中藥含藥血清制備的思考與探討

郭迎超 梁爽 周波

摘要：中藥含藥血清作為干預(yù)手段在中藥藥理研究體外實(shí)驗(yàn)中越來越受到廣大科研工作者的重視，并取得一定的進(jìn)展?？茖W(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案貫穿于整個(gè)中藥含藥血清制備的全過程，直接影響到血清中藥物有效成分的含量、活性等，對(duì)于模擬中藥在體內(nèi)真實(shí)藥理活動(dòng)過程至關(guān)重要，也是中藥及復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)研究取得成功的關(guān)鍵點(diǎn)?；谡n題組在進(jìn)行中藥復(fù)方養(yǎng)營活血湯含藥血清制備的過程中，查閱相關(guān)文獻(xiàn)及制備方法，對(duì)中藥含藥血清制備進(jìn)行詳細(xì)的梳理，并提出一些見解，以饗同道。

關(guān)鍵詞：含藥血清;制備方法;研究

中圖分類號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2021）09-0051-05

中藥含藥血清是指根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要用中藥（單味或復(fù)方）按照一定的劑量、規(guī)定的劑型（大多用中藥煎湯）和預(yù)定的給藥次數(shù)、給藥時(shí)間等對(duì)特定的動(dòng)物如大鼠、小鼠、豚鼠和兔等進(jìn)行灌胃后，選擇適宜的采血法在擬定的時(shí)間內(nèi)采集動(dòng)物的血液并對(duì)其進(jìn)行分離，最后得到的含有藥物本身、藥物代謝產(chǎn)物、活性成分、雜質(zhì)成分和一定酸堿度變化等的血清復(fù)合物。中藥含藥血清是用于代替原藥物的粗提物作為供試材料進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的，其可避免中藥復(fù)方粗提物本身的理化性質(zhì)等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾[1]。

1 中藥含藥血清制備的研究現(xiàn)狀

1.1 動(dòng)物種屬的選擇 中藥含藥血清的制備首先要考慮供體動(dòng)物的選擇，不同種屬、年齡的動(dòng)物對(duì)藥物吸收也不相同，因而造成血藥成分、濃度的差異[2]。有報(bào)道因藥物不同、被采血?jiǎng)游锏姆N屬差異及同一種屬間的個(gè)體差別而獲得的含藥血清中各種因子含量也不盡相同，并由此在后續(xù)的試驗(yàn)中可能會(huì)影響到細(xì)胞貼壁[3]。所以，欲獲得合理可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須在一開始就有較為合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

動(dòng)物種屬的選擇要求同質(zhì)性。所謂的同質(zhì)性即含藥血清的供體動(dòng)物需要與體外試驗(yàn)用的離體器官、組織和細(xì)胞的供體動(dòng)物能夠保持統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，只有在標(biāo)準(zhǔn)相同的前提下實(shí)驗(yàn)結(jié)果才最有意義。具體表現(xiàn)在選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)保證動(dòng)物的種屬一致、年齡相同、同一性別及體重基本相等等方面，而且，供體動(dòng)物應(yīng)該造模，即在相同的生理病理狀態(tài)下獲得的含藥血清才最有實(shí)驗(yàn)價(jià)值。在目前多數(shù)研究中血清供體動(dòng)物均選用的是正常動(dòng)物，忽略了血清供體動(dòng)物造模[4]。因此，上述問題還需進(jìn)一步深入討論。

最好選擇與人類生物特性相似的動(dòng)物如正常的小鼠、大鼠和兔等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 動(dòng)物的給藥方案 動(dòng)物的給藥方案主要包括給藥劑量、給藥次數(shù)、給藥時(shí)間和給藥途徑等，其中最為重要的是給藥劑量。通常認(rèn)為中藥含藥血清中血藥濃度的高低是由機(jī)體當(dāng)時(shí)的血藥濃度決定的，即含藥血清的濃度（體積比）越高就意味著藥物的效果越明顯，而該血藥濃度與給藥劑量存在一定量效關(guān)系，但是，有研究提示動(dòng)物體內(nèi)給藥劑量、中藥含藥血清的藥物濃度與藥效強(qiáng)弱三者之間并非呈平行關(guān)系[5]。

