人參皂苷Rg1對(duì)幼齡大鼠缺氧缺血性腦損傷和神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用

張明曉，方 峰，楊 艷，范俊利，袁 鵬

（1.洛陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河南洛陽(yáng) 471000；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南洛陽(yáng) 471000；3.天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，天津 300000）

缺氧缺血性腦損傷是全世界兒童神經(jīng)障礙和死亡的主要病因之一，常見(jiàn)于足月兒和早產(chǎn)兒，若治療不及時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致兒童發(fā)育遲緩、智力低下、癲癇甚至腦癱等后遺癥[1]。研究表明，缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制是缺氧缺血引起腦組織谷氨酸大量釋放并作用于突觸后神經(jīng)元谷氨酸受體，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，引起細(xì)胞內(nèi)鈣過(guò)量產(chǎn)生，從而誘發(fā)腦組織損傷和神經(jīng)元死亡[2]。人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分，在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-4]。雷勛明[5]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1能有效改善缺氧缺血性腦損傷小鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力。但人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷和神經(jīng)元凋亡中的作用機(jī)制研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探索人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷和神經(jīng)元凋亡中的調(diào)控作用，初步了解人參皂苷Rg1的保護(hù)作用機(jī)制，為人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器人參皂苷Rg1（純度≥98%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司（批號(hào)：wkq00470）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：CO105S）、TUNEL染色試劑盒購(gòu)自Thermo公司（批號(hào)：KHO1001）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（批號(hào)：RAB0302、RAB0308、RAB0331）；丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：GL2091）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：BC0175）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；尼氏染色液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)：DK0022100），兔單克隆抗體Bax（EPR18283）、兔單克隆抗體Bcl-2（EPR17509）、兔抗鼠單克隆抗體cas-3（EPR18297）、兔單克隆抗體cas-9（EPR18868）以及對(duì)應(yīng)的山羊抗小鼠IgG（HRP）二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，RM2016），組織攤片機(jī)（浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本尼康，Eclipse E100），脫色搖床（Ser?vicebio，TSY-B），掌上離心機(jī)（Servicebio，MX-F），酶標(biāo)儀（Rayto，RT-6100），移液槍（Dragon，KE0003087/KA0056573），臺(tái) 式 高 速 離 心 機(jī)（DRAGONLAB，D3024R）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與建模50只清潔級(jí)新生Wistar雄性大鼠（體質(zhì)量10～15 g）由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0033。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用嚴(yán)格遵守3R原則并經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)IACUC：LYZYJSXYYXY-20190201。每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴(yán)格、規(guī)范的卡片登記管理，24℃條件下封閉群養(yǎng)。將50只大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組、模型組（HIBD）、HIBD+10 mg/kg人參皂苷Rg1、HIBD+20 mg/kg人參皂苷Rg1、HIBD+40 mg/kg人參皂苷Rg1 5組，每組10只，參照文獻(xiàn)[6-7]采用Rice-Vannucci法建立缺氧缺血性腦損傷模型，大鼠結(jié)扎左頸總動(dòng)脈后置于80 mL/L O2、35℃封閉容器中2 h，本實(shí)驗(yàn)中大鼠成模率為90%。造模成功后，模型加藥組參照文獻(xiàn)[8-9]分別腹腔注射10、20、40 mg/kg的人參皂苷Rg1，健康對(duì)照組和模型組同時(shí)腹腔注射等量的生理鹽水，每天1次，持續(xù)2周。待跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)束后，立即采用斷頭法處死大鼠并取腦組織，海馬腦組織和大腦皮質(zhì)用40 g/L多聚甲醛固定用于染色實(shí)驗(yàn)，中央前回腦組織部分置于?80℃冰箱中凍存用于后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。

1.2.2跳臺(tái)試驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)和記憶能力記錄各組大鼠首次由通電銅柵找到安全臺(tái)所需時(shí)間即反應(yīng)時(shí)間，動(dòng)物跳下圓臺(tái)次數(shù)即錯(cuò)誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)測(cè)試成績(jī)。24 h后直接將各組大鼠置于安全臺(tái)上，同時(shí)銅柵通電，記錄小鼠第一次從臺(tái)上跳至銅柵的時(shí)間即潛伏時(shí)間，動(dòng)物跳下圓臺(tái)次數(shù)即錯(cuò)誤次數(shù)作為記憶測(cè)試成績(jī)，結(jié)果取平均值。

