血紅栓菌對斑馬魚的毒性效應及有效成分研究

毛可紅 陳俏彪

（麗水職業(yè)技術學院，浙江 麗水 323000）

血紅栓菌[Trametes sanguinea(L.ex Fr.) Lloyd]是多孔菌科的野生高等真菌，藥食兩用，多生長于楊、柳、櫟、楓、槭、桂樹等闊葉樹枯立木、倒木、伐木樁上，分布范圍廣。據(jù)記載，血紅栓菌有清熱解毒、消炎除濕等功效，可用于治療咽喉腫痛、跌打損傷、癰疽瘡癤、風濕痹癥等癥[1]。其子實體富含三萜、多糖、甾醇等多種活性成分，其中血紅栓菌多糖對小白鼠肉瘤S-180和艾氏腹水瘤的抑制率可達90%[2]，且對食管癌、賁門癌有良好療效，另可增強機體免疫力[3]。目前，有關血紅栓菌的研究報道仍較少。

血紅栓菌菌絲體呈淡桔紅色，有些品種的子實體形狀不規(guī)則，似牛樟芝，兩者很容易混淆，甚至有商家以血紅栓菌冒充牛樟芝出售。斑馬魚與人類基因的同源性較高，其與人類的同源疾病相關基因高達84%[4]，是僅次于小鼠的第二大模型生物，因其體積小、發(fā)育快、易觀察、繁殖周期短等優(yōu)點，常被應用于藥物的安全性與毒性評價試驗[5]。

本文對血紅栓菌的主要有效成分進行檢測，并委托上海南方模式生物科技股份有限公司以斑馬魚為給藥對象，以市面上常見的3種牛樟芝為對照樣品，進行急性毒性試驗，以期為血紅栓菌資源的合理開發(fā)利用提供參考。

1 材料與設備

1.1 試驗材料

血紅栓菌子實體（特紅）由麗水職業(yè)技術學院真菌研究所提供，牛樟芝（白、黃、特白）子實體購自臺灣，均粉碎機粉碎處理備用。

野生型AB品系斑馬魚由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。

1.2 試驗試劑

無水葡萄糖標準品（天津市科密歐化學試劑有限公司）、齊墩果酸標準品（純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司）。蒽酮、乙醇、硫酸、香草醛、甲醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸銅、氫氧化鈉等均為分析純。

1.3 儀器與設備

中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）、電子天平（天津菁海儀器有限公司）、T6紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、HH-4水浴鍋（常州國華電器有限公司）、L535R臺式大容量冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機、QT-1渦旋混合器（上海琪特分析儀器有限公司）。

2 試驗方法

2.1 多糖測定[6]

（1）樣品溶液配制。精密稱取血紅栓菌子實體粉末1.00 g，用80%乙醇（料液比1∶20）在90 ℃水浴回流提取2 h，過濾，重提一次，取殘渣以80%乙醇洗滌3次后，揮干；以蒸餾水（料液比1∶20）攪拌提取2 h，過濾，重提一次，殘渣以蒸餾水清洗3次并過濾，合并濾液。在濾液中加入與其等體積的三氯甲烷∶正丁醇（5∶1）混合溶液，使用Sevag法除去蛋白，振蕩15 min后離心10 min，重復以上操作至2%硫酸銅+10%氫氧化鈉蛋白反應呈藍色（未變色），取上清液揮發(fā)有機溶劑，并以蒸餾水定容至1 000 mL，備用。

（2）蒽酮-硫酸試液配制。精密稱取0.20 g蒽酮，用100 mL的濃硫酸溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）標準曲線繪制。精密稱取葡萄糖標準品0.10 g，用蒸餾水溶解引入100 mL的容量瓶中，定容，濃度為1.0 mg/mL，備用。

分別取葡萄糖溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，于10 mL容量瓶中定容，各取2 mL于10 mL具塞試管中，另取2 mL蒸餾水于試管中做空白對照。分別加入4 mL蒽酮-硫酸試劑，混勻，置水浴鍋中煮沸10 min后，用水冷卻至室溫，以分光光度法測625 nm處吸光度。

（4）樣品測定。取2 mL樣品溶液于具塞試管中，加入4 mL的蒽酮-硫酸試劑，渦旋混勻后放入水浴鍋煮沸10 min，用水冷卻至室溫，測625 nm處吸光度。

2.2 三萜測定[6]

（1）試劑配制。硫酸溶液的配制：取28 mL蒸餾水，按照硫酸稀釋方法，加入硫酸至100 mL。香草醛溶液的制備：精密稱取8 g香草醛，用甲醇溶解定容至100 mL。

