銀杏紅曲維生素組方調(diào)脂有效性與安全性研究

劉瑩?彭隆?胡成

【摘要】目的 探討銀杏紅曲維生素組方（MGM）對(duì)混合型高脂血癥大鼠血脂水平的影響及其急性毒性。方法 采用混合型高脂血癥SD大鼠模型，灌胃給予25 mg/kg、50 mg/kg劑量的MGM和陽(yáng)性對(duì)照品32 d后，評(píng)價(jià)MGM的調(diào)脂效果。采用最大耐受劑量法評(píng)價(jià)23.2 g/（kg·d）的MGM單次給藥72 h后對(duì)BALB/c小鼠與SD大鼠2種嚙齒類動(dòng)物的急性毒性。結(jié)果 MGM及陽(yáng)性對(duì)照品給藥32 d后較給藥前顯著降低高脂血癥大鼠總膽固醇、甘油三酯和LDL-C的含量（P均< 0.001），其中25 mg/kg的MGM的調(diào)脂效果與50 mg/kg劑量的陽(yáng)性對(duì)照品相當(dāng)，表明MGM的復(fù)方優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照品的調(diào)脂效果。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MGM對(duì)大、小鼠的最大耐受劑量為23.2 g/（kg·d），相當(dāng)于人體推薦口服劑量的1933倍，在該劑量下觀察小鼠與大鼠心臟、肝臟、腎臟的病理切片結(jié)果未發(fā)現(xiàn)損傷性病變。結(jié)論 MGM顯著降低高脂血癥大鼠的血脂水平，在推薦量范圍內(nèi)服用MGM安全可靠。

【關(guān)鍵詞】銀杏葉提取物;紅曲提取物;葉酸;維生素B6;急性毒性

Hypolipidemic efficacy and safety of Ginkgo biloba leaf and Monascus extracts combined with vitamin mixture Liu Ying， Peng Long， Hu Cheng. Department of Infectious Disease， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China Corresponding author， Hu Cheng， E-mail： hucheng2@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the hypolipidemic efficacy and acute toxicity of Ginkgo biloba leaf and Monascus extracts combined with folic acid and vitamin B6 （MGM） in SD rats with mixed hyperlipidemia. Methods The SD rat models with mixed hyperlipidemia were orally given with 25 mg/kg， 50 mg/kg of MGM and positive control substance for 32 d to explore the efficacy of MGM on the blood lipid level. The acute toxicity at 72 d after single administration of 23.2 g/（kg·d） MGM in BALB/c mice and SD rats was assessed by the maximum tolerated dose method. Results In the MGM and positive control substance groups， the contents of total cholesterol （TC）， triglycerides （TG） and low density lipoprotein-cholesterol （LDL-C） at 32 d after administration were significantly lower compared with those before administration （all P < 0.001）， and the lipid-lowering effect of MGM at a dose of 25 mg/kg was equivalent to that of the positive control substance at 50 mg/kg. Acute toxicity test showed that the maximum tolerated dose of MGM for the rats and mice was 23.2 g/（kg·d）， 1933 times of the recommended human oral dose. After administration at this dose， no pathological changes were observed in the tissues sections of heart， liver and kidney. Conclusion MGM can significantly reduce the blood lipid level in rat models with mixed hyperlipidemia， which is safe and reliable when administered within the recommended range of dose.

【Key words】Ginkgo biloba leaf extract;Monascus extract;Folic acid;Vitamin B6;Acute toxicity

血脂異常升高是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生的主要元兇。在伴有高血壓、年齡超過(guò)40歲、糖尿病等危險(xiǎn)因素存在的情況下，血脂的正常值需向下作顯著的調(diào)整，以降低共患病風(fēng)險(xiǎn)而防止心腦血管疾病的發(fā)生[1]。2019年一項(xiàng)中國(guó)人群隊(duì)列研究結(jié)果顯示HDL-C < 1.3 mmol/L時(shí)缺血性和出血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均明顯增加。因此，控制血脂對(duì)健康狀況的維持亞健康的預(yù)防和疾病狀態(tài)的治療具有十分重要的意義。近30年來(lái)，中國(guó)人群的血脂水平逐步升高，血脂異?；疾÷拭黠@增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年中國(guó)成人血脂異?？傮w患病率高達(dá)40.4%，血清膽固醇水平的升高將導(dǎo)致2010至2030年我國(guó)心血管病事件約增加920萬(wàn)[2]。血脂異常的主要危害是增加動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┘奥阅I臟病并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性心臟病的發(fā)病危險(xiǎn)，是威脅我國(guó)人民身體健康的重要危險(xiǎn)因素[3]。

