鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油及其抗氧化和清除亞硝酸鹽作用研究

席小輝，宋欠欠，江雨彤，楊曉宇，稅 清，秦宇仙，張能飛，李 誠，胡 濱

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

肉豆蔻屬于肉豆蔻科，是一種天然香料，主要產(chǎn)自于印度尼西亞、馬來西亞等地，我國主要分布在云南等地[1]。肉豆蔻精油是從干燥的成熟肉豆蔻種仁中提取的一種揮發(fā)油，含量為5%~8%；其主要成分為萜烯類化合物，如γ-松油烯等；肉豆蔻精油具有抗炎[2]、抗氧化[3]、鎮(zhèn)痛、抑菌、保肝、抗癌[4]等多種功效。目前，肉豆蔻精油常作為抑菌劑和天然抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、烘焙食品、肉制品及飲料等食品加工工業(yè)中[5]。

精油提取方法包括壓榨法、水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界流體萃取法、微波萃取法、超聲波萃取法等。付聰?shù)壤盟魵庹麴s法提取朝鮮崖柏枝精油，當(dāng)液料比6.9 mL·g-1、蒸餾時(shí)間2.7 h、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.6%時(shí)，精油得率為4.3%[6]。吳曉菊等利用有機(jī)溶劑法提取青金桔籽精油，當(dāng)以正己烷為提取溶劑，提取時(shí)間4 h、提取溫度50℃、料液比1：15（g·mL-1）條件下，神香草精油得率為1.093%[7]。Xiong等利用超臨界CO2萃取法提取陳皮揮發(fā)油，當(dāng)提取溫度45℃、萃取壓力14 MPa、萃取時(shí)間147 min時(shí)，揮發(fā)油得率為1.34%[8]。上述方法雖常用于精油提取，但壓榨法雖然操作簡單，但得率較低，雜質(zhì)較多，易變質(zhì)；超臨界流體萃取法操作復(fù)雜，成本高；有機(jī)溶液提取法極易殘留有機(jī)溶劑等，導(dǎo)致傳統(tǒng)方法無法大規(guī)模應(yīng)用。水蒸氣蒸餾法是將原料與水共同加熱，通過水蒸氣帶出易揮發(fā)油，冷凝回流收集精油，操作簡單、設(shè)備簡易、成本低廉，還可防止精油分解或變質(zhì)，降低成分餾出溫度[9]。研究表明，一定濃度NaCl溶液可提高精油得率[10]。目前，利用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油未見報(bào)道。

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，測定肉豆蔻精油基礎(chǔ)理化指標(biāo)、成分分析、結(jié)構(gòu)表征、熱力學(xué)性質(zhì)、抗氧化及清除亞硝酸鹽能力，以期為肉豆蔻精油進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

肉豆蔻：購自于廣西玉林宏鑫土特產(chǎn)公司，經(jīng)真空干燥粉碎，過40目篩后密封置于4℃冰箱中備用。

無水硫酸鈉、DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基）、無水乙醇、維生素E、酚酞指示劑、TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪）、氫氧化鉀、醋酸鹽緩沖液、氯化鈉、鹽酸、水楊酸-乙醇溶液、冰乙酸、H2O2、三氯甲烷、FeSO4、碘化鉀、硫代硫酸鈉等試劑，均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

揮發(fā)油測定器，上海臻潯金屬制品有限公司；電子天平（TE412-L），諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；電熱套（20002），上海貝侖儀器設(shè)備有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C），安捷倫科技有限公司；中草藥粉碎機(jī)（FW135），天津市泰斯特儀器有限公司；差示掃描量熱儀（Q200M DSC），美國TA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油

按照《中國藥典》I部（2010年）附錄XD方法[11]，將20 g肉豆蔻粉末置于500 mL圓底燒瓶，加入300 mL蒸餾水，連接揮發(fā)油提取裝置，電熱套加熱沸騰蒸餾5 h后，記錄精油體積，按照下式計(jì)算精油得率。

式中，V-精油體積（mL）；ρ-相對(duì)密度（g·mL-1）；m-肉豆蔻粉末質(zhì)量（g）。

1.3.2 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油

將20 g肉豆蔻粉末置于500 mL圓底燒瓶，按一定質(zhì)量比加入氯化鈉溶液，連接揮發(fā)油提取裝置，電熱套加熱沸騰后蒸餾提取，記錄精油體積，按照上式計(jì)算精油得率。

