超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合分散固相萃取技術(shù)快速測(cè)定化妝品中36種抗感染類藥物殘留

王慶齡，裘鈞陶，詹越城，葉磊海，仰海清，何 斌，盛麗娜

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州310009；2.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州310009）

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的提高，人們對(duì)護(hù)膚也越來越重視。化妝品能夠有效改善人們的生活質(zhì)量，而人們也越來越認(rèn)識(shí)和關(guān)注化妝品的功效和安全性問題。消費(fèi)者希望化妝品在有足夠功效性的同時(shí)也能兼顧產(chǎn)品的安全性?；瘖y品公司為了迎合消費(fèi)者對(duì)功效的追求，會(huì)人為添加禁用或者限用成分，尤其是有功效成分的藥物，比如在祛斑美白的化妝品中添加汞試劑制品、在抗衰老化妝品中添加禁用的激素類藥品、在染發(fā)劑中加入化學(xué)試劑醋酸鉛等[1-3]。

抗感染藥物屬于處方藥，因具有殺菌抑菌的功效，因此會(huì)被違法添加到化妝品中，人體在使用時(shí)如果涂抹于面部、口唇等比較柔嫩且膜血管豐富的部位，會(huì)通過微血管和黏膜被人體快速吸收，從而破壞皮膚表面的正常菌群，最終導(dǎo)致皮膚發(fā)生皮疹發(fā)炎、過敏等不良反應(yīng)。長(zhǎng)期使用后更加會(huì)導(dǎo)致耐藥性，后續(xù)治療更加困難?？垢腥绢愃幬镆话惆股?、磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類等，但現(xiàn)行的相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)僅能檢測(cè)其中的幾項(xiàng)，不能同時(shí)進(jìn)行分析。目前，化妝品中抗感染類藥物檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。由于抗感染類藥物種類繁多，而文獻(xiàn)報(bào)道中的檢測(cè)方法多為檢查某一類抗感染藥物，錢葉飛等人[4]運(yùn)用HPLC-DAD法測(cè)定化妝品中非法添加的21種磺胺類抗生素；陳靜等人[5]通過超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中的19種喹諾酮類抗生素；趙曉亞等人[6]運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)化妝品中9種四環(huán)素類藥物同時(shí)測(cè)定。對(duì)非法添加抗感染類藥物的檢測(cè)難點(diǎn)在于非法添加的藥物種類具有不確定性，需要盡可能全面覆蓋種類進(jìn)行篩查，如何有效去除雜質(zhì)而提高目標(biāo)物的效應(yīng)也成為研究的重點(diǎn)。對(duì)樣品前處理效果影響最大的就是凈化手段，化妝品含有大量的脂類和表面活性劑等雜質(zhì)，因此如何有效去除雜質(zhì)而不影響目標(biāo)物的定性定量是評(píng)價(jià)所建立方法的重要因素。固相萃取技術(shù)是最常用的手段，一般包括極性萃取、離子交換萃取、共價(jià)萃取、高級(jí)聚合物萃取和專用固定相萃取等[7-8]。因此，旨在建立分散固相萃取法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定多種化妝品基質(zhì)中可能添加的多種類型的抗感染藥物。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與耗材

Agilent 1260 Series型超高效液相色譜儀（USA）；Agilent 6470型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（USA）；N-EVAPA 111型氮吹儀，美國(guó)Organomation associates公司產(chǎn)品；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；Milli-Q型純水儀，美國(guó)Millpore公司產(chǎn)品；GX-274ASPEC型多通道固相萃取系統(tǒng)，美國(guó)Gilson公司產(chǎn)品。