高脂血癥治療常用他汀類藥物，但其不良反應(yīng)也不容忽視，比如肝損、肌溶解、血糖升高、停藥后快速反彈[4]。這些不良反應(yīng)阻礙了部分患者使用他汀類藥物的依從性，同時(shí)也讓血脂升高的亞健康人群將其拒之門(mén)外。因此，研發(fā)天然全植物成分或藥食同源配方的調(diào)脂保健產(chǎn)品具有巨大的社會(huì)需求。本研究探討了一種藥食同源銀杏紅曲維生素組方（MGM）對(duì)混合型高脂血癥大鼠調(diào)脂的有效性，同時(shí)在正常大、小鼠上進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察其安全性。

材料與方法

一、試劑

MGM由銀杏葉提取物、紅曲提取物、葉酸和維生素B6的混合物經(jīng)制粒、過(guò)篩為棕紅色粉末狀，使用時(shí)用無(wú)菌水配置，由廣州市賽普特醫(yī)藥科技股份有限公司提供。陽(yáng)性對(duì)照品是依據(jù)南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司申請(qǐng)的《預(yù)防或治療心腦血管疾病的紅曲、銀杏葉組合物及其應(yīng)用（專利號(hào)：CN200510041265.7）》發(fā)明專利組方而設(shè)定，以銀杏葉提取物和紅曲粉碎后過(guò)60目篩后按1∶1的質(zhì)量比混合而成。銀杏葉提取物購(gòu)自浙江康恩貝制藥股份有限公司;紅曲提取物購(gòu)自杭州雙馬球生物股份有限公司;葉酸、維生素B6購(gòu)自江西天新藥業(yè)股份有限公司。

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、HDL-C試劑盒均購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司;中性樹(shù)膠（中國(guó)上海標(biāo)本模型廠），HE染色液（無(wú)錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司）。

二、儀器

BS-3000A電子分析天平（上海友聲衡器有限公司），5418臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF），7020型全自動(dòng)生化儀（日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)），JJ2000電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），BSA224S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。ECLIPSE Ci-S正置顯微鏡（尼康公司），DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

三、MGM對(duì)混合型高脂血癥大鼠調(diào)脂功效評(píng)價(jià)方法

健康雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量220.3 ～ 261.9 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

第1次分組：大鼠檢疫期結(jié)束后，按照動(dòng)物體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只，高脂飼料（HFC）模型組（模型組） 40只。 正常對(duì)照組給予維持飼料，模型組給予HFC，持續(xù)2周（給藥前）。HFC是在維持飼料中添加20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣和石粉等。所有飼料均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

第2次分組：HFC喂養(yǎng)2周后，動(dòng)物不禁食，使用異氟烷吸入麻醉后，眼眶靜脈竇采血，3000 轉(zhuǎn)/分離心10 min，分離血清，使用7020型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。模型組淘汰血清TC含量較低的10只動(dòng)物，根據(jù)動(dòng)物血清TC水平將模型組剩余動(dòng)物隨機(jī)分為3組。MGM的人體推薦口服劑量為0.012 g/（kg·d），實(shí)驗(yàn)設(shè)約人體推薦劑量的2倍和4倍為MGM的劑量，即分別為25 mg/kg和50 mg/kg劑量的MGM組及陽(yáng)性對(duì)照組（50 mg/kg），每組10只大鼠。正常對(duì)照組大鼠按體質(zhì)量灌胃給予純凈水，各給藥組分別給予對(duì)應(yīng)的藥物溶液，每日給藥1次，連續(xù)給藥32 d，給藥32 d后采血分離血清，測(cè)定血脂含量。

