基于浸泡法的鮻耳石鍶標(biāo)記技術(shù)研究

郭 彪，王 碩，張博倫，劉克奉，陳 衛(wèi)，楊 健，姜 濤，曾祥茜，于 瑩

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300457，2.天津市海洋牧場技術(shù)工程中心，天津 300457，3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究員淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081）

鮻（Liza haematocheila）隸屬鯔形目（Mugiliformes），鯔科（Mugilidae），鮻屬，是亞洲地區(qū)鯔科魚類中最主要的經(jīng)濟(jì)代表種，廣泛分布與我國南海、東海、黃海和渤海。因鮻的食性為植食性或腐屑食性，主要攝食環(huán)境中的有機(jī)碎屑［1］，可起到凈化養(yǎng)殖水域的作用，對維持水域生態(tài)平衡和優(yōu)化環(huán)境具有重要作用［1］，因此鮻一直以來都是我國增殖放流的重要品種［2］。以天津市為例，2006—2018年，總計(jì)放流鮻7 347.302萬尾，是所有海洋魚類放流品種中數(shù)量最多的一個品種。全面、科學(xué)地分析評估放流取得的實(shí)際效果是保證工作有效開展的基礎(chǔ)［3］，而放流個體標(biāo)記和回捕率分析是目前放流效果評估的主要方法［4］。因此，近年來標(biāo)記技術(shù)作為近海漁業(yè)生態(tài)修復(fù)領(lǐng)域的科學(xué)問題之一被廣泛研究［5－7］。

目前，關(guān)于增殖放流魚類標(biāo)記的方法有掛牌標(biāo)記、被動整合式雷達(dá)標(biāo)、分子標(biāo)記和耳石微化學(xué)標(biāo)記等［8］。不同的標(biāo)記方法有各自的特性和適用范圍，要根據(jù)放流物種的實(shí)際情況進(jìn)行選擇［4］。國內(nèi)鮻的增殖放流一般選擇體長3～5 cm的苗種，放流數(shù)量較大、放流企業(yè)較多，且存在魚苗遺傳背景信息不清的問題。由于掛牌標(biāo)記和被動整合式雷達(dá)標(biāo)要求魚苗體長較大且適合小規(guī)模標(biāo)記［8－10］，而分子標(biāo)記需要清晰的親本遺傳信息［11］，制約了標(biāo)記技術(shù)在鮻增殖放流中的廣泛應(yīng)用，因此需要開發(fā)一種適合大規(guī)模放流小規(guī)格鮻的標(biāo)記方法。

由于耳石是一種具有新陳代謝惰性的鈣化結(jié)構(gòu)［12］，沉積在耳石中的生境元素能永久性保存，可以很好地記錄魚類生境的變遷［13］。因此，一直以來耳石微化學(xué)分析作為一種重要技術(shù)手段，用于魚類生境的重建和種群的鑒定［14－15］。隨著學(xué)者們對大規(guī)模小規(guī)格魚類標(biāo)記方法的探索，耳石鍶標(biāo)記技術(shù)逐步由標(biāo)記淡水魚類［16］向標(biāo)記海水魚類［17］發(fā)展。與淡水及河口魚類耳石Sr／Ca比值與生境中的Sr／Ca比值直接相關(guān)不同，海水中的Sr／Ca比值不是影響海水魚類耳石Sr／Ca比值的主要因素［18］，海水魚類耳石Sr／Ca比值可能受到海水環(huán)境中的Sr和Ca的相對濃度、魚類種類特性、水溫、鹽度和魚類生理狀態(tài)等多種情況的影響［19］。因此，海水中鍶濃度對海水魚類耳石Sr／Ca比值的影響，需分種類進(jìn)行區(qū)別研究。本研究擬比較不同濃度鍶浸泡下，鮻的存活率和耳石標(biāo)記效果，以探討鮻耳石鍶標(biāo)記的可行性，為大規(guī)模鮻耳石鍶標(biāo)記放流提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚的來源及暫養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用魚為河北省黃驊市宏潤水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司繁育的體長1 cm左右的幼魚。幼魚運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，在實(shí)驗(yàn)室馴化水系統(tǒng)中的3個600 L的立方養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間，每天投喂配合飼料2～3次，日補(bǔ)水量約為10%，暫養(yǎng)海水為自然海水，鹽度21～23、水溫21～22℃、pH 7.83～8.03。

1.2 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)開始前對海水中Sr2＋質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，為7.9 mg·L－1。通過向海水中添加SrCl2·6H2O將海水中Sr2＋質(zhì)量濃度分別提升至50、100、200、400 mg·L－1。其中，Sr2＋質(zhì)量濃度400 mg·L－1的海水Sr2＋濃度處于過飽和狀態(tài)，海水呈乳白色。

