不同濃度細(xì)辛醚的對數(shù)濃度；(C)加入細(xì)辛醚后測得的H-TEM及DLS分布；(D)加入細(xì)辛醚后測得的電勢變化

3 結(jié)論

本研究通過水熱法制備得到一種高熒光量子產(chǎn)率的藍(lán)色熒光碳量子點(diǎn)，并對其進(jìn)行了詳細(xì)的表征，通過表征驗(yàn)證了碳量子點(diǎn)表面富含氨基，羥基羧基等官能團(tuán)，這些官能團(tuán)為碳量子點(diǎn)作為熒光探針提供了可能性。通過對碳量子點(diǎn)選擇性考察，發(fā)現(xiàn)細(xì)辛醚對所制備的碳量子點(diǎn)的熒光具有很好的猝滅作用?；诖私⒘艘訡Ds 為熒光探針來分析細(xì)辛醚的策略，檢測限可以達(dá)到20.68nM，突出了對細(xì)辛醚的優(yōu)異檢測能力，實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物優(yōu)異的檢測能力。