四、MGM急性毒性實(shí)驗(yàn)安全性評(píng)價(jià)方法

健康SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量19 ～ 22 g，40只;SD大鼠，體質(zhì)量220.3 ～ 261.9 g，10只，雌雄各半;購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。

參照《GB15193.3-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》的最大耐受劑量法進(jìn)行本配方的安全性評(píng)價(jià)。將40只正常的BALB/c小鼠隨機(jī)分成正常組20只，MGM組20只;10只正常SD大鼠隨機(jī)分成正常組4只，MGM組6只。

動(dòng)物隔夜禁食后灌胃給予MGM溶液，1 d給藥2次，間隔4 h，總給藥劑量為23.2 g/（kg·d）是人體推薦口服劑量的1933倍。給藥前后動(dòng)物稱重，72 h內(nèi)觀察記錄動(dòng)物死亡情況及中毒表現(xiàn)等;72 h時(shí)各組動(dòng)物取心臟、肝臟和腎臟稱量各臟器濕重，計(jì)算臟器系數(shù) （%） = 臟器濕重/體質(zhì)量×100%，然后將各臟器放入固定液中固定后進(jìn)行石蠟包埋及HE染色進(jìn)行各臟器組織病理學(xué)檢查。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖。正態(tài)分布定量資料用表示，2組間若方差齊性則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Welchs校正t檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布的定量資料以M（P25， P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。各組給藥前后比較，2組數(shù)據(jù)的差值服從正態(tài)分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。α = 0.05。

結(jié)果

一、MGM對(duì)混合型高脂血癥大鼠調(diào)脂功效評(píng)價(jià)

模型組大鼠喂養(yǎng)HFC 2周后，與正常對(duì)照組比較，血清HDL-C的含量變化不顯著，表明HFC喂養(yǎng)對(duì)大鼠HDL-C的水平無(wú)影響;模型組大鼠血清總TC、TG和LDL-C的含量升高（P均< 0.001），表明高脂血癥大鼠模型建立成功，見(jiàn)表1。

正常對(duì)照組在0 d和32 d檢測(cè)血清中的TC、TG和LDL-C含量未見(jiàn)顯著變化。

25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TC含量[（3.873 ±0.681）mmol/L]較給藥前[（5.951±0.828）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TC含量[（3.959±0.924）mmol/L]較給藥前[（5.997 ±1.048）mmol/L]降低（P < 0.001）;陽(yáng)性對(duì)照品給藥32 d后TC含量[4.046 （3.010， 4.818）mmol/L]較給藥前[6.035 （5.373， 6.775）mmol/L]降低（P = 0.004）。25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TG含量[（1.263 ±0.416）mmol/L]較給藥前[（3.951±1.015）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TG含量[（1.417±0.691）mmol/L]較給藥前[（4.311±1.714）mmol/L]降低（P < 0.001）;陽(yáng)性對(duì)照品給藥32 d后TG含量[（1.427±0.400）mol/L]較給藥前[（3.379±0.908）mol/L]降低（P < 0.001）。

LDL-C含量25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后LDL-C含量[（0.479±0.079）mol/L]較給藥前[（1.096±0.167）mol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后LDL-C為[（0.565±0.219）mol/L]較給藥前[（1.314±0.492）mol/L]降低（P < 0.001）;陽(yáng)性對(duì)照品給藥32 d后LDL-C含量[（0.514±0.125）mol/L]較給藥前[（1.108±0.277）mol/L]降低（P < 0.001）。25 mg/kg的MGM的調(diào)脂效果與50 mg/kg劑量的陽(yáng)性對(duì)照品相當(dāng)，表明MGM的復(fù)方優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照品的調(diào)脂效果。

動(dòng)物灌胃各試劑32 d后，正常對(duì)照組、MGM（25和50 mg/kg）組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中HDL-C的含量變化不顯著，各組HDL-C含量分別為（0.534±0.081）mol/L、（0.633±0.117）mol/L、0.625（0.535，0.658） mol/L、（0.611±0.052）mol/L，說(shuō)明HFC不會(huì)造成大鼠HDL-C水平的紊亂。

二、MGM急性毒性實(shí)驗(yàn)安全性評(píng)價(jià)