在50 L的實(shí)驗(yàn)水族箱中盛Sr2＋質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400 mg·L－1的海水，作為不同Sr2＋質(zhì)量濃度標(biāo)記組，分別用M50、M100、M200、M400代表50、100、200、400 mg·L－1試驗(yàn)組；同時，將無添加SrCl2·6H2O的自然海水單獨(dú)注入一個50 L的實(shí)驗(yàn)水族箱，作為對照組，用C0表示。

挑選體長1 cm左右、健康的幼魚500條，均勻分配到4個標(biāo)記組和一個對照組，開始實(shí)驗(yàn)。每隔6 h觀察一次各處理組中幼魚的存活情況。整個標(biāo)記期間不換水，每天正常投喂2～3次。標(biāo)記48 h后，分別將每個處理組中的全部幼魚單獨(dú)轉(zhuǎn)移到一個盛有自然海水600 L的立方養(yǎng)殖池（循環(huán)系統(tǒng)的一個養(yǎng)殖池）進(jìn)行后期飼養(yǎng)。待幼魚長至約10 cm左右時，每個處理組隨機(jī)挑選5尾魚進(jìn)行耳石微化學(xué)分析。后期飼養(yǎng)期間，養(yǎng)殖用水和養(yǎng)殖管理同暫養(yǎng)，每天觀察幼魚的死亡狀況，并做好記錄。

1.3 耳石檢測方法

1.3.1 耳石摘取及前處理

利用剪刀、尖頭鑷等工具將一對矢耳石取出，剔除有機(jī)質(zhì)，分別用去離子水、無水乙醇清洗，置于48孔盒中干燥備用。從一對矢耳石中隨機(jī)選取一塊用于前處理和微化學(xué)分析，前處理參照李孟孟等［20］的方法，先將耳石用Epofix環(huán)氧樹脂進(jìn)行固定包埋，38℃烘干12 h以上。然后將包埋塊用AB膠粘貼于干凈的載玻片上，凝固2 h后，使用金剛石磨輪的碾磨機(jī)（Discoplan-TS型，Struers公司）切割碾磨。粗磨階段用500目金剛砂輪碾磨至耳石微露，接著用1 200目砂紙精磨至耳石核心暴露，然后用磨拋機(jī)（Labo Pol-35，丹麥Struers公司）裝備織布機(jī)拋光盤配合拋光液拋光，至耳石表面無明顯劃痕。最后將樣品放入Milli-Q水中超聲清洗5 min后，自然條件下晾干24 h，完全干燥后，使用真空鍍膜機(jī)（JEE-420，日本電子株式會社）蒸鍍碳膜（36A，25 s）。

1.3.2 耳石的EPMA分析

耳石的EPMA分析參考楊健和劉洪波［21］、司飛等［17］的方法，利用X射線電子探針微區(qū)分析儀（JXA-8100型EPMA，日本電子株式會社）從耳石核心沿耳石最長徑至耳石邊緣呈直線進(jìn)行耳石鍶元素定量線分析。標(biāo)準(zhǔn)樣品使用碳酸鈣（CaCO3）和鈦酸鍶（SrTiO3）。定量線分析（line transect analysis）EPMA的參數(shù)設(shè)定：加速電壓為15 kV，電子束電流為2.0×10－8A；束斑直徑為3μm，每點(diǎn)駐留時間15 s；以間距10μm連續(xù)進(jìn)行打點(diǎn)測定。所有耳石線分析完后用電子束在耳石矢狀面表面掃描進(jìn)行面分析（mapping analysis）。其EPMA加速電壓和電子束電流分別為15 kV和5.0×10－7A，束斑直徑為3μm，像素為6μm×6μm，每點(diǎn)駐留時間為0.03 s。由于耳石中Sr含量遠(yuǎn)小于Ca含量，按照國際慣例將Sr／Ca比值標(biāo)準(zhǔn)化，即統(tǒng)一用Sr／Ca×103表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和Spss19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素（one-way ANOVA）進(jìn)行方差分析或χ2檢驗(yàn)，利用Excel 2010和SigmaPlot 1.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記期間與標(biāo)記后鮻存活情況

在標(biāo)記期間，各處理組均未發(fā)生鮻死亡情況；標(biāo)記后養(yǎng)殖期間，各處理組均有一定比例鮻死亡，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2值為0.984，P＞0.05；各處理組之間在標(biāo)記期間和標(biāo)記后養(yǎng)殖期間存活率均沒有顯著性差異。

2.2 不同標(biāo)記濃度鮻耳石上鍶元素的面分布

對50、100、200、400 mg·L－1浸泡組和對照組鍶元素在耳石上沉積的面分布進(jìn)行上機(jī)分析。4個標(biāo)記濃度處理組的5個樣本均出現(xiàn)明顯的“高鍶標(biāo)記環(huán)”（圖1）。

