我國部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒遺傳變異分析

梁俊超，劉曉東，袁 飛，李 坤，劉紅祥，馬振乾，胡繼明，劉 東*，于 錄(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 13006; .動物基因工程疫苗國家重點實驗室/青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 66000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種急性、高度接觸性傳染病，該病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，臨床發(fā)病主要以繁殖障礙及呼吸道癥狀為主，多表現(xiàn)為公豬精液質(zhì)量差，母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及產(chǎn)后發(fā)情不規(guī)則，商品豬高燒、呼吸障礙且死淘率高[1-3]。

1987年，美國首次報道發(fā)現(xiàn)PRRS[4]，1996年我國首次報道從疑似病例中分離得到PRRSV[5]，從而也證實PRRS已傳入我國。2006年后，我國出現(xiàn)高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)，該類毒株毒力增強，造成養(yǎng)豬業(yè)重大死傷，導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟損失[6]。2010年，廣東某豬場仔豬血清中分離得到GM2毒株，GM2毒株以QYYZ毒株和MLV毒株為親本，但在豬體內(nèi)的復(fù)制能力高于親本，致病性相對更高[7]。2013年我國已有報道豬群因感染NADC 30-like毒株導(dǎo)致重胎期母豬大面積流產(chǎn)[8]。2014年后，NADC30-like毒株臨床檢出率逐年升高，國內(nèi)流行態(tài)勢加劇，且在某些區(qū)域成為優(yōu)勢毒株[9]。目前，國內(nèi)田間流行藍(lán)耳野毒毒株愈加復(fù)雜多樣，這也為我國藍(lán)耳病防控帶來全新挑戰(zhàn)。

GP5蛋白是由PRRSV的ORF5基因編碼的高度糖基化的囊膜蛋白，PRRSV的主要中和位點位于GP5蛋白[10]。GP5蛋白是PRRSV中變異程度最大的結(jié)構(gòu)蛋白之一，通常作為 PRRSV變異的主要依據(jù)之一，而GP5基因序列的變化可在一定程度反映藍(lán)耳流行毒株的遺傳變異情況[11]。因基因組差異，PRRSV被分為歐洲型(基因Ⅰ型，代表毒株LV株)和北美型(基因Ⅱ型，代表毒株VR-2332株)?；谌騊RRSV分類系統(tǒng)和GenBank中的ORF5序列信息，我國普遍存在的北美型(基因Ⅱ型)PRRSV毒株被分為四大譜系：譜系1，譜系3，譜系5和譜系8，譜系1代表毒株為NADC30和MN184，譜系3代表毒株為GM2，譜系5代表毒株為經(jīng)典毒株VR2332和MLV，而譜系8又被細(xì)分為5個亞群，亞群Ⅰ代表毒株為經(jīng)典毒株CH-1a，亞群Ⅱ為經(jīng)典和HP-PRRSV的中間亞群，代表毒株為BJ0706，亞群Ⅲ-Ⅴ為HP-PRRSV及其衍生株，代表毒株為JXA1、TJ和HuN4[12]。

對2019年我國8省46份PRRSV陽性樣品中PRRSV毒株進(jìn)行ORF5基因測序，并比對分析PRRSV遺傳進(jìn)化，為以后PRRS的流行趨勢及防控提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病毒樣品

2019年從我國8個省(包括山東、江蘇、安徽、寧夏、遼寧、云南等)采集的疑似 PRRSV感染的臨床樣品按照文獻(xiàn)[13]介紹的RT-PCR方法進(jìn)行檢測。利用病毒RNA提取試劑盒(TAKARA公司)提取總RNA，并用RT試劑盒(羅氏公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

利用ORF5基因引物(上游：CATTTCATGACACCTGAGACCA；下游：AGAGCATATATCATCACTGGCG)通過PCR進(jìn)行擴增。擴增條件如下：94 ℃變性2 min后進(jìn)入循環(huán)：94 ℃15 s，54 ℃30 s，68 ℃1 min，32個循環(huán)后，68 ℃10 min。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購于TAKARA公司；高保真反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于羅氏公司；LATaq DNA聚合酶購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 PRRSV GP5測序

將RT-PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 分子進(jìn)化分析

通過序列分析軟件DNAstar Lasergene對所選毒株的ORF5基因進(jìn)行序列同源性的比對分析，利用MEGA6軟件對所測ORF5序列制作進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測及測序結(jié)果

