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    外源鯊烯和茉莉酸甲酯對印楝素生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的影響

    2021-10-14 03:19:34謝婷婷王煜煒
    關(guān)鍵詞:印楝素鯊烯前體

    邱 楓,謝婷婷,荀 航,王煜煒,姚 曦,湯 鋒*

    (1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,合肥 230036;2. 國際竹藤中心,國家林業(yè)和草原局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室,北京100102)

    印楝素(Azaidrachtin)是從印楝(Azadirachta indica)中提取的一類四環(huán)三萜類化合物,具有拒食、趨避和干擾昆蟲生長發(fā)育等多種生物活性,是目前開發(fā)最成功的植物源殺蟲劑之一,已在中國、美國、加拿大和印度等多個國家登記使用,市場需求巨大[1]。其主要活性成分是印楝素A和B,約占99%,其中印楝素A的含量最高,活性最強[2-3]。

    目前對印楝素生物合成途徑的認(rèn)識,基本停留于推理和假說層面。Akhila等利用14C標(biāo)記研究印楝素、nimbin及茄堿苷的生物合成途徑,證明甲羥戊酸參與了3種物質(zhì)的合成[4];Seigler等推測2,3-環(huán)氧鯊烯在酶的催化下形成大戟二烯醇,再經(jīng)一系列反應(yīng)生成印楝素A[5]。謝婷婷等利用印楝素A無細(xì)胞合成體系,通過外源添加底物,證明羊毛甾醇不是印楝素A的合成前體,2,3-環(huán)氧鯊烯和丁酰鯨魚醇是印楝素A的前體,nimbin、大戟二烯醇、脫乙酰茄堿苷和茄堿苷極可能是印楝素A的合成前體,并且茄堿苷位于合成途徑較下游的位置[6]。

    印楝素生物合成涉及多種酶促反應(yīng),在植物體內(nèi)開展研究難度極大,進展緩慢。因此,借助現(xiàn)代組學(xué)技術(shù),探討印楝素生物合成途徑,受到科學(xué)家的關(guān)注。Krishnan等完成了印楝基因組的測序,篩選出8個可能與印楝素生物合成相關(guān)的基因[7-8];Kurvadi等通過高通量測序和UPLC技術(shù),獲得150余個可能涉及印楝素合成的候選基因[9]。代謝輪廓分析是連接代謝組學(xué)和功能基因組學(xué)的紐帶,無論是在細(xì)胞和植株層面上實施誘導(dǎo),還是分子水平上操縱基因,都需要知道代謝產(chǎn)物的應(yīng)答表現(xiàn)[10]。

    因此,本研究在前期研究基礎(chǔ)上,以印楝愈傷組織為材料,研究前體(鯊烯)和誘導(dǎo)子(茉莉酸甲酯)處理后印楝代謝輪廓的變化,分析差異代謝產(chǎn)物,探討鯊烯和MeJ對印楝素生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的影響,以期為揭示印楝素生物合成途徑,深入認(rèn)識印楝素代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制提供依據(jù),為利用生物技術(shù)合成和提高印楝素產(chǎn)量提供思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 植物材料 印楝為4年生植株。印楝種子采于中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所元江試驗站(云南省元江縣),常規(guī)消毒后,室溫浸種48 h,播種于營養(yǎng)缽中育苗。實生苗轉(zhuǎn)盆后,置于中國林業(yè)科學(xué)研究院溫室中常規(guī)盆栽。

    1.1.2 主要試劑及儀器 (1)主要試劑。Azadirachtin B、Azadirachtin D、Azadirachtin H、Azadiradoine、Nimbin及Salannin為實驗室分離制備所得[11];Azadirachtin A購于Sigma公司。色譜級甲醇、乙腈及乙醇購于默克公司;超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備得到。

    (2)主要設(shè)備儀器。超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津?qū)嶒炂鞑挠邢薰維himadzu CBM30A);串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI)(美國賽默飛世爾科技有限公司);研磨儀(德國弗爾德儀器設(shè)備有限公司MM 400)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 樣品制備與提取 愈傷組織分別飼喂100 μmol·L-1MeJ、500 μmol·L-1鯊烯及同時飼喂100 μmol·L-1MeJ和500 μmol·L-1鯊烯,培養(yǎng)24 h后收集,真空冷凍干燥7 d后備用,以無菌水為對照,每處理重復(fù)3次。

    用研磨儀按30 Hz的頻率,將凍干后的愈傷組織樣品研磨1.5 min,至粉末狀。稱取100 mg樣品粉末,加1.0 mL 70%甲醇,4 ℃靜置提取24 h;10 000 g離心10 min,收集上清液,經(jīng)吸附柱(CNWBOND Carbon-GCB SPE,250mg,3mL)和微孔濾膜(0.22 μm)過濾,待檢測。