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

①液料比對(duì)精油得率的影響。設(shè)定NaCl濃度為4%，提取時(shí)間為3.5 h，測定不同液料比（8：1、10：1、12：1、14：1、16：1 mL·g-1）對(duì)得率的影響。

②提取時(shí)間對(duì)精油得率的影響。設(shè)定液料比為12：1，NaCl濃度為4%，測定不同提取時(shí)間（2.5、3、3.5、4、4.5 h）對(duì)得率的影響。

③NaCl濃度對(duì)精油得率的影響。設(shè)定液料比為12：1，提取時(shí)間3.5 h，測定不同NaCl濃度（2%、3%、4%、5%、6%）對(duì)得率的影響。

1.3.2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取各因素中肉豆蔻精油得率最高的3個(gè)水平，開展響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化肉豆蔻精油提取條件。

1.3.3 肉豆蔻精油理化指標(biāo)測定

測定兩種方法提取的肉豆蔻精油理化指標(biāo)，其中肉豆蔻精油試樣準(zhǔn)備、相對(duì)密度、蒸發(fā)后殘留物含量、酯值、過氧化值、酸值分別按照GB/T 14454.1-2008《香料試樣準(zhǔn)備》[12]、GB/T 11540-2008《香料相對(duì)密度測定》[13]、GB/T 14454.6-2008《香料蒸發(fā)后殘留物含量評(píng)估》[14]、GB/T 14455.6-2008《香料酯值或含酯量的測定》[15]、GB/T 33918-2017《香料過氧化值的測定》[16]、GB/T 14455.5-2008《香料酸值或含酸量的測定》[17]等標(biāo)準(zhǔn)測定。

1.3.4 肉豆蔻精油成分分析及表征

1.3.4.1 GC-MS分析

將兩種方法提取的肉豆蔻精油作GC-MS分析。參考Wang等方法稍作修改[18]。色譜柱HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），He為載氣，流速為1 mL·min-1。起始溫度設(shè)定為50℃并保持2 min，然后以10℃·min-1速度增至300℃并保持3 min。噴射器和檢測器溫度分別設(shè)置為250和280℃。分流比60：1，進(jìn)樣量1 μL，電離方式EI，電離電壓70 eV，離子源溫度260℃，掃描質(zhì)量范圍40~800 amu，全掃描。通過檢索NIST11數(shù)據(jù)庫闡明肉豆蔻精油化學(xué)成分。

1.3.4.2 DSC（差示掃描量熱法）分析

將兩種方法提取的肉豆蔻精油作DSC分析。稱取適量微膠囊于鋁坩堝中，蓋上坩堝蓋，放入樣品室，以空坩堝為空白對(duì)照，掃描溫度范圍為100~300℃，程序升溫速率為10℃·min-1，氮?dú)饬魉贋?0 mL·min-1。

1.3.5 肉豆蔻精油抗氧化性能測定

1.3.5.1 總抗氧化能力測定

參考李嘉欣等方法[19]。取不同質(zhì)量濃度FeSO4溶液0.1 mL，各加入2.9 mL TPTZ工作液，37℃下反應(yīng)10 min，測定其在波長為593 nm處吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別取0.2 mL不同質(zhì)量濃度精油溶液于5 mL離心管中，加入3.8 mL TPTZ工作液（0.3 mol·L-1醋酸鹽緩沖液，10 mmol·L-1TPTZ溶液，20 mmol·L-1FeCl3溶液以V（醋酸鹽緩沖液）：V（TPTZ溶液）：V（FeCl3溶液）=10：1：1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配），37℃下反應(yīng)10 min，測定其在波長為593 nm處吸光度，以等濃度VE為對(duì)照。

1.3.5.2 DPPH·清除率測定

參考Cui等方法[20]，利用無水乙醇配制濃度為2、4、6、8和10 mg·mL-1精油溶液，避光保存。取2 mL 0.02 mg·mL-1DPPH-無水乙醇溶液與2 mL精油溶液置于具塞試管中，充分反應(yīng)，在517 nm處測定吸光度為A，2 mL無水乙醇與2 mL DPPH-無水乙醇溶液吸光度為B，精油與無水乙醇吸光度為C，以上體系均避光反應(yīng)0.5 h，以VE作為陽性對(duì)照。DPPH·清除率按下式計(jì)算。

