蘇云金芽孢桿菌對黏蟲致病力及生長發(fā)育的影響

于洪春，王 煜，孫苓芙，莊寶龍，李松媛，張蒙皓，侯月敏

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.沂水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 沂水 276400）

黏 蟲[Mythimna separata(Walker)]，屬 鱗 翅目、夜蛾科，為害水稻、玉米、小麥等多種植物[1-2]，具有遷飛能力強、發(fā)生范圍廣、暴食性突出、間歇性爆發(fā)、經(jīng)濟損失嚴重等特點[3-4]，是我國危害較重的糧食作物害蟲。黏蟲作為突發(fā)性和爆發(fā)性害蟲可造成巨大經(jīng)濟損失，威脅糧食生產(chǎn)安全[5-7]。

目前，殺蟲燈和糖醋液誘殺成蟲的綠色防控措施[2]等均為輔助防治措施，黏蟲防治仍以化學藥劑防治為主[8]。由于化學殺蟲劑連續(xù)使用，黏蟲對擬除蟲菊酯類等化學殺蟲劑已產(chǎn)生較嚴重抗藥性[9]，防效降低。且施藥次數(shù)和用藥量增多，增加防治成本，造成環(huán)境污染和食品安全性降低。因此，綠色防控技術(shù)成為黏蟲防治研究熱點。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）對靶標生物具有殺蟲特異性，已應(yīng)用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等害蟲生物防治[10-11]。在利用Bt防治黏蟲領(lǐng)域，昆蟲病原線蟲與Bt聯(lián)用可提高對黏蟲防效[1]，表達Cry1Ab殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)Bt玉米對黏蟲幼蟲有較好控制效果[12-13]。對黏蟲有殺蟲活性的Bt蛋白篩選研究也有報道[14]，但有關(guān)Bt菌株對黏蟲致病力研究較少。因Bt菌株異質(zhì)性，不同菌株對同一寄主昆蟲致病性存在較大差異，因此，搜集、篩選和分離高致病力菌株是開展Bt防治黏蟲應(yīng)用基礎(chǔ)性工作。

本研究在64株Bt菌株對黏蟲幼蟲殺蟲活性前期試驗基礎(chǔ)上，篩選出活性較高的9株Bt菌株，采用生物測定方法，篩選出高致病力Bt菌株，明確其對黏蟲不同蟲齡幼蟲及成蟲致病性和致病力；測定Bt致死中濃度處理的黏蟲幼蟲、成蟲生物學指標，探究其對存活蟲體生長發(fā)育影響，為開展Bt防治黏蟲提供理論和試驗證據(jù)，對黏蟲綠色防控、化學農(nóng)藥減量和食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲源

試驗用蟲為哈爾濱市郊區(qū)黑光燈誘集的黏蟲成蟲，帶回實驗室飼喂5%蜂蜜水后收集卵塊，在人工氣候箱內(nèi)用新鮮玉米苗飼養(yǎng)幼蟲，根據(jù)試驗所需選取不同蟲齡幼蟲及成蟲。

1.1.2 供試菌株

試 驗 所 用Bt5、Bt7、Bt25、Bt30、Bt45、Bt46、Bt61、Bt66和Bt79共9株菌株，為前期試驗篩選的對黏蟲有殺蟲活性的Bt菌株，均由東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物保護系農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，5%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 7.4~7.6。

1.2 方法

1.2.1 高致病力菌株篩選

將預(yù)試驗篩選出殺蟲活性較高的上述9株Bt菌株接種到LB固體斜面培養(yǎng)基，28℃條件下培養(yǎng)48 h后用無菌水洗下制成菌懸液并用血球計數(shù)板計數(shù)。按10倍稀釋法，稀釋至1×109、1×108、1×107、1×106和1×105芽孢·mL-15個濃度，采用浸漬法處理新鮮玉米葉片。每處理接入2齡幼蟲25頭并飼喂帶菌葉片，設(shè)置清水對照，3次重復(fù)。處理后在溫度（25±1）℃、相對濕度（75±10）%、光周期L14：D10人工氣候箱中飼養(yǎng)。每24 h調(diào)查并記錄死蟲數(shù)，重新更換新鮮葉片，連續(xù)觀察記錄至144 h。計算試蟲死亡率和校正死亡率，求得各菌株第6天毒力回歸方程和LC50，篩選出致病力最高菌株。