    1.2.2 檢測條件 (1)色譜條件。Waters Acquity UPLC HSS T3 C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱,流動相A和B分別為0.04%乙酸水溶液和含0.04%乙酸的乙腈溶液。采用梯度洗脫,梯度設(shè)置為:0 min,A∶B = 95∶5;11.0 min,A∶B = 5∶95;12.0 min,A∶B = 5∶95,12.1~15.0 min,A∶B = 95∶5。流速0.4 mL·min-1,柱溫40℃,進樣量2 μL。

    (2)質(zhì)譜條件。電噴霧正離子電離模式,質(zhì)量掃描范圍50~2 000 Da,碰撞氣為高純氮氣(N2)。電噴霧離子源(ESI)溫度500℃,毛細(xì)管電壓5 500 V,簾氣25 psi,碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。通過去簇電壓和碰撞能優(yōu)化進行掃描檢測。

    1.2.3 定性定量分析 基于武漢邁特維爾生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database)及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫,根據(jù)一級和二級譜信息,去除對數(shù)據(jù)分析有影響的同位素信號和含K+、Na+和NH4+等離子及大分子量物質(zhì)的碎片離子等重復(fù)信號,對代謝物進行定性。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式,以特征離子峰面積進行定量。

    1.2.4 試驗數(shù)據(jù)處理 運用主成分分析法(PCA)進行無監(jiān)督分析,預(yù)判不同處理的整體趨勢,隨后利用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法(OPLS-DA)進行數(shù)據(jù)分析,驗證OPLS-DA模型的擬合程度?;贠PLS-DA結(jié)果,差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)與VIP結(jié)合篩選差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC≥1.5或≤0.66,且VIP值≥1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量及代謝物總體分析

    2.1.1 主成分分析結(jié)果 在PC1維中,MeJ、鯊烯(SS)以及MeJ和鯊烯共處理(MS)樣品與對照組(CK)存在顯著的分離趨勢,表明3種處理代謝物與對照組存在顯著差異(圖1)。SS組與MeJ和MS組之間分離顯著,表明鯊烯對代謝物影響與MeJ存在差異。MeJ、SS、MS和CK4種處理在PC2維上分離顯著。

    圖1 主成分分析結(jié)果Figure 1 Results of principal component analysis

    2.1.2 OPLS-DA分析結(jié)果 MeJ、鯊烯以及MS分別與對照組比較,3組的預(yù)測參數(shù)R2X、R2Y和Q2均接近1,表明模型穩(wěn)定可靠,可以做后續(xù)的差異成分的篩選(圖2)。

    圖2 OPLS-DA分析圖Figure 2 OPLS-DA analysis diagram

    2.1.3 代謝物種類及其分布 基于MWDB數(shù)據(jù)庫及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫,通過質(zhì)譜信息檢索,共鑒定出767種代謝物。442個代謝物分布在初生代謝途徑,其中有機酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和脂質(zhì)3類物質(zhì)數(shù)目最多,分別占初級代謝物的26.7%、21.9%和15.6%。鑒定次生代謝產(chǎn)物287個,其中黃酮類代謝物最多(169個),占次生代謝物的58.9%,萜類代謝物14個。有38個代謝物未得到明確分類(圖3)。

    圖3 代謝物總分布Figure 3 Metabolite profile

    2.2 鯊烯和MeJ對印楝愈傷組織初生代謝的影響

    2.2.1 MeJ對印楝愈傷組織初生代謝的影響 MeJ處理影響印楝52種初級代謝物,27種表達上調(diào),25種表達下調(diào),見圖4(a)。涉及糖類、氨基酸和脂類等8類,其中對有機酸及衍生物(17種)、脂質(zhì)(14種)和氨基酸及衍生物(10種)影響較大。除5種奎寧酸類物質(zhì)外,其余有機酸類均有明顯的增加。MeJ強烈促進脂肪酸十三烷內(nèi)脂的合成,多數(shù)甘油磷脂的代謝明顯提高。L-高瓜氨酸、高精氨酸和N-(3-吲哚乙?;?-L-丙氨酸代謝降低,其余氨基酸類代謝均增強。

    2.2.2 鯊烯對印楝愈傷組織初生代謝物的影響 鯊烯影響49種初生代謝物的合成,其中36種表現(xiàn)為下調(diào),見圖4(b)。共有8類差異代謝物,對有機酸及衍生物影響最大(15種),除3,5-二羥基-3-甲基戊酸、6-氨基己酸、延胡索酸和D-泛酸等4種上調(diào),其余有機酸均受到抑制。13種胺類代謝物受到影響,酚胺類物質(zhì)受到抑制,色胺類物質(zhì)代謝增強。