1.2.3干濕重法檢測(cè)腦含水率和腦指數(shù)采用腦組織干濕重法檢測(cè)腦含水率、腦指數(shù)，斷頭法處死大鼠，取出大腦，剝?nèi)ツX膜、小腦和腦干，用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖清洗，濾紙吸干并稱取腦質(zhì)量。取左腦并稱取濕質(zhì)量；隨后置于70℃烘箱中干燥24 h，取出并稱取左腦干質(zhì)量，計(jì)算腦含水率、腦指數(shù)。腦含水率（%）=（左腦濕質(zhì)量?左腦干質(zhì)量）/左腦濕質(zhì)量×100%；腦指數(shù)（%）=腦質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.4HE染色觀察腦組織病理?yè)p傷斷頭法處死大鼠，取出大腦，40 g/L多聚甲醛固定腦組織，石蠟包埋切片；經(jīng)脫蠟、水化后，行HE染色；光鏡下拍照并觀察記錄組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5TUNEL染色觀察腦組織細(xì)胞凋亡斷頭法處死大鼠并迅速取出大腦皮質(zhì)于40 g/L多聚甲醛溶液中充分固定，48 h后脫水、浸蠟、石蠟包埋；按照TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色；凋亡細(xì)胞即陽(yáng)性細(xì)胞在光鏡下呈棕黃色或棕褐色，非凋亡細(xì)胞即陰性細(xì)胞呈藍(lán)色。

1.2.6尼氏染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡斷頭法處死大鼠并迅速取出腦組織，石蠟包埋切片，二苯甲脫蠟3次，每次10 min，依次放入無(wú)水乙醇5 min、900 mL/L乙醇2 min、700 mL/L乙醇2 min、蒸餾水2 min，尼氏染色液染色3 min，蒸餾水洗滌2次，950 mL/L乙醇5 s，950 mL/L乙醇脫水2次（2 min/次），二甲苯透明5 min，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察，尼氏小體呈藍(lán)紫色或深藍(lán)色。

1.2.7Western blotting檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)取右側(cè)腦組織研磨均勻，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取腦組織總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定腦組織蛋白濃度，每孔上樣20 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)模、脫脂奶粉封閉，加入cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2兔單克隆抗體（1∶200），4℃孵育搖床過(guò)夜?；厥找豢?，加入按比例稀釋HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗（1∶4 000），室溫孵育120 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光法于暗室下曝光顯影（ACTIN作內(nèi)參）。將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件分享吸光度值。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.8MDA和SOD含量檢測(cè)斷頭法處死大鼠并取腦組織，腦組織勻漿離心取上清，采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定MDA含量，MDA與硫代巴比妥酸在酸性條件下煮沸縮合，生成紅色化合物，此化合物在波長(zhǎng)532 nm處有最大吸收峰，其吸光度與MDA含量呈正比；羥基法測(cè)定SOD含量，超氧陰離子自由基(O2－)能氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，在550 nm處有最大吸收峰，其吸光度與SOD活性呈反比。

1.2.9ELISA法檢測(cè)外周血中IL-6、IL-4、iNOS含量 收集外周血，4℃、3 000 r/min離心25 min，收集上清液，按照E L I S A試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-6、iNOS和IL-4含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠腦功能、腦含水率和腦指數(shù)的影響與健康對(duì)照組相比，模型組HIBD幼齡大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)顯著增多（P＜0.05），腦含水率和腦指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)、腦含水率和腦指數(shù)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.674、2.075、3.520，P=0.182、0.195、0.127），20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)犯錯(cuò)次數(shù)、腦含水率和腦指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可改善HIBD幼齡大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，降低腦組織水腫。

圖1 人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠腦組織功能的影響Fig.1 The effect of Rg1 on brain tissue function of HIBD young mice

