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    lncRNA SNHG5對(duì)人類下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響及意義

    2022-05-05 10:11:40杜翠萍馮會(huì)杰邱淼欣閆佩毅蔡驍垚
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)結(jié)果顯示細(xì)胞因子

    周 煥, 唐 穎, 杜翠萍, 楊 揚(yáng), 馮會(huì)杰, 邱淼欣, 閆佩毅, 蔡驍垚, 金 姝

    (1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001;2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科,上海 200060;3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200060;4.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,上海 200060)

    下咽癌,又稱喉咽癌,是發(fā)生在梨狀窩、環(huán)狀軟骨后區(qū)、喉咽后壁區(qū)的惡性腫瘤,病理學(xué)類型以鱗狀細(xì)胞癌最為常見(jiàn),約占95%[1],5年總生存率僅為30%~45%[2-3],被認(rèn)為是頭頸部預(yù)后較差的惡性腫瘤之一。小核仁RNA宿主基因5(small nucleolar RNA host gene 5,SNHG5)是長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的一員,其在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)現(xiàn)象。DAMAS等[4]的研究結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌患者SNHG5表達(dá)上調(diào),抑制SNHG5過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ZHAO等[5]研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中SNHG5表達(dá)降低。他們還發(fā)現(xiàn)SNHG5具有關(guān)鍵且強(qiáng)大的調(diào)節(jié)基因活動(dòng)的能力,通過(guò)捕獲細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2參與抑制胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。關(guān)于SNHG5在下咽癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討SNHG5對(duì)人類下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響,為下咽癌的分子診療提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞株來(lái)源

    下咽癌細(xì)胞株FaDu購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(目錄號(hào):TCHu132)。

    1.2 慢病毒制備

    通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(the National Center for Biotechnology Information,NCBI)定位SNHG5為NR_003038.2,委托武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司合成human SNHG5,構(gòu)建pLVX-hSNHG5-ZsGreen-Puro質(zhì)粒,并完成rLV-hSNHG5-ZsGreen-Puro慢病毒和rLVZsGreen-Puro對(duì)照慢病毒的包裝。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及感染

    將FaDu細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)中,在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,鋪至6孔板中,2 mL/孔,細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。在37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右時(shí),每孔加入100 μL滴度為1×108TU/mL的慢病毒進(jìn)行感染。將感染rLV-hSNHG5-ZsGreen-Puro慢病毒的FaDu細(xì)胞作為rLV-SNHG5組,將感染rLV-ZsGreen-Puro對(duì)照慢病毒的FaDu細(xì)胞作為rLV組。

    1.4 穩(wěn)定細(xì)胞系篩選

    感染了慢病毒的2組FaDu細(xì)胞在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h后,更換含10%FBS的DMEM,2 mL/孔,并在每孔中加入0.2 μL嘌呤霉素(10 mg/mL)進(jìn)行篩選。每過(guò)48 h更換1次培養(yǎng)基,持續(xù)篩選1周后獲得2組穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。

    1.5 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)

    將2組穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基,加入1 mL Trizol裂解液(美國(guó)Invitrogen公司),提取總RNA,測(cè)定總RNA濃度。根據(jù)FastKing RT Kit(With gDNase)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄體系(1 μL 總RNA、2 μL 5×gDNA Buffer、2 μL 10×King RT Buffer、1 μL FastKing RT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix,加RNase-Free ddH2O至20 μL),合成互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA),逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:42 ℃ 15 min,95 ℃ 3 min,4℃保存。采用MyCycler PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)和FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,反應(yīng)體系:總體積為20 μL,2×FastFire qPCR PreMix 10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA 2 μL、RNase-Free ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,52 ℃30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,12 ℃ 10 s,4 ℃保存。SNHG5正向引物:5'-CACAGTGGAGCAGCTCTGAA-3',反向引物:5'-CTCGTGGCACTAGCCAGAAA-3';以β-actin為內(nèi)參,正向引物:5'-CTCGCCTTTGCCGATCC-3',反向引物:5'-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3'。

    1.6 RNA鑒定及測(cè)序

    采用2100生物分析儀(美國(guó)Agilent公司)檢測(cè)RNA完整性。RNA樣本送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