1.3.5.3 羥基自由基清除率測定

參考蘇瑾等方法[21]。利用無水乙醇配制濃度為2、4、6、8和10 mg·mL-1精油溶液，取2 mL精油溶液、0.2 mL 8.8 mmol·L-1H2O2溶液、1 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液和1 mL 9 mmol·L-1FeSO4溶液，充分混勻，在37℃下水浴30 min，乙醇溶液調(diào)零，在510 nm下測定吸光值為A，將精油溶液用無水乙醇代替測定吸光度為B，將H2O2用蒸餾水代替測定吸光度為C。用VE作為陽性對(duì)照。羥基自由基清除率按下式計(jì)算。

1.3.6 肉豆蔻精油清除亞硝酸鹽能力測定

將5 mL 0.5 mol·L-1、pH 3檸檬酸鈉－鹽酸緩沖液置于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 100 mg·L-1NaNO2溶液，再分別加入0、100、200、300、400、500 μL肉豆蔻精油，定容至刻度，37℃反應(yīng)1 h。吸取0.4 μL反應(yīng)液于10 mL容量瓶中，加入0.4 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，0.2 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液酸鹽，搖勻后放置15 min，用分光光度計(jì)在538 nm處測吸光度值，按照下式計(jì)算亞硝酸鹽清除率:

式中，A-未加精油空白試驗(yàn)吸光值；B-添加不同精油反應(yīng)液吸光值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果取平均值，運(yùn)用Microsoft Excel（2010）初步整理數(shù)據(jù)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果用Design-Expert 10.0軟件處理，SPSS 21.0作顯著性分析，采用Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 液料比對(duì)得率的影響

液料比對(duì)得率影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 液料比對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the yield

由圖1可知，精油得率隨液料比增加而呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)液料比為12：1時(shí)，精油得率最大，為12.35%。液料比為8：1~12：1，得率隨液料比增加而增加，可能是因蒸餾水增加導(dǎo)致其與原料接觸面積增大，滲入植物細(xì)胞中，加熱蒸餾水可使植物細(xì)胞快速破裂，不斷釋放精油[22]。此外，傳質(zhì)速率及分子擴(kuò)散也隨液料比增加而不斷提高，使提取率增加[23]。當(dāng)液料比繼續(xù)增加時(shí)，得率下降，可能因溶劑過多，精油在水中溶解度增加，導(dǎo)致得率減小。因此，選擇液料比為12：1較適宜。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

提取時(shí)間對(duì)得率影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield

由圖2可知，隨提取時(shí)間增加，得率呈先增后減趨勢(shì)。在提取時(shí)間2.5~3.5 h范圍內(nèi)，得率隨提取時(shí)間增加而升高，因蒸餾水浸潤肉豆蔻粉末過程中，精油不斷蒸出，得率提高。當(dāng)提取時(shí)間為3.5 h時(shí)，得率最大。隨提取時(shí)間繼續(xù)增加，得率則顯著降低，可能因精油長時(shí)間暴露于高溫導(dǎo)致某些有效成分損失[24]。此外，原料中精油隨時(shí)間增加而逐漸減少，且精油易揮發(fā)，提取后期揮發(fā)損失速率高于出油率，導(dǎo)致得率降低。因此，選擇提取時(shí)間3.5 h較為適宜。

2.1.3 NaCl濃度對(duì)得率的影響

NaCl濃度對(duì)得率影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 NaCl濃度對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on the yield

由圖3可知，隨NaCl濃度增加，得率先增后減。在蒸餾水中加入適量NaCl可提高精油得率，因NaCl可增加原料組織細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，使油脂類物質(zhì)更易滲出[25]，NaCl濃度為2%~5%，得率隨NaCl濃度升高而增加；NaCl濃度為5%時(shí)，得率最高，達(dá)13.26%；NaCl濃度高于5%時(shí)，得率呈下降趨勢(shì)，可能因過高NaCl濃度使精油在蒸餾水中溶解度降低，隨水蒸氣蒸餾出精油量減少，得率降低。此外，過量NaCl更易引起爆沸，精油中揮發(fā)性強(qiáng)成分損失增加，導(dǎo)致得率下降[26]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面模型建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立響應(yīng)面模型，以A（液料比）、B（提取時(shí)間）及C（NaCl濃度）3個(gè)因素為自變量，以得率為響應(yīng)值，按照Design-Expert 10.0軟件中Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)（Response surface methodology，RSM），各因素具體取值和RSM結(jié)果見表1。

表1 BBD設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experiment design and results of BBD

