Meyerozyma guilliermondii 合成碲納米棒催化PMS 降解麗春紅S

孫維良，萬光儀，鄧國志**

(1. 安徽大學 資源與環(huán)境工程學院，安徽 合肥 230601；2. 安徽大學 濕地生態(tài)保護與修復安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601)

近年來，偶氮染料是染料工業(yè)中應用最為廣泛的一類含偶氮基團的芳香化合物. 其中Ponceau S作為典型偶氮染料在工業(yè)染色中運用廣泛，其滯留在環(huán)境中會分解成多種致癌芳香胺. 由于共軛鍵和生色基團的影響，Ponceau S 分子的生化性差、色度高[1]等復雜特點使含Ponceau S 廢水成為最難處理的工業(yè)廢水之一. 因此迫切需要一種安全、快速有效的方法去除水體中的Ponceau S 染料. PMS 活化過硫酸鹽是國內(nèi)外近些年發(fā)展起來的高級氧化體系(AOPs)[2]，通過活化PMS 產(chǎn)生氧化能力極強的自由基，對有機污染物具有良好的降解效果. 催化PMS 降解污染物的關鍵在于尋找合適的催化劑，當前催化劑主要有過渡金屬離子[3]、金屬硫化物[4]、負載型化合物[5]、摻雜型化合物[6]等.

Te 為多價態(tài)的過渡金屬：-2、+2、+4 和+6 價，這為利用電子轉移活化PMS 提供了可能[7]. 目前制備碲納米顆粒(TeNPs)的方法有物理法、化學法和生物法. 其中物理法所用設備過于昂貴且只是暫時轉移污染物，并沒有從根本上去除污染物[8]，化學法成本消耗高[9]且所需的還原試劑有毒，生物法不僅對Te(Ⅳ)具有較強的解毒和代謝能力[10]，而且生物活性高、結構更為穩(wěn)定，因而考慮生物法，即通過蛋白質(zhì)、還原酶等代謝產(chǎn)物將其還原成低生物毒性的單質(zhì).

經(jīng)過多年研究，TeNPs 已應用于吸附染料和重金屬[11]、抗菌[12]和去除生物膜[13]等. 本實驗利用Meyerozyma guilliermondii(季也蒙畢赤酵母菌)，在好氧環(huán)境下將Te(Ⅳ)還原并對其還原產(chǎn)物進行純化表征. 然后以偶氮類染料Ponceau S 為污染物，利用TeNRs 催化PMS 對目標污染物進行氧化降解，并對其降解機制進行分析，為生物化學聯(lián)合處理偶氮染料提供了新的方向.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種Meyerozyma guilliermondii

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：Trypone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L.

還原液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.255 g/L，NaCl 0.46 g/L，MgSO4·7H2O 0.024 g/L，K2HPO40.225 g/L，KH2PO40.225 g/L，HEPes 4.766 g/L，微量元素儲備液5 mL/L；pH=7.0.

LB 固體培養(yǎng)基和還原固體培養(yǎng)基：在上述成分之外加入18.0 g/L 的瓊脂.

培養(yǎng)基在121 ℃滅菌15 min.

1.1.3 試劑 二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDTC)、三羥甲基氨基乙烷(Tris)、鹽酸(HCl)、L-組氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚，本實驗采用的試劑均為分析純.

亞碲酸鈉(Na2TeO3)采購自上海麥克林生化科技有限公司，PMS 采購自上海薩恩化學技術有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株 的篩選及 培養(yǎng) 取5 g 土樣接 種到50 mL LB 培養(yǎng)基中30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h；取培養(yǎng)液2 mL 加至pH=7.0 的還原培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h；待培養(yǎng)基混濁. 上述步驟篩選3 代后取10 μL 培養(yǎng)液在含0.1 mmol/L Te(Ⅳ)的LB 固體平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當LB 固體培養(yǎng)基上菌落呈黑色時，證明所得分離菌株可還原Te(Ⅳ)，繼續(xù)純化3 次后，于超低溫冰箱保種.