給藥的方法包括：固定容量給藥法，如制備某含藥血清時(shí)按固定容量2 ml/次給藥，即在保持容量不變的基礎(chǔ)上通過調(diào)整給動(dòng)物灌胃的藥物濃度而達(dá)到目標(biāo)劑量;固定藥物質(zhì)量給藥法，如制備某含藥血清時(shí)按固定質(zhì)量2 g/次給藥;固定藥物容量和質(zhì)量給藥法，即結(jié)合規(guī)定容量給藥法又參考規(guī)定質(zhì)量給藥法;按單位體質(zhì)量藥物給藥量給藥，有報(bào)道在復(fù)方六月雪含藥血清制備時(shí)予以復(fù)方六月雪高、中、低劑量組分別是6.6 mg/（kg·d）、3.3 mg/（kg·d）和1.7 mg/（kg·d）給藥[6];按人體等效劑量倍數(shù)給藥，如陳彩霞等[7]制備金欣口服液含藥血清時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以金欣口服液36 g/（kg·d）（相當(dāng)于人臨床等效劑量的4倍）進(jìn)行灌胃;或按臨床成人用量的倍數(shù)給藥，如陸海英等[8]在制備中藥抗纖靈方含藥血清時(shí)灌胃量取10倍于人的有效劑量，即每只大鼠每天灌服藥液3ml（含生藥6g）。以上幾種給藥方案一定要結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)酌情選用，需要注意的是，以200 g左右大鼠為例，考慮到其胃的容積，每次灌胃劑量最好不超過2ml。課題組在制備養(yǎng)營活血湯含藥血清時(shí)是按照大鼠與成人的每千克體重等效劑量折算系數(shù)6.25換算大鼠用藥劑量灌胃給藥。

1.3 動(dòng)物的給藥時(shí)間 為減輕動(dòng)物的不適和避免其它因素可能帶來的干擾，建議每次在給動(dòng)物進(jìn)行灌胃前先禁食8～12 h，且給藥時(shí)間應(yīng)安排在動(dòng)物空腹?fàn)顟B(tài)下最為合理。

有人認(rèn)為，在給動(dòng)物或人服藥1周甚至10 d 之后所取得的血清，盡管此時(shí)已接近或模擬了體內(nèi)的藥物實(shí)際情況，但已不再是藥物本身，因其中的有些活性成分被胃酸滅活、或在肝臟中被滅活，當(dāng)然無法再認(rèn)為是該藥物的單純作用了。也有人提出快速給藥、短時(shí)間內(nèi)取血的血清制作方法，可是在實(shí)驗(yàn)中又發(fā)現(xiàn)用這種方法所制作的血清藥效較差而導(dǎo)致無法進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

課題組在制備中藥含藥血清時(shí)采用每12 h對(duì)大鼠灌胃給藥1次，連續(xù)給藥3 d（即共6次），于末次給藥1.5 h后采血。也有其他多種不同的給藥方案，如肖政華等[9]制備扶肝化纖湯含藥血清時(shí)采用日1次，連續(xù)6 d，第7 d重復(fù)給藥2次，間隔時(shí)間2 h，于末次給藥后1 h予腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血。

1.4 動(dòng)物的采血時(shí)機(jī) 采血時(shí)機(jī)主要指藥物與動(dòng)物作用的最佳時(shí)間節(jié)點(diǎn)，與藥物代謝的時(shí)間密切相關(guān)，牽涉到藥代和藥動(dòng)兩方面。理論上講，中藥含藥血清采血時(shí)間應(yīng)落在血藥濃度的高峰期，但因每種藥物達(dá)到血藥濃度的高峰期也不盡相同，故在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)所選藥物的種類、實(shí)驗(yàn)?zāi)康睾皖A(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果等，結(jié)合不同種類藥物的藥物峰值而選擇不同的采血時(shí)間[10]。

研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)動(dòng)物末次給藥后1 h和2 h取血點(diǎn)獲得的血清藥效較強(qiáng)[11]。可見最理想的采血時(shí)間應(yīng)在動(dòng)物末次給藥后1～2 h之內(nèi)，課題組制備中藥復(fù)方含藥血清時(shí)是將采血時(shí)間安排在動(dòng)物末次給藥后的1.5h，應(yīng)注意的是按每組大鼠末次給藥的先后順序依次進(jìn)行采血，盡量使每只大鼠末次給藥時(shí)間與采血時(shí)間均間隔1.5 h，按此法制備的含藥血清在后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)藥效良好。

1.5 動(dòng)物的采血方法 目前常用的動(dòng)物采血方法及優(yōu)缺點(diǎn)如下：眼眶靜脈叢采血具有操作簡便、取血量大、血流速度快的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是進(jìn)針深度難以控制且易凝血;割（剪）尾取血損傷小，但取血量少且易感染;心臟采血有定位準(zhǔn)確、取血量大、操作簡便的特點(diǎn)，但是應(yīng)注意麻醉藥深度，不可過量;腹主動(dòng)脈采血法的優(yōu)點(diǎn)在于血量大且不易溶血，但操作相對(duì)復(fù)雜和對(duì)技術(shù)性要求較高。