圖1 不同鍶濃度處理后鮻耳石鍶元素面分布結(jié)果Fig.1 Sr concentrations of mapping analysis in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

2.3 不同標(biāo)記濃度鮻耳石上鍶元素線性分析

通過定量線分析可知，50、100、200、400 mg·L－1浸泡組的Sr／Ca比值均在距核200μm附近出現(xiàn)增高階段（圖2）。線性分析結(jié)果表明Sr2＋質(zhì)量濃度50～400 mg·L－1，標(biāo)記時長為48 h，鮻均被成功標(biāo)記。

圖2 不同處理組鮻耳石樣品定量線分析結(jié)果Fig.2 Line transect analysis in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

將鮻耳石Sr／Ca比值的變化分成平穩(wěn)階段和顯著變化階段，并對其不同階段的數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析，分析結(jié)果見表2。4個不同標(biāo)記濃度組和對照組平穩(wěn)階段鮻耳石Sr／Ca比值未發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異（P＞0.05）。M50組和M100組鮻耳石Sr／Ca比值顯著變化階段的均值顯著低于M200組和M400組（P＜0.05），M400組鮻耳石Sr／Ca比值顯著變化階段的均值顯著高于其他3個標(biāo)記組（P＜0.05）；Sr／Ca的峰值、Sr／Ca峰值為正常均值的倍數(shù)在不同處理組間的差異規(guī)律與Sr／Ca比值顯著變化階段的差異規(guī)律均值一致。4個不同標(biāo)記濃度組鮻耳石形成的標(biāo)記環(huán)寬度值也存在顯著性差異（P＜0.05），其中M50組顯著低于M200組和M400組（P＜0.05），但M100組、M200組和M400組3個處理組鮻耳石形成的標(biāo)記環(huán)寬度沒有顯著性差異（P＞0.05）。鮻耳石Sr／Ca比值峰區(qū)均值為正常均值的倍數(shù)在4個不同標(biāo)記濃度組存在顯著性差異（P＜0.05），M400組顯著高于其他標(biāo)記組（P＜0.05），而M50組、M100組和M200組未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同處理組鮻耳石Sr／Ca比值變化Tab.2 Change of Sr／Ca ratio in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

對耳石Sr／Ca峰值、Sr／Ca顯著變化階段均值和標(biāo)記環(huán)寬度分別與海水中Sr2＋濃度進(jìn)行關(guān)系擬合，擬合結(jié)果見表3。從表3中可知，Sr／Ca峰值（即Ⅲ階段Sr／Ca比）、Sr／Ca顯著變化階段均值（即Ⅱ階段Sr／Ca比）與海水中Sr2＋濃度呈明顯的線性關(guān)系，其擬合方程的R2值分別為0.999和0.987，而標(biāo)記環(huán)寬度分別與海水中鍶離子濃度擬合的線性方程R2值為0.824，但其擬合的對數(shù)方程R2值為0.967。

表1 標(biāo)記期間與標(biāo)記后鮻的存活情況Tab.1 Survival situation of L.haematocheila during marking or after marking

表3 耳石Sr／Ca參數(shù)指標(biāo)與標(biāo)記海水Sr 2＋濃度擬合結(jié)果Tab.3 Correlation of Sr／Ca parameter index of otoliths and Sr 2＋concentration of seawater used in marking

3 討論

標(biāo)志性放流是科學(xué)區(qū)分放流群體和自然群體、準(zhǔn)確評估增殖放流效果的基礎(chǔ)［22］。由于鮻放流個體較小和遺傳背景不清晰，采用掛牌標(biāo)記、被動整合式雷達(dá)標(biāo)、分子標(biāo)記等標(biāo)記方法進(jìn)行鮻的標(biāo)記性放流，效果不是十分理想。耳石微化學(xué)標(biāo)記作為一種小規(guī)格魚類大規(guī)模標(biāo)記的理想手段，已經(jīng)在大黃魚（Larimichthyscrocea）［22］、牙鲆（Paralichthysolivaceus）［17］等海水魚中得以驗(yàn)證。本研究中4個標(biāo)記濃度處理組鮻耳石均出現(xiàn)明顯的“高鍶標(biāo)記環(huán)”的結(jié)果，說明采用耳石鍶標(biāo)記技術(shù)對小規(guī)格鮻進(jìn)行標(biāo)記是可行。在整個標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，即使是海水Sr2＋濃度處于過飽和狀態(tài)的情況下，48 h內(nèi)鮻也沒有出現(xiàn)死亡情況，標(biāo)記后的58 d養(yǎng)殖期間，標(biāo)記組鮻的存活率也與對照組基本一致。這與王臣等［23］、李秀啟等［16］、司飛等［17］和張翼等［24］報道的外源Sr濃度對大麻哈魚（Oncorhynchusketa）、鳙（Aristichthysnobilis）、牙鲆和黑鯛（Sparusmacrocephalus）幼魚未產(chǎn)生任何影響的結(jié)果一致。綜上，將耳石鍶標(biāo)記技術(shù)作為鮻小規(guī)格苗種大規(guī)模標(biāo)記的方法是可行的、安全的。