冰 箱 取 出 保 種 的 菌 轉 至50 mL LB 培 養(yǎng) 基中，在30 ℃、150 r/min 好氧培養(yǎng)24 h，離心收集(8 000 r/min，5 min)，用滅菌的還原培養(yǎng)基重懸離心，重復3 次. 打開分光光度計預熱20 min，取50 μL菌液稀釋100 倍使OD600=1.0，計算接菌量.

1.2.2 菌株合成TeNRs 將菌株接種至含有10 g/L葡萄糖的還原培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min 避光培養(yǎng).

1.2.3 Te(Ⅳ)的測定方法 溶液中亞碲酸鹽的測定方法采用文獻中描述的DDTC[14]方法：取1 mL 上 清 液 在9 727 r/min 下 離 心10 min，依 次加 入0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.0）溶 液3 mL 和10 mmol/L DDTC 溶液1 mL，混勻，室溫避光反應10 min 后測定OD340nm.

1.2.4 TeNRs 的表征儀器 紫外-可見分光光度計(美國貝克曼庫爾特有限公司，型號為DU730)、X射線衍射儀(日本株式會社理學，型號為SmartLab 9KW)、透射電子顯微鏡-能譜(日本電子株式會社，型號JEM-2100)、掃描電子顯微鏡(日本日立公司，型號REGULUS 8230)和傅里葉紅外光譜(德國布魯克公司，型號Vertex80+Hyperion2000).

1.2.5 TeNRs 的純化 10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，Tris-HCl 重懸沉淀，去離子水離心沖洗3～5 遍，保留沉淀；超聲破碎1 h (間隔2 s，超聲4 s)后，10 000 r/min 離心10～30 min；沉淀于超低溫冰箱冷凍保存1 h，放入冷凍干燥機過夜，研磨成粉末后4 ℃冰箱保存.

1.2.6 TeNRs 催化 PMS 氧化降解Ponceau S，向25 mL 錐形瓶中加入10 mg/L Ponceau S 溶液，再加入0.06 g/L TeNRs 和0.40 g/L PMS 粉末. 在150 r/min、30 ℃恒溫氣浴振蕩，每隔0.5 h，使用0.45 μm 注射器過濾器取出樣品，并立即用分光光度計在λmax=520 nm 處測定吸光度，實驗設置3 組平行樣.

2 結果與討論

2.1 菌 株 合 成TeNRs菌 株 在 含0.5 mmol/L Te(Ⅳ)平板和還原培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)24 h 后，結果如圖1 所示. 在無Te(Ⅳ)的情況下平板和培養(yǎng)基并無顏色變化，表明沒有新物質(zhì)產(chǎn)生；而添加Te(Ⅳ)的平板和培養(yǎng)基的顏色會變黑，Te(Ⅳ)明顯被還原為Te(0).

圖1 菌還原Te(Ⅳ)的表面特征Fig. 1 Surface characteristics of Te(Ⅳ) reduction by fungus

2.2 TeNRs 的表征取反應后的溶液，將其用去離子水稀釋注入石英比色皿中，以去離子水為參比，在200～900 nm 的波長范圍內(nèi)，用UV-Vis 進行全波長掃描. 如圖2 所示，發(fā)現(xiàn)在210 nm 處有明顯的吸收峰，已有文獻證實TeNRs 的特征峰是由于表面等離子共振(SPR)[15]，證明TeNRs 的存在.

圖2 TeNRs 的紫外-可見吸收光譜Fig. 2 UV-Vis absorption spectra of TeNRs

對樣品進行XRD 檢測，使用jade 6.5 軟件對檢測結果進行分析. 如圖3，發(fā)現(xiàn)在22.99°、27.63°、38.68°、47.01°和51.89°的衍射峰可與Te 的標準卡(ICDD 卡 號36-1452)(100)、(101)、(102)、(200)和(103)面的衍射峰相對應. 這表明TeNRs 成功制備.