（2）樣品溶液配制。精密稱取血紅栓菌子實體粉末0.45 g，加入25 mL三氯甲烷，超聲提取60 min，冷卻至室溫后定容至25 mL，過濾。

（3）對照品標準曲線繪制。精密稱取標準品齊墩果酸10.00 mg，用三氯甲烷定容至100 mL，濃度0.1 mg/mL，為標準溶液。分別量取標準溶液0.0、0.1、0.2、0.5、0.6、0.8 mL，置于30 ℃水浴鍋中揮去有機溶劑，加入5 mL硫酸溶液和0.5 mL香草醛，混勻后60 ℃水浴加熱30 min，取出待其冷卻，于550 nm處測吸光度，繪制標準曲線。

（4）樣品測定。取樣品溶液1 mL于具塞試管中，將其置于30 ℃水浴鍋中揮發(fā)有機溶劑7～8 min，加入0.5 mL香草醛溶液和5 mL硫酸溶液，混勻后，于60 ℃水浴加熱30 min，冷卻待測。

2.3 斑馬魚急性毒性檢測試驗[7]

試驗以牛樟芝（A白、A黃、A特白）為樣品對照組，血紅栓菌（A特紅）為樣品組，同時設置斑馬魚實驗標準用水為溶劑對照組。選用2-5 dpf的野生型AB品系斑馬魚為給藥對象，分別按濃度梯度0.1 μg/mL，1 μg/mL，10 μg/mL，100 μg/mL，250 μg/mL，500 μg/mL，1 000 μg/mL，2 000 μg/mL及5 000 μg/mL進行水溶給藥，給藥方式：將子實體粉末直接溶于斑馬魚實驗標準用水。每個濃度試驗數(shù)量為20尾斑馬魚。

對斑馬魚模型評價樣品的毒性與安全性進行檢測分析，斑馬魚與人體的每千克體重的藥物劑量折算系數(shù)（W）為：1/100，斑馬魚每條平均體重為0.3 g，成人按照60 kg計算，則4種樣品理論上對人體的最大非致死劑量（MNLD）和半致死劑量（LD50）的計算方法為：人的劑量（mg/kg）=W×斑馬魚劑量。

3 結果與分析

3.1 多糖和三萜的含量

以質量濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），各濃度下線性關系為，①多糖：y=13.818x ?0.0019，R2=0.9999，線性范圍為10～50 μg/mL；②三萜：y=74.241x+0.0113，R2=0.9999，線性范圍為1.8～12.7 μg/mL。兩種成分在質量濃度范圍內(nèi)，線性關系良好，適用于定量分析。

根據(jù)回歸方程，計算得血紅栓菌中多糖含量為2.31%，三萜含量1.8%。

3.2 對斑馬魚的急性毒性濃度

4種樣品藥物在各濃度梯度下的具體試驗結果（圖1）：在0～250 μg/mL濃度范圍內(nèi)，斑馬魚無死亡現(xiàn)象；濃度為500 μg/mL，血紅栓菌（A特紅）樣品的斑馬魚死亡率為5%，與牛樟芝A黃樣品相同；濃度增至1 000 μg/mL時，A特紅樣品的死亡率為10%，低于牛樟芝A白和A黃；在500～2 000 μg/mL范圍內(nèi)，斑馬魚死亡率與樣品濃度呈劑量效應。

圖1 樣品藥物對斑馬魚死亡率的影響

根據(jù)4種樣品各濃度下的斑馬魚死亡率，得出其半致死濃度（LC50）大小關系為：A特紅（1 238 μg/mL）＞A白（1 237 μg/mL）＞A特白（1 046 μg/mL）＞A黃(655 μg/mL)。說明血紅栓菌對斑馬魚的半致死劑量較大，安全性高。

根據(jù)斑馬魚模式的評價試驗結果，血紅栓菌的安全性與牛樟芝相似（表1）。A特紅和A黃樣品對斑馬魚的最大非致死劑量MNLD均為200 mg/kg，半數(shù)致死劑量LD50均為467 mg/kg，4組樣品的斑馬魚均未觀察到相應的器官毒性。推測人體對血紅栓菌（A特紅）的最大攝入量為2.0 mg/kg，其LD50為4.67 mg/kg，與牛樟芝A黃相等。

表1 斑馬魚模式評價樣品試驗結果

4 討 論

本研究以斑馬魚模型評價血紅栓菌的急性毒性，結果表明其安全性與牛樟芝相似，對斑馬魚的無作用濃度低于250 μg/mL，最大非致死劑量MNLD為200 mg/kg，半致死劑量LD50為467 mg/kg，推測其對人體的MNLD為2.0 mg/kg，LD50為4.67 mg/kg。該結果為血紅栓菌的臨床應用提供了數(shù)據(jù)支持。另測得血紅栓菌中多糖含量為2.31%，三萜含量為1.8%，這為其有效成分的提取利用提供了依據(jù)。

當前，牛樟芝市場存在魚目混雜的情況，由于野生資源匱乏，其價格居高不下，而血紅栓菌栽培條件及成本較低，深入分析兩者的藥效成分和藥理作用[8]，并利用現(xiàn)代化手段深入研究其藥理機制與保健功效，或可提高血紅栓菌資源利用率，部分替代牛樟芝。