本實(shí)驗(yàn)中Sr／Ca峰值、Sr／Ca比值顯著變化階段的均值和標(biāo)記環(huán)的寬度均隨著標(biāo)記海水中Sr2＋濃度的增加逐漸增高，但3個參數(shù)指標(biāo)與海水中Sr2＋濃度進(jìn)行關(guān)系擬合結(jié)果卻有所不同。其中Sr／Ca峰值和Sr／Ca比值顯著變化階段的均值與海水中Sr2＋濃度的關(guān)系為線性關(guān)系，擬合結(jié)果說明鮻耳石中的Sr／Ca比值與水體中的Sr／Ca比值呈正相關(guān)關(guān)系，這與司飛等［17］對牙鲆的研究結(jié)果一致。而標(biāo)記環(huán)寬度與海水中Sr2＋濃度擬合的線性方程R2值為0.824，但其擬合的對數(shù)方程R2值為0.967，這表明鮻耳石高鍶標(biāo)記環(huán)的寬度與水體中Sr／Ca是呈對數(shù)關(guān)系變化的。在高鍶海水標(biāo)記下鮻耳石形成標(biāo)記環(huán)的寬度其實(shí)與鍶元素在魚類耳石沉積的時滯特征有關(guān)［25－26］，考慮到本實(shí)驗(yàn)期間鮻僅在標(biāo)記期間海水Sr2＋濃度不同，因此本實(shí)驗(yàn)不同處理組之間標(biāo)記環(huán)寬度的差異只可能與標(biāo)記濃度、鮻耳石的生長規(guī)律有關(guān)。鮻耳石隨個體發(fā)育生長而增大，二者呈冪函數(shù)關(guān)系，冪指數(shù)小于1，耳石初期增長率較大，后期漸緩［27］。而魚類在不同Sr2＋濃度標(biāo)記后，其耳石Sr／Ca恢復(fù)到正常水平所需時間的比較性研究尚未見報道。筆者推測，隨著標(biāo)記采用的Sr2＋濃度升高，高濃度Sr2＋在鮻耳石沉積的時滯越長，這些高濃度Sr2＋隨著鮻的生長逐漸沉積，最終恢復(fù)到正常的耳石Sr／Ca水平［26，28］；但是這需要進(jìn)一步深入研究加以證實(shí)。

關(guān)于海水魚耳石微化學(xué)鍶標(biāo)記過程中采用的標(biāo)記海水Sr2＋濃度的報道不多。大黃魚在12 mg·L－1Sr2＋的海水中浸泡7 d，其耳石出現(xiàn)明顯的鍶元素指紋標(biāo)記［22］。司飛等［17］在對牙鲆進(jìn)行72 h耳石微化學(xué)鍶標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Sr2＋質(zhì)量濃度為9.19 mg·L－1的海水未能成功標(biāo)記，Sr2＋質(zhì)量濃度為11.16 mg·L－1的海水僅對部分樣品成功標(biāo)記，而Sr2＋質(zhì)量濃度為19.06 mg·L－1的海水成功標(biāo)記了所有樣品。由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最低標(biāo)記濃度為50 mg·L－1Sr2＋，添加的鍶元素遠(yuǎn)比文獻(xiàn)中報道的添加濃度高，這也是本實(shí)驗(yàn)中所有標(biāo)記組樣品均出現(xiàn)明顯“高鍶標(biāo)記環(huán)”的原因。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，50 mg·L－1Sr2＋的標(biāo)記濃度完全可以實(shí)現(xiàn)小規(guī)格鮻苗種大規(guī)模標(biāo)記的需求。

雖然魚類耳石中形成的鍶標(biāo)記穩(wěn)定性強(qiáng)［17］且該方法非常適合于小規(guī)格苗種大規(guī)模標(biāo)記，但是隨著魚類個體生長，其耳石逐漸變大，面分析檢測比例尺變小，鍶標(biāo)記變細(xì)、模糊。為保持標(biāo)記分析結(jié)果的清晰，放流評估回捕魚類的面分析監(jiān)測比例尺必須增大，尤其是標(biāo)記環(huán)所處位置部分。本研究結(jié)果顯示，1 cm鮻標(biāo)記環(huán)出現(xiàn)的位置在距核200μm附近。因此，對回捕鮻進(jìn)行面分析時，建議在距核100～300μm處加大面分析比例尺，以便準(zhǔn)確分析回捕鮻是否是標(biāo)記魚類。