    2.2.3 鯊烯和MeJ共同作用對印楝愈傷組織初生代謝物的影響 鯊烯和MeJ的協(xié)同作用顯著調(diào)控愈傷組織的初生代謝,影響7類53種初生代謝物,34種表現(xiàn)下調(diào),19種為上調(diào),見圖4(c)。有機酸及衍生物受影響最大(17種),8種表現(xiàn)為上調(diào)。與單獨處理結(jié)果一致,兩者共處理抑制奎寧酸的代謝。其次為胺類物質(zhì)(10種),其中酚胺和色胺類物質(zhì)的代謝受到抑制。10種氨基酸及衍生物受到兩者共同調(diào)控,其中4種氨基酸的代謝上調(diào)。

    圖4 MeJ和鯊烯處理影響初生代謝物分布Figure 4 The distribution of primary metabolites treated with MeJ and squalene

    2.3 鯊烯和MeJ對印楝愈傷組織次生代謝物影響

    2.3.1 MeJ對印楝愈傷組織次生代謝的影響 經(jīng)MeJ處理后,差異次生代謝物有80種,47表達上調(diào),33種下調(diào),包括4種生物堿類、4種萜類和72種苯丙烷類及衍生物。其中黃酮類物質(zhì)最多(47種),大部分受到抑制;其次為酚類物質(zhì)(25種),13種代謝上調(diào)。這與甘草、蒙古黃芪等植物中的研究結(jié)果一致[12-15]。MeJ調(diào)控的4種萜類物質(zhì)為印楝素B、諾米林、葫蘆素E和Azadiradione,其中前3種代謝受到抑制。

    2.3.2 鯊烯對印楝愈傷組織次生代謝物的影響 鯊烯處理后差異次生代謝物共88種,20種上調(diào),68種下調(diào)(圖5)。苯丙烷類及衍生物中差異代謝物最多(80種),其中黃酮類物質(zhì)65種,占74.7%。其次為萜類物質(zhì),包括印楝素A、B、H及Salannin、Nimbin。除印楝素B外,其余物質(zhì)代謝均上調(diào)。

    圖5 MeJ和鯊烯影響次生代謝物分布Figure 5 The distribution of secondary metabolites treated with MeJ and squalene

    2.3.3 MeJ和鯊烯對印楝愈傷組織次生代謝物的共同影響 MeJ和鯊烯對印楝代謝有協(xié)同增效作用。MeJ和鯊烯共處理有79種差異次生代謝物,33種上調(diào),46種下調(diào)。6種萜類物質(zhì)代謝發(fā)生明顯變化,其中印楝素A、Azadiradione和Nimbin代謝上調(diào),印楝素B、諾米林和葫蘆素E代謝受抑制。此外,MeJ和鯊烯的協(xié)同作用對4種生物堿的代謝也有明顯調(diào)控。

    2.4 種檸檬苦素類物質(zhì)的靶向代謝分析結(jié)果

    選取印楝素A、B、D、H及Azadiradione、Nimbin、Salannin等7種檸檬苦素類物質(zhì)進行靶向代謝分析,結(jié)果表明,鯊烯、MeJ以及兩者共存時,均能顯著促進印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成,對印楝素B、D的合成具有抑制作用。鯊烯促進印楝素H的合成,MeJ不僅抑制印楝素H的合成,并能抵消鯊烯的作用(表1)。MeJ和鯊烯處理后印楝素A合成增加,印楝素B、D合成受到抑制,表明其存在競爭關(guān)系。印楝素A和B結(jié)構(gòu)相似,僅丁烯酯部分環(huán)氧結(jié)構(gòu)上的-H和-OH不同[16]。說明MeJ可能通過調(diào)控印楝素B合成后期修飾酶活性,使更多的前體進入印楝素A的代謝流。

    表1 MeJ和鯊烯處理對檸檬苦素類代謝物的影響Table 1 Effects of MeJ and squalene on 7 limonin metabolites

    前人研究發(fā)現(xiàn),紫外燈照射下,印楝粗提物溶液通氧后Salannin和Nimbin可分別氧化為含有印楝素結(jié)構(gòu)和高生物活性的Isosalanninolide和Isonimbinolide,在植物體內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)了此類物質(zhì)[17-18]。謝婷婷等亦發(fā)現(xiàn),以Nimbin和Salannin為底物時印楝素A的產(chǎn)量顯著增加,認(rèn)為兩者是印楝素A的合成前體[6],代謝物差異分析結(jié)果進一步驗證Nimbin和Salannin是印楝素A合成前體。

    Hansen等發(fā)現(xiàn),Azadirone經(jīng)氧化、環(huán)化及質(zhì)子化等反應(yīng),最終可合成Salannin和Nimbin[19]。由于具有特有的氧化模式,Azadiradione和Azadione是許多檸檬苦素類和四環(huán)三萜類化合物的合成前體[20]。Azadiradione合成與印楝素A變化趨勢一致,可推測Azadiradione亦為印楝素A合成前體。