1.一般臨床觀察及體質(zhì)量

急性毒性實(shí)驗(yàn)在2次灌胃后的72 h內(nèi)各組均無(wú)動(dòng)物死亡，大、小鼠行為活動(dòng)均正常，無(wú)明顯中毒反應(yīng)。72 h動(dòng)物解剖肉眼觀察心、肝、腎等主要器官未見(jiàn)顏色形態(tài)異常，亦沒(méi)有出血點(diǎn)或其他病理改變。給藥前大、小鼠2組體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說(shuō)明隨機(jī)分組均勻。23.2 g/kg的MGM給藥后，2組體質(zhì)量及各臟器系數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見(jiàn)表2 ～ 4。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MGM對(duì)大、小鼠的最大耐受量為23.2 g/（kg·d），相當(dāng)于人體推薦口服劑量的1933倍，未能測(cè)出LD50。按照急性毒性劑量分級(jí)，屬無(wú)毒級(jí)。

2.組織病理學(xué)檢查

2組的心臟、肝臟、腎臟等主要器官肉眼觀察未見(jiàn)顏色形態(tài)異常，亦沒(méi)有出血點(diǎn)或其他病理改變。HE染色結(jié)果顯示與正常組比較，MGM急性給藥未見(jiàn)小鼠和大鼠心臟、肝臟、腎臟主要臟器發(fā)生病理性損傷，各臟器結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞形態(tài)正常，初步數(shù)據(jù)表明MGM在高出人體推薦劑量1933倍的基礎(chǔ)上是安全的，見(jiàn)圖1。

討論

高脂血癥是一種慢性疾病，治療周期長(zhǎng)，患者需長(zhǎng)期服藥，然而長(zhǎng)時(shí)間服用他汀類藥物容易產(chǎn)生耐藥性和不良反應(yīng)。藥食同源材料的復(fù)方毒性極低、適合長(zhǎng)期服用。

紅曲為傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，紅曲提取物是從紅曲總體去分離得到以洛伐他汀為標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品，它是膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，其對(duì)高脂血癥具有較好的預(yù)防和治療效果，并具有抗動(dòng)脈粥樣斑塊形成作用，紅曲劑量與藥效呈正相關(guān)[5]。銀杏提取物中含有銀杏總黃酮、銀杏內(nèi)酯等物質(zhì)并主要以苷的形式存在。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏提取物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的多不飽和脂肪酸的分布、抑制HMG-CoA還原酶，促進(jìn)糞便膽固醇的增加，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇的吸收減少，以及血漿和肝膽固醇的降低，發(fā)揮調(diào)脂的作用[6]。南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司申請(qǐng)的《預(yù)防或治療心腦血管疾病的紅曲、銀杏葉組合物及其應(yīng)用》發(fā)明專利證實(shí)紅曲提取物與銀杏葉提取物按1∶1配比關(guān)系配制，具有顯著的協(xié)同作用。本研究所用配方是在銀杏葉和紅曲提取物組分的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加了葉酸與維生素B6，觀察其與脂質(zhì)代謝之間的聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，MGM給藥32 d后顯著降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平，具有調(diào)脂作用，且MGM復(fù)方優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照品的調(diào)脂效果，證實(shí)MGM四組分的配方比紅曲和銀杏葉兩組分配方具有更強(qiáng)的協(xié)同調(diào)脂作用。為了保證銀杏葉、紅曲提取物合并葉酸與維生素B6聯(lián)用復(fù)方做為調(diào)脂產(chǎn)品的安全性，初步急性毒性實(shí)驗(yàn)，正常雌雄大、小鼠MGM的最大耐受劑量為23.2 g/（kg·d），高于人體推薦劑量的1933倍，病理組織學(xué)檢查MGM組動(dòng)物心臟、肝臟和腎臟未見(jiàn)異常改變。按照急性毒性劑量分級(jí)，屬無(wú)毒級(jí)，說(shuō)明按推薦量食用是安全的。根據(jù)以上結(jié)果，我們可以初步判斷，在人體推薦劑量范圍內(nèi)服用MGM是有效、安全的。

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（收稿日期：2021-01-05）

（本文編輯：楊江瑜）