圖3 TeNRs 的XRD 圖譜Fig. 3 The XRD spectra of TeNRs

Baesman 等[16]利用芽孢桿菌(Bacillus)合成棒狀TeNRs；在Zare 等[17]的研究中生物合成TeNRs的長度為180 nm. 為了進一步確定納米粒子的形貌和成分，利用TEM 觀察TeNRs 的形貌，如圖4(a)所示，細胞壁表面分散著平均長度為100 nm 左右的納米棒，推測其為Te(Ⅳ)的還原產(chǎn)物. 為了進一步表征納米粒子，對樣品進行如圖4(b)的HRTEM 分析，結果表明納米粒子晶格條紋的間距約為0.21 nm，對應TeNRs 的(102)晶格平面. 對圖4(a)中標示的納米棒進行EDS(圖5)分析，發(fā)現(xiàn)單質(zhì)Te 在3.6 keV下有一個顯著峰值，觀測到C，N，O 的峰，推測源于生物分子，如酶、菌生物材料或包裹在TeNRs 上的多糖和蛋白質(zhì)[18]，此外Cu 產(chǎn)生的峰值是由于納米粒子滴于銅網(wǎng)上造成. 從SEM (圖6)可看出大量納米棒位于細胞壁表面，這與TEM 結果一致. 這些結果進一步證實TeNRs 的存在.

圖4 TeNRs 透射電子顯微鏡圖和高分辨透射電子顯微鏡圖Fig. 4 TEM picture and HRTEM picture of TeNRs

圖5 TeNRs 的EDS 圖譜Fig. 5 Energy spectrometer of TeNRs

圖6 TeNRs 掃描電鏡圖像Fig. 6 SEM picture of TeNRs

圖7 給出的FTIR 光譜用來分析TeNRs 表面的有機官能團: 3 382 cm-1處吸收峰(O―H 伸縮)，2 926 cm-1(C―H 反對稱伸縮)，2 854 cm-1(C―H 對稱伸縮)，1 749 cm-1(C＝O 伸縮)，1 652 cm-1(C＝C伸縮)，1 415 cm-1(COO―對稱伸縮)，1 235 cm-1(多糖 和 磷 脂 中 的P＝O 伸 縮)、1 077cm-1(肽 聚 糖C―O 和 P―O 伸縮). 結果表明，生物合成 TeNRs表面附著蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì).

圖7 TeNRs 的傅里葉紅外光譜Fig. 7 The FTIR spectra of TeNRs

2.3 TeNRs 催化PMS 氧化降解Ponceau S保持Ponceau S 投 加 量 為10 mg/L，TeNRs 投 加 量 為0.06 g/L，PMS 投加量為0.40 g/L 的條件不變.

(1)Ponceau S 顏色在不同體系下的變化如圖8(a)所示，單獨加PMS 或只有染料存在時，染料顏色基本不會改變；單獨加TeNRs 時，染料顏色會加深；而對比加入TeNRs 和PMS 時，染料顏色會逐漸發(fā)生改變，最終由紅色變?yōu)榘咨?

(2)Ponceau S 顏色在不同體系下降解曲線如圖8(b)所示，4 種體系下Ponceau S 的降解速率比較：v(TeNRs+PMS +Ponceau S) ＞v(PMS+Ponceau S)＞v(TeNRs+Ponceau S) ≈v(Ponceau S). 單 獨 加TeNRs 對Ponceau S 基本不會吸附；單獨加入PMS對Ponceau S 有一定的降解效果，但其最終降解率在6.61%；而對比加入TeNRs 催化PMS 對Ponceau S 的降解效果較為顯著，降解率可達92.5%.

圖8 TeNRs 催化降解Ponceau S 性能實驗Fig. 8 Catalytic degradation of Ponceau S by TeNRs

由上述可知單獨加入TeNRs 時，對Ponceau S顏色及降解率的影響基本忽略不計，說明Ponceau S 降解并非吸附作用造成；PMS 可降解Ponceau S是因其本身的氧化性，但其顏色變化和降解率不明顯；當同時加入 PMS 和TeNRs 后，Ponceau S 的顏色變化顯著、降解率大大增加，說明TeNRs 可提供催化活性位點以活化PMS 產(chǎn)生強氧化性自由基[19]，故生物合成的TeNRs 具有良好的催化PMS 氧化降解Ponceau S 的能力.