對送檢樣品的ORF5基因進(jìn)行 RT-PCR檢測，目的條帶大小為603 bp，出現(xiàn)目的條帶表明所檢樣品PRRSV為陽性(圖1)。從8省送檢的PRRSV抗原陽性樣品中，隨機挑選46份PRRSV的PCR產(chǎn)物進(jìn)行ORF5基因測序，經(jīng)比對后確認(rèn)得到46個PRRSVORF5基因序列，各省PRRSV樣品測序數(shù)量詳見表1。

圖1 PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果Fig. 1 Results of PRRSV RT-PCR detection

表1 PRRSV送檢測序數(shù)量及區(qū)域分布Table 1 The number and regional distribution of PRRSV submitted for sequencing

2.2 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性比對及進(jìn)化分析

樣品序列結(jié)果按照“送檢年月-樣品編號-送檢省份縮寫”進(jìn)行編號。46份樣品的PRRSVORF5基因擴增產(chǎn)物經(jīng)測序所得46個603 bp的ORF5基因序列，與譜系1、3、5和8的標(biāo)準(zhǔn)毒株通過DNAstar和MEGA6軟件進(jìn)行比對，與標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性比對結(jié)果見表2。46個PRRSVORF5序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株的進(jìn)化樹見圖2。由表3可見，8個省46個測序樣品的PRRSV分布在譜系1、譜系3和譜系8中，其中譜系1有19個，譜系3僅2個，譜系8有25個且全屬于亞群Ⅲ-Ⅴ。山東1～6月份譜系1中樣品PRRSV僅2個，而7～12月份為10個，NADC 30-like毒株檢出量明顯增多，而譜系8中樣品在1～6月份和7～12月份檢出量無明顯差異。

表2 46個PRRSV ORF5基因序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性對比Table 2 The homology of 46 PRRSV ORF5 gene sequences compared with the standard strains

表3 46個PRRSV ORF5基因序列譜系及區(qū)域分布Table 3 Lineage and regional distribution of 46 PRRSV ORF5 gene sequences

圖2 46個PRRSV ORF5基因序列進(jìn)化樹分析Fig. 2 Evolutionary tree analysis of 46 PRRSV ORF5 gene sequences

2.3 PRRSV GP5蛋白氨基酸變異分析

46個PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列主要以點突變?yōu)橹鳎匆姴迦胪蛔?，氨基酸同源性分析結(jié)果見圖3。美洲型PRRSV毒株GP5蛋白有2個重要的表位結(jié)構(gòu)，分別是誘餌表位(27～30 aa)和中和表位(37～45 aa)，其中誘餌表位是非中和表位[14-16]。在誘餌表位區(qū)域，譜系1中14個樣品PRRSV在第27位氨基酸發(fā)生變異V27A，2個樣品PRRSV在第28位氨基酸發(fā)生變異L28P和L28F，4個樣品PRRSV在第30位氨基酸發(fā)生變異N30S，3個樣品PRRSV在第29和30位氨基酸發(fā)生變異V29A和N30G；譜系3中2個樣品PRRSV在第27和30位氨基酸發(fā)生變異V27A和N30S；譜系8中2個樣品PRRSV在第30位氨基酸發(fā)生變異N30D。

圖3 46個PRRSV GP5蛋白氨基酸同源性分析Fig. 3 Amino acid homology analysis of 46 PRRSV GP5 proteins

在中和表位區(qū)域，譜系1中19個樣品PRRSV在第39位氨基酸均發(fā)生變異I39L，其中201912-587-SD毒株在38位氨基酸還發(fā)生變異H38N，譜系3中2個樣品PRRSV均在第38和39位氨基酸發(fā)生變異H38Y和I39S，而譜系8中，201911-514-AH在第41位氨基酸發(fā)生變異L41S。

GP5具有多個糖基化位點，N32或N33或N34位于膜外結(jié)構(gòu)域的高變區(qū)且只存在于部分毒株中，此外，N44和N51也是糖基化位點[17]。46個PRRSV的GP5蛋白的N-糖基化位點N44N51未發(fā)生變化，而不同PRRSV的N-糖基化位點N33N34發(fā)生明顯變異。譜系1代表毒株NADC 30為N32N34，MN184B為N34，19個樣品PRRSV中，8個PRRSV為N32，2個為N33N34，2個為N34，1個為N32N34，2個為N32N33，3個為N33，而21912-586-HB無N33N34；譜系3中代表毒株GM2和2個樣品PRRSV均為N32N34；譜系8中代表毒株JXA1、HuN4和TJ均為N33N34N35，25個樣品毒株中，20個為N33N34N35，2個為N35，2個為N32N34，1個為N34N35。