1.6 動(dòng)物含藥血清的過濾及存儲(chǔ) 多數(shù)觀點(diǎn)支持對(duì)大鼠含藥血清進(jìn)行過濾除菌。具體做法是將大鼠稱重后，水合氯醛腹腔注射麻醉，在無菌條件下進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，靜置1小時(shí)后，在4℃、3000 rpm/min離心10 min，取上層血清用0.22 μm濾器過濾后再分裝至1.5 mL凍存管中。

含藥血清的儲(chǔ)存一般分為-20℃和-80℃低溫凍存，依據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間的長短選擇，因過長的儲(chǔ)存時(shí)間可能會(huì)影響到含藥血清的作用，故建議以短期儲(chǔ)存為好。

2 中藥含藥血清制備存在的問題及思考

目前，盡管中藥含藥血清作為重要的干預(yù)手段已廣泛應(yīng)用于臨床研究中，但是仍存在很多的問題需要我們?nèi)ミM(jìn)一步探討和完善。

2.1 動(dòng)物的選擇方案需要標(biāo)準(zhǔn)化 標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物選擇方案對(duì)下一步的實(shí)驗(yàn)起決定性作用，只有在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)下制備的中藥含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)才最有說服力。建議在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的初期選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)注意：（1）同步化，即各實(shí)驗(yàn)組采用同種正常血清，使細(xì)胞在24h或更長的時(shí)間內(nèi)在貼壁率上達(dá)到一致。（2）藥物血清實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血清必須采自同一種屬的同類動(dòng)物，即年齡和性別相同、體重基本統(tǒng)一等。（3）用于培養(yǎng)細(xì)胞與制備含藥血清的動(dòng)物應(yīng)保持同一種屬，即人的含藥血清僅能用于人的細(xì)胞。

2.2 血清供體動(dòng)物造模的必要性 近年來科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)即使同一種藥物，其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可因人群、生理、病理或遺傳背景的不同呈現(xiàn)差異[12]。當(dāng)前，國內(nèi)很多研究者在應(yīng)用中藥含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，這些含藥血清大部分來自于正常動(dòng)物而非造模的動(dòng)物，嚴(yán)格來講，這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的合理性是需要討論的。韋振源[13]認(rèn)為，不同個(gè)體對(duì)同一種藥物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)在不同生理、病理?xiàng)l件下，由于機(jī)體的狀態(tài)不同會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，血液中的物質(zhì)成份也會(huì)發(fā)生變化，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定程度的影響，使之不能真實(shí)地反映所研究的單味中藥或復(fù)方的作用。故建議最好使用病理狀態(tài)下制備的含藥血清進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同證型對(duì)藥物濃度的影響 即使同一疾病，因證型不同，機(jī)體對(duì)藥物體內(nèi)代謝也將產(chǎn)生不同的影響。據(jù)中醫(yī)辨證論治理論提出的證治藥動(dòng)學(xué)假說，有學(xué)者對(duì)藥物相同而“證”不同的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)有明顯差別，從而影響到藥物療效和毒性反應(yīng)，然而經(jīng)用辨證施治后發(fā)現(xiàn)這種差別已消失，或較前明顯減輕[14]?？梢姴煌C型對(duì)藥物濃度和成份將產(chǎn)生一定影響，因此建議在動(dòng)物疾病相同和證型相同的基礎(chǔ)上制備含藥血清才是最科學(xué)的。

2.4 個(gè)體化的采血時(shí)點(diǎn)更為貼切 在含藥血清制備過程中，保證血藥濃度和藥效強(qiáng)弱的關(guān)鍵在于動(dòng)物的給藥劑量、次數(shù)和采血時(shí)點(diǎn)。中藥給藥后達(dá)峰值時(shí)間可因其成分不同結(jié)果亦有差別，故采血時(shí)點(diǎn)尚不能統(tǒng)一?，F(xiàn)階段較通用的給藥方法為1次/d，連續(xù)3～5 d，或2次/d，連續(xù)3 d，末次灌胃后1～3 h 取血。在此建議，于大部分實(shí)驗(yàn)而言，需要考慮采用通用的給藥方法并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行個(gè)體化調(diào)整。

2.5 中藥復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)及配伍機(jī)制 建立中藥復(fù)方質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化，有報(bào)道的方案即首先通過中藥血清藥物化學(xué)的方法來研究確定中藥體內(nèi)直接作用物質(zhì)，并以此為指標(biāo)再通過高效液相色譜（HPLC）、指紋圖譜等手段建立國際標(biāo)準(zhǔn)化的定性[15]。毫無疑問，這給我們深入研究中藥復(fù)方質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)提供了指導(dǎo)和方向。