    1.7 軟件分析

    采用Subread軟件[6]中的featureCounts工具進(jìn)行基因定量分析。采用DESeq2軟件[7]進(jìn)行基因差異分析。采用ClusterProfile軟件[8]對(duì)差異基因集進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)(包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)部分)、京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路、Reactome通路和疾病本體(Disease Ontology,DO)的富集分析。

    2 結(jié)果

    2.1 RNA提取質(zhì)量

    rLV-SNHG5組和rLV組提取的RNA均有28S、18S、5S條帶,RNA均完整。見(jiàn)圖1。

    圖1 提取的RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

    2.2 rLV-SNHG5組與rLV組SNHG5相對(duì)表達(dá)量的比較

    rLV-SNHG5組中SNHG5相對(duì)表達(dá)量顯著高于rLV組(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

    圖2 rLV-SNHG5組與rLV組中SNHG5相對(duì)表達(dá)量的比較

    2.3 SNHG5對(duì)FaDu細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄能力的影響

    對(duì)2個(gè)組的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析,基因差異分析共篩選出1 070個(gè)差異表達(dá)的基因,其中表達(dá)上調(diào)537個(gè)、表達(dá)下調(diào)533個(gè),見(jiàn)圖3。表達(dá)上調(diào)居前10位的基因分別為L(zhǎng)CP1、NT5E、CTGF、AXL、AKAP12、PXDN、THBS1、4-Mar、TMEM200A和RIPOR3,見(jiàn)圖4。表達(dá)下調(diào)居前10位的基因分別為PKP1、SERPINB13、KLK10、AC011473.4、NOTCH3、CA2、EGLN3、SLC6A8、KRT4和VAV3,見(jiàn)圖5。

    圖3 基因差異分析

    圖4 rLV-SNHG5組與rLV組上調(diào)基因表達(dá)量的比較

    圖5 rLV-SNHG5組與rLV組下調(diào)基因表達(dá)量的比較

    2.4 差異表達(dá)基因的功能分析

    2.4.1 GO富集分析 與rLV組比較,rLVSNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的生物過(guò)程主要包括血管生成、血壓調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)調(diào)節(jié)、前列腺形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分泌負(fù)調(diào)節(jié)等,表達(dá)下調(diào)的基因涉及的生物過(guò)程主要包括酸分泌、離子轉(zhuǎn)運(yùn)的正調(diào)控、表皮發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)攝取和二十醛分泌等;表達(dá)上調(diào)的基因涉及的細(xì)胞組分主要包括中間絲、蛋白細(xì)胞外基質(zhì)、角蛋白絲、細(xì)胞外基質(zhì)和中間絲細(xì)胞骨架等,表達(dá)下調(diào)的基因涉及的細(xì)胞組分主要包括角質(zhì)化包膜和基底外側(cè)質(zhì)膜;表達(dá)上調(diào)的基因涉及的分子功能主要包括糖胺聚糖結(jié)合、受體調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞因子活性、受體配體活性,表達(dá)下調(diào)的基因涉及的分子功能主要包括表皮結(jié)構(gòu)成分和SH3結(jié)構(gòu)域綁定。見(jiàn)圖6。

    圖6 GO富集散點(diǎn)圖

    2.4.2 KEGG通路富集分析 與rLV組比較,rLV-SNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的KEGG通路包括細(xì)胞黏附分子、造血細(xì)胞系、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路和甘露糖型O-聚糖生物合成等,表達(dá)下調(diào)的基因涉及的信號(hào)通路主要包括吞噬體、光傳導(dǎo)、集合管酸分泌、Fcε受體Ⅰ信號(hào)通路和基底細(xì)胞癌等,其中重要的通路主要為細(xì)胞黏附分子和造血細(xì)胞系。見(jiàn)圖7。

    圖7 KEGG富集分析

    2.4.3 Reactome通路富集分析 與rLV組比較,rLV-SNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的Reactome通路主要包括Gα(i)信號(hào)事件、角質(zhì)化、受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體配體結(jié)合和細(xì)胞外基質(zhì)組織等,表達(dá)下調(diào)的基因涉及的Reactome通路主要包括O-連接糖基化、O-聚糖生物合成終止、磷脂酰甘油的?;溨貥?gòu)以及維甲酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等。見(jiàn)圖8。