1.2.2 Bt菌株對不同蟲齡幼蟲致病力

將1.2.1篩選出致病力最高Bt菌株于28℃培養(yǎng)48 h后，用無菌水洗下。菌液稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105和1×104芽孢·mL-15個濃度，浸漬法處理玉米葉片后飼喂1齡幼蟲；1×109、1×108、1×107、1×106和1×105芽孢·mL-15個濃度處理玉米葉片后飼喂2齡、3齡幼蟲；1×1010、1×109、1×108、1×107和1×106芽孢·mL-15個濃度處理玉米葉片后飼喂4齡幼蟲。調(diào)查和統(tǒng)計方法同1.2.1，計算求得不同蟲齡下菌株毒力回歸方程和LC50。

1.2.3 Bt菌株對成蟲的致病力

將1.2.1篩選出高毒力Bt菌株配制成1×1010、1×109、1×108、1×107和1×106芽孢·mL-15個濃度菌懸液，然后分別加入蜂蜜制成5%蜂蜜水菌懸液。在每個透明塑料杯（容積300 mL）中接入一對24 h內(nèi)羽化的雌雄成蟲，用脫脂棉浸蘸蜂蜜水菌懸液置于杯底瓶蓋上，杯口罩紗布用橡皮筋箍緊，每處理5對成蟲，以無菌5%蜂蜜水作對照，3次重復(fù)。每24 h調(diào)查并記錄死蟲數(shù)，并重新更換新鮮浸蘸無菌5%蜂蜜水的棉花團，連續(xù)觀察至168 h。計算成蟲死亡率和校正死亡率，以及菌株第7天對成蟲毒力回歸方程和LC50。

1.2.4 Bt菌株致死中濃度處理幼蟲對存活黏蟲生長發(fā)育的影響

根據(jù)1.2.2試驗結(jié)果，篩選出高毒力Bt菌株配制成LC50菌懸液，浸漬法處理玉米嫩葉，以清水作對照，飼喂3齡初幼蟲，每24 h記錄死蟲數(shù)并更換新鮮葉片，直至幼蟲全部化蛹。記錄幼蟲發(fā)育歷期、蛹重、蛹期、羽化率、性比。羽化后成蟲隨機配對接入塑料杯并在杯底放置浸蘸無菌5%蜂蜜水的棉花團，觀察成蟲習性，記錄成蟲壽命及產(chǎn)卵量。隨機選取不同處理新產(chǎn)含70~100卵粒的卵塊各10塊，記錄卵期及孵化率，孵化出的幼蟲飼養(yǎng)至2齡初，記錄1齡幼蟲死亡率。

1.2.5 Bt菌株致死中濃度處理成蟲對存活黏蟲生長發(fā)育的影響

根據(jù)1.2.3試驗結(jié)果，配制LC50菌液，以1.2.3方法處理成蟲，設(shè)無菌5%蜂蜜水作對照，每處理7對成蟲，3次重復(fù)。每24 h觀測成蟲死蟲數(shù)、行為狀態(tài)及產(chǎn)卵情況，記錄每頭成蟲壽命及產(chǎn)卵量。后代生命力觀察和測定指標同1.2.4。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS（V7.05）軟件處理分析生物測定數(shù)據(jù)，計算各處理組毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和致死中濃度。用T檢驗分析致死中濃度下處理組與對照組間各項指標差異顯著性。死亡率（%）=（處理前活蟲數(shù)-處理后活蟲數(shù)）/處理前活蟲數(shù)×100；校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（100-對照組死亡率）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 高致病力菌株篩選

9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲毒力測定結(jié)果見表1。同一濃度下幼蟲校正死亡率隨時間增加而升高，同一菌株幼蟲校正死亡率隨菌液濃度升高而增加。各菌株低濃度對幼蟲致病力較差，在1×106和1×105芽孢·mL-1處理144 h后校正死亡率不超過17.81%，而在1×109芽孢·mL-1處理144 h后除菌株Bt30、Bt45外，其余菌株校正死亡率均達98.63%以上；Bt46、Bt61和Bt79在次高濃度1×108芽孢·mL-1處理144 h后幼蟲校正死亡率達91.78%以上。

表1 9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲毒力測定Table 1 Toxicity of nine Bt strains to 2nd instar larvae of Mythimna separata

9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲第6天毒力回歸方程及致死中濃度（LC50）見表2。菌株Bt30和Bt45的LC50>2.69×1010芽孢·mL-1，對黏蟲2齡幼蟲致病力較差；Bt46、Bt61和Bt79的LC50小于8.71×106芽孢·mL-1，對黏蟲2齡幼蟲有較高致病力。其中，菌株Bt46在濃度1×109和1×108芽孢·mL-1處理2齡幼蟲24 h后校正死亡率均超81.08%，96 h后兩處理組校正死亡率已達100%，殺蟲速度快、致病力高，為本研究篩選出的高毒力Bt菌株。