中藥復(fù)方配伍科學(xué)、臨床常用且療效可靠，但對(duì)其配伍規(guī)律的現(xiàn)代研究尚在探索當(dāng)中[16]。中藥血清藥物化學(xué)可在一定程度上解釋復(fù)方的配伍規(guī)律，其先對(duì)復(fù)方入血成分進(jìn)行全面分析并確定復(fù)方藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)，再通過研究主要藥效成分的體內(nèi)動(dòng)態(tài)、成分間相互作用及消長規(guī)律[17]?？傊?，研究中藥復(fù)方在體內(nèi)的作用形式和作用機(jī)制最好通過血清化學(xué)分析與血清藥理實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法[18]。

2.6 含藥血清的滅活尚有爭議 目前最常用的是水浴滅活的方法，即在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)之前，將裝有中藥含藥血清的凍存管放置于56℃水浴中滅活30min[19]。因在新鮮制備的血清中常含有一定量的補(bǔ)體，它們大多數(shù)是酶原、酶及酶的抑制劑或激動(dòng)劑，其具有機(jī)體防御和清除病原微生物等作用[20]。但是，藥物血清的滅活將對(duì)這部分具有一定活性的物質(zhì)產(chǎn)生影響，繼而影響到藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且無法與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床用藥情況符合一致[21]。

盡管對(duì)血清滅活這一常規(guī)處理方法存在爭議，但是筆者建議最好結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察滅活后和未進(jìn)行滅活的含藥血清在體外實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)結(jié)果予以充分考慮。血清滅活是有必要的，因在動(dòng)物含藥血清制備過程中是很難絕對(duì)防止到微生物感染的。

2.7 體外實(shí)驗(yàn)中含藥血清的添加量與對(duì)照組的設(shè)定 藥物血清的藥理效應(yīng)并非因動(dòng)物體內(nèi)給藥量越大就會(huì)越好[22]。研究發(fā)現(xiàn)采用不同濃度的含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)其對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)或抑制作用及對(duì)細(xì)胞的毒性作用亦不相同[23]。在體外實(shí)驗(yàn)中含藥血清的添加量也呈現(xiàn)多樣化，故在確定體外實(shí)驗(yàn)中含藥血清的添加量時(shí)除參考相關(guān)文獻(xiàn)外，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可對(duì)選擇合適的添加量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)做出指導(dǎo)。原則上既要關(guān)注高濃度血清對(duì)細(xì)胞的毒性，也應(yīng)考慮使含藥血清的濃度盡量接近于血藥濃度[24]。

設(shè)立空白血清作為對(duì)照組是為了避免血清本身具有的活性給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來影響[25]。在設(shè)立對(duì)照組時(shí)，當(dāng)用一種藥物劑量（如用某中藥復(fù)方高劑量）給大鼠灌胃獲得的含藥血清，而采用不同體積分別作為不同劑量組時(shí)，對(duì)照組則應(yīng)選擇相應(yīng)的不同體積空白血清，且在數(shù)據(jù)處理時(shí)應(yīng)以實(shí)際測得數(shù)據(jù)表示;當(dāng)用不同劑量的藥物（如用某中藥復(fù)方高、中、低劑量）給予大鼠灌胃獲得的含藥血清時(shí)，應(yīng)取同體積的血清作為不同藥物劑量組，則對(duì)照組僅需設(shè)立一組等體積空白血清[26]?？傊_選擇含藥血清的添加量和設(shè)定對(duì)照組將直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。課題組在進(jìn)行中藥含藥血清制備時(shí)是采用中藥復(fù)方湯劑高、中、低劑量給大鼠灌胃，在設(shè)立空白血清作為對(duì)照組時(shí)用一組等體積空白血清。

3 小結(jié)

綜上，應(yīng)用中藥含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的方法是可行的，但仍需要深入探索和研究。在對(duì)中藥及復(fù)方進(jìn)行研究時(shí)，建議結(jié)合血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)和中藥血清藥物化學(xué)的研究結(jié)果，參考給藥后入血成分?jǐn)?shù)和量的變化規(guī)律來嚴(yán)格制訂合理的給藥及采血方案，并依據(jù)血清色譜指紋圖選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄈコ逯泄逃谐煞旨皟?nèi)源性雜質(zhì)等[27]。隨著對(duì)含藥血清成份分離和分析手段的提高，中藥血清藥理學(xué)研究將會(huì)得到進(jìn)一步的發(fā)展和完善，因含藥血清成分復(fù)雜致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差的問題將會(huì)得到逐步解決[28]。細(xì)節(jié)決定成敗，有時(shí)候看似極其微小的細(xì)節(jié)問題卻可能會(huì)影響到總體的結(jié)局。所以，在整個(gè)中藥含藥血清制備的全過程，一定要關(guān)注到每一個(gè)細(xì)節(jié)，以嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的態(tài)度認(rèn)真對(duì)待實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)環(huán)節(jié)，從而使制備的中藥含藥血清最大限度的模擬真實(shí)臨床狀態(tài)。

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（收稿日期：2021-05-09）