采用Design-Expert 10.0軟件分析表1試驗(yàn)結(jié)果，得出得率與液料比、提取時(shí)間和NaCl濃度二次回歸方程模型：

2.2.2 響應(yīng)面模型顯著性檢驗(yàn)

對(duì)二次回歸方程模型作方差分析，結(jié)果見表2。P值表示自變量對(duì)響應(yīng)值顯著程度的影響，P值越大，顯著性越?。环粗?，則顯著性越大。

由表2可知，該模型中R2為0.9958，R2Adj為0.9905，均接近于1，表明該模型擬合度較高。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)一步顯著檢驗(yàn)可知，A、B、AB、A2、B2、C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P<0.01），C、AC、BC對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P<0.05），說明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)面影響為二次拋物線關(guān)系，存在最大值。因此，該模型可用于預(yù)測肉豆蔻精油得率。

表2 回歸方程方差分析Table 2 Variance analysis of regression equation

2.2.3 各因素間交互作用響應(yīng)面分析

各因素間交互作用響應(yīng)面結(jié)果如圖4所示。

圖4 兩因子交互作用對(duì)得率影響響應(yīng)面Fig.4 Response surface of the effects of interaction of two factors on yield

由圖4a可知，當(dāng)NaCl濃度固定在中心點(diǎn)，提取時(shí)間一定時(shí)，得率隨料液比增加先增后減。當(dāng)料液比一定時(shí)，得率隨提取時(shí)間增加先升后降。因此，料液比和提取時(shí)間對(duì)得率存在極顯著交互作用。

由圖4b可知，當(dāng)提取時(shí)間固定在中心點(diǎn)，NaCl濃度一定時(shí)，得率隨料液比增加先增后減。當(dāng)料液比一定時(shí)，得率隨NaCl濃度增加先升后降。因此，料液比和NaCl濃度對(duì)得率存在顯著交互作用。

由圖4c可知，當(dāng)料液比固定在中心點(diǎn)，NaCl濃度一定時(shí)，得率隨提取時(shí)間增加先增后減。當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，得率隨NaCl濃度增加先升后小幅降低。因此，提取時(shí)間和NaCl濃度對(duì)得率存在顯著交互作用。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 10.0軟件預(yù)測回歸方程模型，獲得較優(yōu)肉豆蔻精油提取工藝為：液料比12.19：1、提取時(shí)間3.62 h、NaCl濃度2.85%，理論得率為13.25%?？紤]到試驗(yàn)可操作性，將精油提取工藝修正為：液料比12：1、提取時(shí)間3.6 h、NaCl濃度3%，對(duì)修正后條件作3次試驗(yàn)，平均得率為13.27%，與預(yù)測值接近，說明該模型可預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，具有較好應(yīng)用價(jià)值。

2.3 兩種提取方法提取肉豆蔻精油得率的比較

兩種提取方法提取肉豆蔻精油得率比較如表3所示。

表3 兩種提取方法提取肉豆蔻精油得率比較Table 3 Comparison of yield of nutmeg essential oil by two extraction methods

由表3可知，水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油5 h，得率達(dá)9.83%；鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油3.6 h，得率達(dá)13.27%，表明鹽析輔助水蒸氣蒸餾法可有效提高肉豆蔻精油得率，縮短提取時(shí)間，有效節(jié)約成本。因此，鹽析輔助水蒸氣蒸餾法具有較好適用性。

2.4 肉豆蔻精油理化特性分析

由表4可知，水蒸氣蒸餾法和鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油基礎(chǔ)理化指標(biāo)相似，表明鹽析輔助水蒸氣蒸餾法未對(duì)肉豆蔻精油產(chǎn)生影響。肉豆蔻精油感官品質(zhì)較好，無色透明，具有典型肉豆蔻香辛料味；在20℃時(shí)，密度約在0.9，處于正常范圍；蒸發(fā)后殘留物約1.6%，表明肉豆蔻精油揮發(fā)性強(qiáng)；酸值可反應(yīng)精油抗氧化能力和質(zhì)量，酸值越高，精油質(zhì)量越差，抗氧化能力越低，肉豆蔻精油酸值均<1.2 mg KOH·g-1，具有良好抗氧化性；肉豆蔻精油過氧化值較低，表明精油質(zhì)量較好。

表4 肉豆蔻精油理化指標(biāo)及感官品質(zhì)Table 4 Physical and chemical indices and sensory quality of nutmeg essential oil