    2.5 鯊烯和MeJ對印楝素合成代謝網(wǎng)絡(luò)的影響

    2.5.1 MeJ和鯊烯對印楝素合成初生代謝網(wǎng)絡(luò)的影響 印楝中碳水化合物代謝為MVA及MEP途徑提供乙酰CoA、丙酮酸和3-磷酸甘油醛。三萜類物質(zhì)的前體主要來自MVA途徑,MVA途徑和MEP途徑在植物體中可通過IPP進行交流,因此兩種途徑均調(diào)控三萜物質(zhì)的合成(圖6)。

    圖6 萜類代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò)Figure 6 Network diagram of terpenoids metabolism

    MeJ和鯊烯影響葡糖酸內(nèi)酯、葡萄糖酸、D-果糖-6-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸等4種糖類物質(zhì)的代謝。葡糖酸內(nèi)酯和葡萄糖酸可通過Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)產(chǎn)生3-磷酸甘油醛,D-果糖-6-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸經(jīng)糖酵解過程生成丙酮酸。乙酰CoA不僅是MVA途徑合成萜類物質(zhì)的前體,也是三羧酸循環(huán)不可或缺的參與者。經(jīng)鯊烯處理后,愈傷組織中延胡索酸和蘋果酸含量有不同程度地增加,而檸檬酸和α-酮戊二酸含量減少,表明TCA循環(huán)增強且向合成更多的乙酰CoA的方向進行,釋放大量的能量,利于印楝素的合成。此外,乙酰CoA還是一種重要的乙?;w[21],從鯊烯到印楝素的合成過程,涉及多步乙?;磻?yīng),大量乙酰CoA的合成有利于鯊烯向印楝素的合成。

    MeJ和鯊烯調(diào)控豆蔻酸的代謝,且多種不飽和脂肪酸產(chǎn)量顯著變化。研究表明,豆蔻酸調(diào)控MVA途徑,不飽和脂肪酸通過提高胞壓和影響酶活促進MVA途徑的代謝[22]。因此MeJ利用調(diào)控部分糖類和脂類的代謝影響印楝素的合成,鯊烯通過部分糖類和脂類的代謝以及TCA循環(huán)影響印楝素的合成。

    2.5.2 MeJ和鯊烯對印楝素合成次生代謝網(wǎng)絡(luò)的影響 鯊烯是植物三萜和固醇類物質(zhì)的共同前體,減少固醇類物質(zhì)的合成有利于鯊烯參與三萜類化合物的合成。MeJ處理后,愈傷組織中印楝素A合成增加,而固醇類物質(zhì)維生素D的含量下降。同時添加MeJ和鯊烯,愈傷組織中維生素D含量仍明顯減少,印楝素A的增加量高于MeJ單獨處理,表明MeJ可通過抑制固醇類物質(zhì)的合成促進印楝素代謝。磷酸吡哆醛是140多種細(xì)胞酶的輔酶,涉及氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶及合成酶6大酶類,在眾多細(xì)胞代謝中不可或缺[23]。印楝素生物合成涉及多種氧化、環(huán)化和異構(gòu)等酶的參與,鯊烯促進磷酸吡哆醛的合成,有利于提高印楝素后期結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)酶的活性。

    綜上所述,MeJ通過促進Entner-Doudoroff pathway反應(yīng),糖酵解等初生代謝,抑制固醇類物質(zhì)合成等次生代謝,進而調(diào)控印楝素的合成。鯊烯除影響Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)和糖酵解外,還通過調(diào)控三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝以及結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)酶的活性,影響印楝素的合成。

    3 結(jié)論

    MeJ和鯊烯顯著影響印楝愈傷組織的代謝活動,MeJ處理后共檢132種差異代謝物,包括52種初生代謝物和80種次生代謝物。MeJ調(diào)控有機酸、脂質(zhì)、氨基酸以及黃酮類和酚類物質(zhì)的代謝,抑制印楝素B、諾米林和葫蘆素E的合成。鯊烯處理檢出137種差異代謝物,32種代謝物表達上調(diào)。靶向代謝組分析表明,MeJ和鯊烯顯著促進印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成,對印楝素B,D的合成具有抑制作用。表明Nimbin和Salannin是印楝素A生物合成途徑的中間代謝物,Azadiradione參與印楝素A的合成。

    基于差異代謝物的分析,繪制了MeJ和鯊烯影響印楝素合成的相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò),MeJ通過促進Entner-Doudoroff pathway反應(yīng),糖酵解等初生代謝,抑制固醇類物質(zhì)的次生代謝,調(diào)控印楝素A的合成。鯊烯影響Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)和糖酵解,通過干預(yù)三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝以及結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)酶的活性影響印楝素A的合成。

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