表2 9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲第6天毒力回歸方程及致死中濃度Table 2 Virulence regression equation and median lethal concentration of nine Bt strains to 2nd instar larvae on the 6th day

2.2 菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡幼蟲致病力

菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡幼蟲致病力見表3。各處理組幼蟲校正死亡率均隨時間增加而升高，但菌株Bt46對不同蟲齡幼蟲致病力存在較大差異。該菌株在試驗所設(shè)定濃度下處理1齡幼蟲致病力均較差，144 h后5個濃度校正死亡率為12.00%~37.33%。Bt46在濃度1×109芽孢·mL-1處理144 h時，2~4齡幼蟲校正死亡率分別為100%、92.00%和28.00%；1×108芽孢·mL-1處理144 h時，2~4齡幼蟲校正死亡率分別為100%、24.00%和5.33%，低于1×106芽孢·mL-1濃度對幼蟲幾乎無殺蟲活性。相同處理時間下，除1齡幼蟲外，校正死亡率均隨蟲齡增加而降低，當菌液濃度低于某一閾值其致病力驟減。

表3 菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡幼蟲致病力Table 3 Pathogenicity of the No.46 Bt strain against larvae of different instars

通過DPS（V7.05）軟件分析與計算，Bt46處理1~4齡幼蟲144 h后毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)及致死中濃度LC50分別為：Y=0.932X+18.942（R=0.1625），2.09×1018芽孢·mL-1；Y=26.988X-131.38（R=0.9351），5.25×106芽孢·mL-1；Y=18.267X-99.337（R=0.8004），1.51×108芽孢·mL-1；Y=22.267X-150.67（R=0.8386），1.02×109芽孢·mL-1。菌株Bt46對黏蟲2齡幼蟲致病力最強，其次為3齡、4齡幼蟲，而對1齡幼蟲致病力最弱。因此確定菌株Bt46防治黏蟲幼蟲最佳時期為2齡幼蟲期。

2.3 菌株Bt46對黏蟲成蟲致病力

菌株Bt46對黏蟲成蟲生物測定結(jié)果見表4。飼喂成蟲菌液后，成蟲校正死亡率隨時間增加而升高，1×1010芽孢·mL-1處理成蟲48~168 h校正死亡率由33.33%升至80.77%。同時校正死亡率隨菌液濃度降低而降低，高濃度菌液對成蟲致病力較強，當菌液濃度為1×108芽孢·mL-1及以下時成蟲校正死亡率低于30.77%，低濃度菌液對成蟲致病力較差。Bt46處理成蟲第7天毒力回歸方程為Y=-0.2950+0.6109X（R=0.9840），致死中濃度（LC50）為4.66×108芽孢·mL-1。觀察存活成蟲產(chǎn)卵發(fā)現(xiàn)，當菌液濃度>1×108芽孢·mL-1時，大部分雌成蟲不產(chǎn)卵，產(chǎn)卵時間較未飼喂菌液的對照延后10~48 h，單雌產(chǎn)卵量顯著降低，半數(shù)以上卵無法孵化幼蟲。

表4 菌株Bt46對黏蟲成蟲的生物測定Table 4 Bioassay of No.46 Bt strain to adults

2.4 菌株Bt46半致死濃度處理幼蟲對存活蟲體生長發(fā)育的影響

菌株Bt46半致死濃度處理黏蟲3齡初幼蟲后存活群體及其后代各生物學指標見表5。經(jīng)Bt46處理后，存活幼蟲發(fā)育歷期延長1.1 d、化蛹率降低7.2%、蛹期縮短0.23 d、蛹重增加0.03 g、羽化率降低2.4%、性比（雌：雄）降低0.21%、雄蟲壽命延長1.85 d、雌蟲壽命延長1.21 d、產(chǎn)卵量減少255?！ご?1，但與對照組差異均不顯著（P>0.05）。處理組后代卵期延長0.40 d，孵化率降低48.20%，與對照組差異顯著（P＜0.05）；后代1齡幼蟲死亡率達13.82%，為對照組死亡率2倍以上，但與對照組差異不顯著（P>0.05）。

表5 菌株Bt46半致死濃度處理3齡幼蟲后生物學參數(shù)Table 5 Biological parameters of No.46 Bt strain median lethal concentration on 3rd instar larvae and offspring