2.5 肉豆蔻精油成分分析及表征

2.5.1 GC-MS分析

利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)肉豆蔻作成分分析，總離子流圖見圖5。

圖5 肉豆蔻精油總離子流Fig.5 Total ion flow diagram of nutmeg essential oil

按峰面積歸一化法計(jì)算各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，經(jīng)NITS11譜圖庫檢索對(duì)比，同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)，確定肉豆蔻精油組成成分，檢索結(jié)果見圖5和表5。水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油檢出30種化合物，鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油共檢出33種化合物，兩種方法提取肉豆蔻精油主要成分相同，為肉豆蔻醚、皮蠅磷、甲基丁香酚、欖香素等。肉豆蔻精油主要由烯類、醇類、酯類、醚類、酸類及酚類等物質(zhì)組成，約占總成分93%。Dupuy等[27]在對(duì)肉豆蔻精油成分分析中也得出一致結(jié)論，說明鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取對(duì)肉豆蔻精油主要組成成分無影響，可用于精油提取。

表5 肉豆蔻精油成分分析Table 5 Composition analysis of nutmeg essential oil extracted

2.5.2 DSC分析

肉豆蔻精油DSC分析如圖6所示。兩種方法提取肉豆蔻精油吸熱和放熱曲線、峰型均相似，說明鹽析輔助水蒸氣蒸餾法在提取過程中未對(duì)肉豆蔻精油物理性質(zhì)造成破壞。DSC分析圖中出現(xiàn)一個(gè)主要吸熱峰，峰值約在200℃，是由于精油中醛類、酮類揮發(fā)性物質(zhì)吸熱汽化導(dǎo)致。

圖6 肉豆蔻精油DSC分析Fig.6 DSC analysis of nutmeg essential oil

2.6 抗氧化能力

2.6.1 總抗氧化能力

由圖7可知，肉豆蔻精油和VE的FRAP（鐵離子還原能力）值均隨濃度增加而提高，但VE的FRAP值高于肉豆蔻精油FRAP值，且水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油與鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油的FRAP值相近，表明不同提取方法未對(duì)肉豆蔻精油總抗氧化能力產(chǎn)生影響。當(dāng)精油濃度為0.2~0.6 mg·mL-1，隨精油濃度升高，F(xiàn)RAP值小幅上升；濃度0.6~1.0 mg·mL-1時(shí)，F(xiàn)RAP值大幅升高，而VE的FRAP值隨濃度增加始終保持大幅提高。其中水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油最大FRAP值為0.173 mmol·L-1，鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油最大FRAP值為0.175 mmol·L-1，可見，兩種方法提取肉豆蔻精油總抗氧化能力相近；而VE最大FRAP值為0.711 mmol·L-1，高于肉豆蔻精油，可見VE具有較好抗氧化性能。

圖7 肉豆蔻精油總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of nutmeg essential oil

2.6.2 DPPH自由基清除能力

由圖8可知，肉豆蔻精油對(duì)DPPH自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)。當(dāng)精油濃度為0.2~0.6 mg·mL-1時(shí)，隨精油濃度升高，DPPH自由基清除率大幅增加；精油濃度超過0.6 mg·mL-1后，即使精油濃度增加，DPPH·清除率提高不明顯；VE濃度為0.2~1.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率始終大于90%，且遠(yuǎn)高于肉豆蔻精油。其中水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油的IC50為1.03 mg·mL-1，鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油的IC50為0.97 mg·mL-1，VE的IC50為0.026 mg·mL-1，可見，水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油與鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油對(duì)DPPH·清除能力相似，表明不同提取方法對(duì)肉豆蔻精油DPPH·清除能力無影響。

圖8 肉豆蔻精油對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging ability of nutmeg essential oil

2.6.3 羥基自由基清除率

由圖9可知，隨濃度增加，肉豆蔻精油和VE對(duì)羥基自由基清除率均呈上升趨勢(shì)。濃度為0.2~1.0 mg·mL-1時(shí)，兩種方法提取肉豆蔻精油對(duì)羥基自由基清除率呈大幅增加趨勢(shì)，其中水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油的IC50為0.586 mg·mL-1，鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油的IC50為0.485 mg·mL-1，可見水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油對(duì)羥基自由基清除能力較鹽析輔助水蒸氣蒸餾法低。研究表明，酚類物質(zhì)是具有高氫/電子貢獻(xiàn)活性、抗自由基和抗氧化潛力的主要成分[28]，鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油中酚類物質(zhì)占11.56%，甲基丁香酚占10.84%；水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油中酚類物質(zhì)占8.18%，甲基丁香酚占7.9%，導(dǎo)致鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油對(duì)羥基自由基清除能力高于水蒸氣蒸餾法。而VE對(duì)羥基自由基清除率增長較緩慢，始終大于90%，IC50為0.117 mg·mL-1，遠(yuǎn)高于肉豆蔻精油對(duì)羥基自由基清除率。