2.2 人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠腦組織病理?yè)p傷的影響HE染色檢測(cè)腦組織病理?yè)p傷程度，結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核固縮破裂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重。與模型組相比，10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織病理?yè)p傷程度無(wú)明顯差異，20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中細(xì)胞胞質(zhì)空泡化數(shù)、細(xì)胞核固縮破裂程度顯著減少，未見(jiàn)炎性細(xì)胞，腦組織接近正常生理結(jié)構(gòu)（圖2）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1緩解HIBD幼齡大鼠腦組織病理?yè)p傷。

圖2各組幼齡大鼠腦組織HE染色Fig.2 HE staining of brain tissue of young rats in each group(×400)

2.3 人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響與健康對(duì)照組相比，模型組HIBD幼齡大鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（棕黃色或棕褐色）顯著增多（P＜0.05）。與模型組相比，10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異（F=1.601，P=0.265），20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組幼齡大鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可以減輕HIBD幼齡大鼠腦組織細(xì)胞凋亡（圖3）。

圖3各組幼齡大鼠腦組織TUNEL染色結(jié)果Fig.3 Brain tissue apoptosis of young rats in each group（×400）

2.4 人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠神經(jīng)元凋亡的影響健康對(duì)照組幼齡大鼠神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)較完整，多數(shù)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞尼氏小體明顯，著色清晰可見(jiàn)（紫藍(lán)色或深藍(lán)色）。與健康對(duì)照組相比，模型組神經(jīng)元分布少且結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核濃縮，基本上看不見(jiàn)細(xì)胞尼氏小體，平均吸光度值明顯減小（P＜0.05）。與模型組相比，10 mg/kg人參皂苷Rg1組尼氏小體和平均吸光度值無(wú)顯著差異（F=5.673、5.218，P=0.842、0.0817），20、40 mg/kg人 參 皂 苷Rg1組細(xì)胞排列逐漸整齊，細(xì)胞形態(tài)也逐漸正常，層次明顯，尼氏小體明顯增多，著色清晰，平均吸光度值顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可以抑制HIBD幼齡大鼠神經(jīng)元凋亡，緩解神經(jīng)元損傷（圖4）。

2.5 人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠腦組織中凋亡蛋白表達(dá)的影響與健康對(duì)照組相比，模型組HIBD幼齡大鼠腦組織高表達(dá)Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9（P＜0.05）。與模型組相比，10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（F=3.067、5.439、4.330，P=0.092、0.070、0.086），20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋 白 表 達(dá) 顯 著 下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可以抑制腦組織凋亡蛋白表達(dá)，減少HIBD幼齡大鼠腦組織細(xì)胞凋亡。

2.6 人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織中MDA含量異常升高，SOD含量減少（P＜0.05）。與模型組相比，10 mg/kg人參皂苷Rg1組大鼠腦組織中MDA和SOD含量無(wú)顯著差異（F=5.360、6.102，P=0.078、0.061），20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中MDA含量顯著降低，SOD含量增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1可以抑制HIBD幼齡大鼠腦組織氧化應(yīng)激，緩解腦組織損傷（圖6）。

圖6 各組幼齡大鼠腦組織MDA、SOD含量變化Fig.6 Changes in MDA and SOD contents in brain tissue of young rats in each group

圖4各組幼齡大鼠神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果Fig.4 Nissl body staining of neurons in young rats of each group(×200)

圖5各組幼齡大鼠腦組織凋亡蛋白表達(dá)Fig.5 The expression level of apoptotic protein in the brain tissue of young rats in each group

2.7人參皂苷Rg1對(duì)HIBD幼齡大鼠炎癥因子表達(dá)水平的影響與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠外周血中IL-6、iNOS和IL-4含量均升高（P＜0.05）。與模型組相比，10 mg/kg人參皂苷Rg1組大鼠外周血中IL-6、iNOS、IL-4含量無(wú)顯著差異（F=4.802、5.750、3.011，P=0.081、0.074、0.125），20、40 mg/kg人參皂苷Ra1組大鼠外周血中IL-6和iNOS含量顯著下調(diào)，IL-4含量上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1通過(guò)上調(diào)HIBD幼齡大鼠腦組織中促炎因子表達(dá)，下調(diào)抗炎因子表達(dá)，緩解腦組織損傷（圖7）。