    圖8 Reactome通路分析

    2.4.4 DO富集分析 與rLV組相比,rLVSNHG5組中表達(dá)上調(diào)的基因涉及的DO主要包括高血壓、偏頭痛、纖維肉瘤、心臟病和不孕等;表達(dá)下調(diào)的基因涉及的DO主要包括呼吸系統(tǒng)疾病、哮喘、巴雷特食管、溶血性尿毒癥綜合征和腎炎等。見(jiàn)圖9。

    圖9 DO功能分析

    3 討論

    lncRNA是一類不具備蛋白質(zhì)編碼能力、長(zhǎng)度>200 nt的RNA,約占全部非編碼RNA的80%。起初,學(xué)者們認(rèn)為lncRNA是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”,是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,不具有生物學(xué)功能[9]。但近年來(lái)的研究表明,lncRNA在細(xì)胞的發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,如參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA甲基化和去甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、mRNA降解和翻譯調(diào)控等[10-11]。本研究結(jié)果顯示,SNHG5可顯著影響人下咽癌細(xì)胞株FaDu的轉(zhuǎn)錄組學(xué)。

    本研究結(jié)果顯示,SNHG5顯著改變了FaDu細(xì)胞中一些基因的轉(zhuǎn)錄能力,如上調(diào)LCP1、NT5E、CTGF、AXL和AKAP12等基因,下調(diào)PKP1、SERPINB13、KLK10、AC011473.4和NOTCH3等基因。JEONG等[12]的研究結(jié)果顯示,NT5E甲基化與乳腺癌的發(fā)生和不良預(yù)后相關(guān)。由此推測(cè)在下咽癌中,SNHGT5可能通過(guò)抑制NT5E的甲基化,導(dǎo)致NT5E表達(dá)上調(diào),從而發(fā)揮抑癌作用。MARTIN-PADRON等[13]的研究結(jié)果顯示,PKP1可通過(guò)增強(qiáng)MYC基因翻譯來(lái)促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,SNHG5可下調(diào)PKP1基因。由此推測(cè)在下咽癌中,SNHG5或能通過(guò)抑制PKP1對(duì)MYC基因翻譯來(lái)發(fā)揮抑癌作用。以上這些推測(cè)尚需進(jìn)行相關(guān)研究來(lái)進(jìn)一步證明。

    本研究結(jié)果顯示,SNHG5影響了FaDu細(xì)胞的GO功能,主要參與了血管生成、血壓調(diào)節(jié)、酸分泌、離子轉(zhuǎn)運(yùn)正調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)、糖胺聚糖結(jié)合、細(xì)胞因子活性、SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合等。WALKER等[14]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)力學(xué)的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)展,推測(cè)SNHG5通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)力學(xué)而發(fā)揮抑癌的作用,但有待進(jìn)一步研究證明。

    本研究結(jié)果顯示,SNHG5可對(duì)FaDu細(xì)胞的信號(hào)通路,如細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路、甘露糖型O-聚糖生物合成等產(chǎn)生影響。MENDONSA等[15]的研究結(jié)果顯示,鈣黏蛋白作為一種鈣依賴性的細(xì)胞黏附分子,其表達(dá)的缺失可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。根據(jù)本研究KEGG通路富集分析結(jié)果,推測(cè)在下咽癌中,SNHG5可能通過(guò)增加細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生來(lái)抑制了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

    本研究Reactome通路富集分析結(jié)果顯示,SNHG5主要影響Gα(i)信號(hào)事件、G蛋白偶聯(lián)受體配體結(jié)合、O-連接糖基化以及維甲酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)等。BURCHELL等[16]的研究結(jié)果顯示,O-連接糖基化與乳腺癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展密切相關(guān)。因此,SNHG5可能通過(guò)抑制O-連接糖基化來(lái)發(fā)揮抑癌作用。

    本研究結(jié)果還顯示,SNHG5涉及的DO功能包括高血壓、偏頭痛、纖維肉瘤、巴雷特食管等。有研究結(jié)果顯示,巴雷特食管是食管腺癌的主要危險(xiǎn)因素[17],由此推測(cè)SNHG5可能通過(guò)抑制巴雷特食管的形成來(lái)發(fā)揮抑癌作用。

    綜上所述,SNHG5可影響FaDu細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué),包括基因轉(zhuǎn)錄能力、GO功能、KEGG信號(hào)通路、Reactome通路和DO功能,但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果可為下咽癌的分子診斷及治療研究提供參考。

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