甲醇、丙酮、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲苯（色譜純），美國(guó)Tedia公司提供；甲酸（優(yōu)級(jí)純），上海安譜科科學(xué)儀器有限公司提供；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂（分析純）、十八彎基鍵合硅膠吸附劑（C18）、弗洛里硅藻土、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA），杭州化學(xué)試劑有限公司提供；甲硝唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、依諾沙星等36種抗感染類物質(zhì)（含量≥95%）（具體物質(zhì)見表2，表4），Dr.Ehrenstorfer公司提供。除非另有要求，所有試劑均為分析純，所用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別精確稱取除氯霉素外其他待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg（精確至0.01 mg）置于100 mL棕色容量瓶中，氯霉素稱取10 mg（精確至0.01 mg）置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解（溶解性差的物質(zhì)可加入少量甲酸或水促溶）后，定容至刻度，混勻，即得質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL（氯霉素質(zhì)量濃度為1 000.0 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20℃冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取化妝品樣品0.2 g（精確到0.000 1 g）于15 mL的塑料離心管中，加入150 mg凈化粉末（含有NaCl，C18和MgSO4）和含0.5%甲酸的乙腈溶液10.00 mL，渦旋30 s，渦旋混合搖勻，超聲提取30 min后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取上清液置于新離心管中，重復(fù)提取1次，合并上清液。

1.2.2 樣品濃縮凈化

取上述離心后上清液，40℃水浴下氮吹至干，再加入2.00 mL的50%甲醇水復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜過濾后上機(jī)待測(cè)分析。

1.2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜、質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent SB-C18型柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，USA），柱溫35℃，進(jìn)樣體積2 μL，流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水，流動(dòng)相B：乙腈。

梯度洗脫程序見表1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），掃描方式：正/負(fù)離子，檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式采集，檢測(cè)器：Agilent 6470型三重四極桿質(zhì)譜儀配有ESI離子源。

36種抗感染類藥物殘留的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2。

表2 36種抗感染類藥物殘留的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

為了提高化妝品中目標(biāo)物的提取率，根據(jù)抗感染類藥物的分子性質(zhì)，并總結(jié)文獻(xiàn)資料中使用過的提取劑，分別以乙腈、0.5%酸化乙腈、乙酸乙酯和甲醇作為樣品提取溶劑。

不同提取液測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同提取液測(cè)定結(jié)果/mg·kg-1

由表3可知，當(dāng)用乙腈提取目標(biāo)物時(shí)，其極性較大并且分子較小，因此提取能力較強(qiáng)，能夠?qū)⑷鯓O性物質(zhì)也提取出來，試驗(yàn)研究的抗感染類藥物物質(zhì)也能大部分被提取出來，所以可采用。0.5%酸化乙腈提取能力比乙腈較強(qiáng)，酸化過的乙腈能夠更加親和個(gè)別弱酸性的物質(zhì)，研究涉及的抗感染類藥物一般為酸性或弱酸性，提取率比乙腈更高。而乙酸乙酯非極性較大，可以溶解大多數(shù)抗感染類藥物，同時(shí)能提取化妝品中的大部分油脂類，雜質(zhì)成分太多影響準(zhǔn)確定量。甲醇提取效果跟乙腈相比，因?yàn)槠淠軌蚺c水相溶，對(duì)一些水溶性的雜質(zhì)和表面活性劑也會(huì)被提取。綜合考慮到對(duì)目標(biāo)物的溶解性和較高提取效率，選用酸化的乙腈溶液作為提取液。

2.2 分散固相萃取技術(shù)（dSPE）凈化

由于化妝品種類繁多，大部分含有大量化工原料或者天然有機(jī)物質(zhì)，成分復(fù)雜，因此如何有效去除這些雜質(zhì)而不影響目標(biāo)物的定性定量是研究的主要目的。在化妝品中多種藥物篩查前處理中常用凈化手段主要有固相萃?。⊿PE）和分散固相萃?。╠-SPE）。王夢(mèng)穎等人[9]使用Oasis PriME HLB固相萃取柱測(cè)定乳液類化妝品中的9種抗過敏違禁藥物殘留時(shí)，部分目標(biāo)物回收率不超過70%，方法適應(yīng)性不佳。王燕芹等人[10]使用Plexa PCX固相萃取柱結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定化妝品中9種抗過敏藥物殘留，其樣品比較單一，所測(cè)藥物種類單一，使其很難成為一個(gè)通用的多種藥物檢測(cè)方法。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，對(duì)檢測(cè)通量的要求越來越大，d-SPE作為簡(jiǎn)單便捷的凈化方式被廣泛應(yīng)用于各種檢測(cè)研究中[11-14]，傳統(tǒng)的d-SPE吸附材料有N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳（GCB）、多壁碳納米管（MWCNTS）和十八烷基鍵合硅膠（C18）等，C18和PSA能有效去除基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖類和脂肪，GCB和MWCNTS能吸附大部分色素。鑒于化妝品中雜質(zhì)類型，考查幾種特異性小柱，包括NH2柱、C18柱、非多孔性炭黑小柱、硅膠柱、佛羅里硅藻土小柱、PSA粉末和分散固相萃取粉末，優(yōu)化最佳凈化方案。