2.4 降解機制的分析實驗采用L-組氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚來猝滅催化降解過程中可能產(chǎn)生的自由基.L-組氨酸主要猝滅單線態(tài)氧（1O2）[19]；乙醇和苯酚常用猝滅HO·和SO4-·；叔丁醇對HO·有比較高的反應速率，常用來猝滅HO·. 實驗結果如圖9 所示，當TeNRs+PMS+Ponceau S 體系添加500 mmol/L 的乙醇后，Ponceau S 降解率從92.5%下降為52.6%；添加1 mmol/L 的L-組氨酸和500 mmol/L的叔丁醇后有輕微抑制Ponceau S 降解的作用；加入500 mmol/L 的苯酚后，Ponceau S 的降解率降為34.6%.

圖9 自由基猝滅實驗Fig. 9 Free radical quenching experiment

推測產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是L-組氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚的水溶性不同，對液相和催化劑表面的自由基及非自由基清除效果不同[20].L-組氨酸，乙醇和叔丁醇都是親水性化合物，相對難以接近催化劑表面，大部分會在液相中與污染物分子競爭自由基，所以當3 種化合物加入反應體系后，降解率會出現(xiàn)不同的降低情況，結合猝滅劑會清除特定自由基可知：在反應過程中產(chǎn)生的自由基有SO4-·、HO·以及非自由 基1O2，但主要產(chǎn)生的是SO4-·. 而苯酚屬于疏水性化合物，會更容易接近催化劑表面，從而高效清除催化劑表面的自由基[21]，由結果現(xiàn)象看苯酚的抑制作用最為強烈，分析催化劑表面具有大量的SO4-·. 由此可知TeNRs在催化PMS 降解Ponceau S 的過程中，無論在催化劑表面還是液相，SO4-·都起到了主要作用.

為了進一步分析Ponceau S 的降解機制，實驗采用UV-Vis 全波長掃描(圖10)對不同時間段TeNRs+PMS+Ponceau S 的反應體系進行掃描以考察染料在降解過程中的結構變化.Ponceau S 在可見區(qū)域520 nm 處有1 個強的吸收峰，即偶氮鍵(―N＝N―)與萘環(huán)共軛發(fā)色體系的吸收峰，近紫外區(qū)259 nm 處吸收峰對應苯環(huán)、萘環(huán)或雜環(huán)不飽和體系[22]. 隨著反應的進行，520 nm 和259 nm 處吸收峰逐漸降低，分別對應偶氮鍵斷裂和苯環(huán)、萘環(huán)開環(huán)等反應.

圖10 Ponceau S 的紫外-可見吸收光譜Fig. 10 UV-Vis absorption spectra of Ponceau S

根據(jù)自由基猝滅的結果可知，在TeNRs 催化PMS 降解Ponceau S 的過程中，SO4-·起到了主要作用，而且結合不同時間降解產(chǎn)物的紫外-可見光譜推測染料Ponceau S 主要的降解機制是由于TeNRs表面豐富的電子轉移過程使其活化PMS 的能力增強，產(chǎn)生的SO4-·破壞了染料的偶氮鍵、苯環(huán)和萘環(huán)結構，從而導致Ponceau S 的降解.

3 結論

本 文 利 用Meyerozyma guilliermondii還 原Te(Ⅳ)，通過分析XRD、TEM-EDS、SEM 和FTIR，證明TeNRs 的成功合成. TeNRs 催化PMS 降解Ponceau S 的實驗結果表明：TeNRs 可提供催化活性位點以活化PMS 降解Ponceau S，4 h 降解率達到92.5%；并且通過自由基猝滅實驗發(fā)現(xiàn)，整個體系中，SO4-·起到了主導作用，從而導致Ponceau S的降解. 故TeNRs 具有良好的催化PMS 氧化降解Ponceau S 的能力，這也為生物化學聯(lián)合處理偶氮染料提供了新的催化策略.