3 討 論

PRRSV是我國養(yǎng)豬業(yè)重要防控疾病之一，由于PRRSV基因組易變異，導(dǎo)致新基因型毒株不斷出現(xiàn)。隨著田間流行野毒毒株多樣化，疫苗毒株與野毒毒株同源性差異加大，而野毒毒株抗原表位及中和表位出現(xiàn)突變，最終將導(dǎo)致目前商品化PRRS疫苗免疫效果受限[18-20]。

8省共46個樣品PRRSVORF5基因送經(jīng)測序可知，山東、遼寧、河北的樣品PRRSV分布在譜系1和譜系8中，安徽的樣品PRRSV分布在譜系1、3和8中，江蘇、寧夏、云南的樣品PRRSV分布在譜系8中，且均為HP-PRRSV，吉林僅測一個且在譜系1中，譜系1中樣品PRRSV共19個，譜系8中樣品PRRSV共25個，該結(jié)果表明國內(nèi)HP-PRRSV雖仍占一定優(yōu)勢，但NADC 30-like毒株流行已明顯加劇。

山東送檢測序共19個品PRRSV，其中12個屬于譜系1，7個屬于譜系8，且在7～12月份NADC 30-like毒株檢出明顯高于1～6月份，該結(jié)果表明山東NADC 30-like毒株流行相比HP-PRRSV呈現(xiàn)加劇趨勢，且下半年流行態(tài)勢高于上半年。

46個樣品毒株與經(jīng)典PRRS疫苗毒株如VR2332、MLV及CH-1R同源性相對較遠(yuǎn)，理論上PRRSV同源性高低影響PRRS疫苗毒株的田間保護(hù)效果[21]。GP5蛋白誘餌表位相對于中和表位是優(yōu)勢表位，會優(yōu)先被機體識別，對中和表位有屏蔽作用，導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生延遲，有利于PRRSV逃避機體免疫清除而大量增殖[22]。46個樣品PRRSV中共有17個PRRSV誘餌表位發(fā)生變異，氨基酸變異位點分別為V27A、L28P、L28F、V29A、N30S、N30G和N30D，誘餌表位變異可能有利于病毒免疫逃避。GP5蛋白中和表位能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，而該蛋白免疫識別位點的變異可影響中和抗體效果及疫苗的交叉保護(hù)率[10，23]，46個樣品PRRSV中22個PRRSV的中和表位發(fā)生變異，氨基酸變異位點分別為H38N、H38Y、I39L、I39S和L41S，22個樣品分別屬于譜系1、3和8。現(xiàn)在國內(nèi)流行的NADC-like毒株、GM2-like毒株及HP-PRRSV毒株的中和表位確存在變異而且變異位點存在差異，這可能導(dǎo)致疫苗對田間不同流行野毒毒株的交叉保護(hù)力下降。

糖基化屏蔽是PRRSV一種免疫逃避機制，可避免被機體內(nèi)中和抗體清除，而GP5膜外區(qū)多糖位點缺失能夠提高抗體的中和能力和其附近中和表位的免疫原性[17，24]。46個樣品PRRSV的N-糖基化位點N44N51均未發(fā)生變化，而N33N34發(fā)生不同變異，其中8個樣品PRRSV為N32，2個為N33N34，2個為N34，5個為N32N34，2個為N32N33，3個為N33，20個為N33N34N35，2個為N35，1個為N34N35，1個為N33N34。20個樣品PRRSV為HP-PRRSV，且多糖位點增加，這可能降低高中和表位免疫原性及抗體中和能力；14個樣品PRRSV為NADC30-like PRRSV，且多糖位點減少，這可能提高高中和表位免疫原性及抗體中和能力。

4 結(jié) 論

通過以上研究可知，我國現(xiàn)階段流行的藍(lán)耳毒株呈現(xiàn)多樣化、復(fù)雜化，不同譜系毒株間誘餌表位、中和表位及糖基化位點均存在一定的差異，從而疫苗與野毒交叉保護(hù)力受限，最終導(dǎo)致單純依賴疫苗免疫防控難度加大。結(jié)合臨床，藍(lán)耳病更需綜合防控，首先要重視和提升豬場生物安全及飼養(yǎng)管理水平，然后了解豬場自身PRRSV感染實際情況，選擇與豬場PRRSV同源性近、安全性高且免疫原性好的疫苗進(jìn)行免疫，綜合防控才能有效防控藍(lán)耳病。