2.5 菌株Bt46半致死濃度處理成蟲對存活蟲體生長發(fā)育的影響

菌株Bt46半致死濃度處理黏蟲成蟲后存活群體及其后代的生物學參數(shù)見表6。與無飼喂菌液對照相比，處理組雌蟲與雄蟲平均壽命分別縮短4.76和14.67 d，單雌平均產(chǎn)卵量降低960.8粒，后代1齡幼蟲死亡率增加15.68%，與對照組均達極顯著差異（P＜0.01）。處理組卵期與對照相比差異不顯著。雖然處理組孵化率低于對照組12.10%，但二者差異不顯著。飼喂菌株Bt46菌液后，雌蟲比雄蟲壽命更短，產(chǎn)卵過后即死亡，平均壽命不足4 d，產(chǎn)卵量約為對照組產(chǎn)卵量的1/3。研究結(jié)果表明，菌株Bt46半致死濃度飼喂成蟲，對成蟲及其后代生命力均有不利影響。

表6 菌株Bt46半致死濃度處理成蟲后生物學參數(shù)Table 6 Biological parameters of No.46 Bt strain median lethal concentration on adults and offspring

3 討論與結(jié)論

蘇云金桿菌殺蟲活性蛋白不同，其對同種害蟲毒力存在較大差異[15-16]。一般認為Bt殺蟲晶體蛋白對小地老虎、甘藍夜蛾、黏蟲等夜蛾科害蟲不敏感[15]，導(dǎo)致防治效果不理想。本研究在前期選用高濃度對64株Bt菌株初篩基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)9株菌株對黏蟲2齡幼蟲有較好殺蟲活性，從中篩選出毒力最強菌株Bt46，其致死中濃度LC50為5.25×106芽孢·mL-1，在1×108芽孢·mL-1濃度2齡幼蟲24 h校正死亡率即達81.08%，96 h達到100%。說明通過擴大Bt菌株篩選范圍，可能獲得對夜蛾科害蟲致病力較強菌株。但濃度低于1×107芽孢·mL-1，菌株Bt46對黏蟲殺蟲活性急劇降低，其致病力明顯依賴于芽孢濃度。

菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡致病力研究中發(fā)現(xiàn)，其對黏蟲2齡幼蟲殺蟲活性最高，對3~4齡幼蟲殺蟲活性明顯降低，致病力隨蟲齡升高而降低，這與沙槎云等認為黏蟲幼蟲對Bt敏感性隨蟲齡增加而降低的結(jié)論一致[17]。但本研究發(fā)現(xiàn)菌株Bt46對黏蟲1齡幼蟲致病力較差，遠低于對4齡幼蟲致病力，即使用高濃度菌液，其校正死亡率也未超過40%。原因為黏蟲1齡幼蟲取食量極低，試驗24 h后更換無菌飼料，幼蟲取食菌量較少。因此，在生產(chǎn)實踐中用蘇云金芽孢桿菌制劑防治黏蟲適宜蟲齡期為2齡幼蟲。

本試驗將Bt菌株用于黏蟲成蟲致病性和致病力測定。菌株Bt46在109~1010芽孢·mL-1濃度處理成蟲168 h后校正死亡率達53.85%~80.77%，表明其對成蟲有致病性和一定致病力，同時未死成蟲活躍度降低，部分成蟲無法正常飛行，不足半數(shù)成蟲產(chǎn)卵，產(chǎn)卵時間延后，產(chǎn)卵量少且卵大部分無法孵化。因此，根據(jù)黏蟲趨化性，在糖醋酒液中添加蘇云金芽孢桿菌可有效誘殺黏蟲成蟲。

近年來，害蟲亞致死效應(yīng)研究漸多，包括對天敵的影響[18-19]及對靶標生物生長繁殖的影響[20-21]。本文研究菌株Bt46半致死濃度對黏蟲當代幼蟲、成蟲及后代1齡幼蟲的影響。研究發(fā)現(xiàn)，菌株Bt46處理幼蟲雖對當代存活幼蟲生長發(fā)育無明顯影響，但當代成蟲產(chǎn)卵量降低，后代幼蟲孵化率明顯降低；處理成蟲后，其壽命、產(chǎn)卵量均顯著降低，成蟲飛行活動異常，后代1齡幼蟲行動遲緩，存活率不足80%，表明菌株Bt46半致死濃度對黏蟲生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，尤其對黏蟲繁殖力和后代孵化率、存活率影響較大，與化學農(nóng)藥亞致死濃度處理當代種群導(dǎo)致其繁殖力降低結(jié)論一致[22-23]。

本文篩選出對黏蟲致病力較強Bt菌株，明確對黏蟲不同蟲齡和成蟲致病力差異，以及半致死劑量對黏蟲存活群體生長發(fā)育可產(chǎn)生不利影響，研究結(jié)果對豐富黏蟲綠色防控技術(shù)手段，減少化學農(nóng)藥使用量，延緩黏蟲產(chǎn)生抗藥性和綠色食品生產(chǎn)具有重要意義和實踐價值。