圖9 肉豆蔻精油對(duì)羥基自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging ability of nutmeg essential oil

2.7 亞硝酸鹽清除率

由圖10可知，隨濃度不斷升高，肉豆蔻精油對(duì)亞硝酸鹽清除率呈增長趨勢(shì)，但水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油對(duì)亞硝酸鹽清除能力低于鹽析輔助水蒸氣蒸餾法。當(dāng)濃度為100~400 μL時(shí)，清除率緩慢增加；濃度繼續(xù)增加，清除率增長加快；當(dāng)肉豆蔻精油濃度為500 μL時(shí)，兩種方法提取肉豆蔻精油清除率分別達(dá)53.29%和68.12%。肉豆蔻精油對(duì)亞硝酸鹽清除作用與其含有萜烯類化合物有關(guān)[29]。研究表明，精油對(duì)亞硝酸鹽清除為動(dòng)態(tài)平衡過程[30]，但清除機(jī)理需進(jìn)一步研究。

圖10 肉豆蔻精油對(duì)亞硝酸鹽清除能力Fig.10 Nitrite scavenging ability of nutmeg essential oil

3 討論與結(jié)論

李榮等利用微波輔助蒸餾提取肉豆蔻精油，結(jié)果表明，當(dāng)料液比1：10，提取時(shí)間56 min時(shí)，肉豆蔻精油得率達(dá)6.94%[31]；鄭福平等采用無溶劑聚焦微波提取肉豆蔻精油，得率達(dá)8.23%[32]。本試驗(yàn)采用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油得率為13.27%，遠(yuǎn)高于微波輔助蒸餾法和無溶劑聚焦微波提取法。超臨界萃取法具有試驗(yàn)條件溫和、萃取速度快、無溶劑殘留、工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，但因成本高、設(shè)備清洗困難而限制其在工業(yè)中應(yīng)用。水蒸氣蒸餾法是一種傳統(tǒng)提取方法，操作簡單、成本較低，但提取時(shí)間過長且提取率較低。饒建平等采用NaCl溶液輔助水蒸氣蒸餾提取柚子花精油時(shí)發(fā)現(xiàn)，NaCl可有效提高精油提取率，其機(jī)理可能是NaCl不僅促進(jìn)柚子花與水的水溶作用，使其充分接觸，從而加速精油從細(xì)胞壁中滲出[33]；NaCl還可降低精油在水中溶解度，保證從柚子花中提取出來的精油不溶解在水中。潘曉梅也認(rèn)為鹽屬于強(qiáng)電解質(zhì)，在溶液中電解成離子，從而產(chǎn)生電場；在電場作用下，水分子易與鹽離子締合成分子，使精油在水中溶解度降低，提高提取率[34]。鹽析輔助水蒸氣蒸餾法操作簡單，縮短提取時(shí)間，提高提取得率，成本降低。后續(xù)試驗(yàn)可針對(duì)無機(jī)鹽提高精油得率展開研究。

與VE相比，肉豆蔻精油抗氧化能力和清除亞硝酸鹽能力較低，但隨著肉豆蔻精油濃度升高，對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和亞硝酸鹽清除率逐漸增加，也可說明肉豆蔻精油生產(chǎn)價(jià)值。后續(xù)將研究不同提取方法對(duì)肉豆蔻精油抗氧化性能和清除亞硝酸鹽能力的影響。

本試驗(yàn)利用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，最優(yōu)提取工藝為：液料比12.19：1（mL·g-1）、提取時(shí)間3.62 h、NaCl濃度2.85%，肉豆蔻精油得率為13.27%。鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提高精油得率，且對(duì)肉豆蔻精油理化性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)無影響。肉豆蔻精油對(duì)DPPH自由基、羥基自由基及亞硝酸鹽具有一定清除能力，但均低于VE。以上試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究肉豆蔻精油提供參考。