2.2.1 凈化方式的選擇

根據(jù)固相萃取柱所含有不同填料性質(zhì)及參考部分文獻(xiàn)，分別比較目前常用的不同填料的Sep-Park-C18，Sep-Park-Silica，Sep-Park-Florsi，Envi-Carb/GCNH2固相萃取柱，AOAC級(jí)別的PSA粉末和自制的凈化粉末，通過試驗(yàn)，對(duì)空白樣品加標(biāo)（5.00 μg/kg）進(jìn)行凈化。

不同凈化方式對(duì)回收率的影響見圖1。

圖1 不同凈化方式對(duì)回收率的影響

由圖1可知，自制分散固相萃取凈化粉末的回收率最高。由于SPE小柱填料的選擇性，同時(shí)能夠檢測(cè)的藥物種類太少，而繁瑣的操作步驟使得SPE小柱法前處理耗時(shí)較長(zhǎng)，柱子篩板容易堵，很難作為一個(gè)通用的高通量多殘留篩查檢測(cè)的樣品前處理方法。分散固相萃取經(jīng)常作為最簡(jiǎn)單便捷的凈化方式被廣泛應(yīng)用于各類目標(biāo)物的檢測(cè)中，傳統(tǒng)的d-SPE能夠去除各種基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖類、脂類、固醇和色素等雜質(zhì)?？赡?6種抗感染類藥物種類比較復(fù)雜，其他5種柱子只能對(duì)某一種或者幾種物質(zhì)有保留，容易造成其余目標(biāo)物的損失甚至直接丟失，而自制粉末凈化屬于一種固液分配凈化，只是吸附部分雜質(zhì)，如脂質(zhì)，對(duì)目標(biāo)物的吸附能力不強(qiáng)，反而能保留大部分物質(zhì)，因此回收率比較高。

2.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中普遍存在基質(zhì)效應(yīng)，化妝品樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有脂類和表面活性劑，因此基質(zhì)效應(yīng)也很嚴(yán)重。在最終優(yōu)化后的試驗(yàn)條件下，空白樣品經(jīng)過處理吹干后，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。與相應(yīng)質(zhì)量濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液比較后發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應(yīng)明顯，因此準(zhǔn)備定量時(shí)采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 線性關(guān)系和檢出限的考查

在所確定的試驗(yàn)條件、色譜和質(zhì)譜條件下，對(duì)36種抗感染類藥物進(jìn)行測(cè)定，用空白基質(zhì)配置一系列質(zhì)量濃度范圍為4.00~100.00 ng/mL，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。

36種抗感染藥物的線性方程與線性范圍與檢出限見表4。

表4 36種抗感染藥物的線性方程與線性范圍與檢出限

2.3 方法回收率和精密度驗(yàn)證

續(xù)表4

按液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法操作，實(shí)驗(yàn)室對(duì)陰性樣品分別進(jìn)行3次平行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

36種抗感染藥物的加標(biāo)回收見表5。

由表5可知，樣品平均回收率為70.0%~120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)，說明該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了化妝品中36種抗感染類藥物殘留含量的檢測(cè)方法，36種藥物均在除氯霉素外（氯霉素線性范圍10.00~1 000.00 ng/mL，檢出限為0.50 μg/g，加標(biāo)量在1.00~10.00 μg/g內(nèi)的乳液樣品回收率均在85%~110%）線性范圍4.00~100.00 ng/mL內(nèi)檢出限為0.20 μg/g，加標(biāo)量在0.50~2.50 μg/g內(nèi)的乳液樣品回收率均在85%~110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。因此，該方法能高效快速地用于化妝品中36種抗感染類藥物殘留含量的測(cè)定。