圖7各組幼齡大鼠外周血中炎癥因子含量Fig.7 Inflammatory factors in the peripheral blood of young rats in each group

3 討 論

缺氧缺血性腦損傷常伴隨著嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷，缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時(shí)，釋放大量的活性氧和活性氮，進(jìn)而引起神經(jīng)元退化和死亡，影響腦組織和神經(jīng)元正常功能[10]。減少腦組織細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是改善缺氧缺血性腦損傷和神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Rg1具有抗衰老、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激和抗炎等作用[11-14]，但未見(jiàn)人參皂苷Rg1在成年或老年大鼠缺氧缺血性腦損傷中作用的研究報(bào)道。本研究通過(guò)建立缺氧缺血性腦損傷幼鼠模型，探究人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦組織功能和神經(jīng)元凋亡中的作用。

缺氧缺血性腦損傷誘發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)致使神經(jīng)元炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量的炎癥因子和氧化中間產(chǎn)物致使神經(jīng)元損傷。缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時(shí)，腦組織功能受損嚴(yán)重，大量腦組織細(xì)胞凋亡并伴隨炎癥反應(yīng)[15-17]。已有研究表明，人參皂苷Rg1通過(guò)多種信號(hào)通路在組織損傷和多種疾病中發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激和抗炎癥等作用[18-20]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1改善缺氧缺血性腦損傷幼齡大鼠腦組織功能，緩解腦組織損傷，抑制神經(jīng)元凋亡。

Bax、Bcl-2、cas-3和cas-9是細(xì)胞凋亡重要調(diào)控因子，在缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時(shí)，上游細(xì)胞凋亡起始蛋白cas-9誘導(dǎo)并活化下游細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白cas-3，凋亡蛋白cas-3和cas-9被異常激活，使得大腦組織產(chǎn)生大量的cleaved cas-3和cleaved cas-9，并進(jìn)一步執(zhí)行DNA裂解及細(xì)胞凋亡過(guò)程，加重腦組織損傷[21-23]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1顯著上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax、cleaved cas3和cas9蛋白表達(dá)。提示人參皂苷Rg1抑制腦組織細(xì)胞凋亡，緩解幼齡大鼠缺氧缺血性腦損傷。

MDA和SOD在線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，MDA是膜脂過(guò)氧化標(biāo)志物，MDA高表達(dá)促使線粒體膜損傷，抑制三羧酸循環(huán)相關(guān)酶活性，導(dǎo)致機(jī)體組織功能嚴(yán)重受損。SOD在氧化和抗氧化平衡中起調(diào)控作用，在腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，SOD通過(guò)清除超氧陰離子自由基抑制腦組織氧化應(yīng)激超氧化物生成，緩解因氧化應(yīng)激造成的腦損傷[24-25]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)人參皂苷Rg1給藥處理后，缺氧缺血性腦損傷幼齡大鼠腦組織中MDA和SOD蛋白含量明顯減少。說(shuō)明人參皂苷Rg1抑制缺氧缺血性腦損傷氧化應(yīng)激水平，降低腦組織損傷程度。

IL-6和iNOS是炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的促炎因子，參與多種生理病理和細(xì)胞免疫過(guò)程，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，在缺氧缺血性腦損傷中主導(dǎo)負(fù)調(diào)控作用。IL-4是由活性T細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子，在缺氧缺血性腦損傷中抑制促炎因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)腦組織免疫系統(tǒng)[26-27]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1顯著減少促炎因子IL-6和iNOS蛋白含量，增加IL-4蛋白含量。提示人參皂苷Rg1通過(guò)下調(diào)腦組織促炎因子蛋白表達(dá)，緩解幼齡大鼠缺氧缺血性腦損傷。

綜上所述，人參皂苷Rg1通過(guò)抑制腦組織細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在幼齡大鼠缺氧缺血性腦損傷和神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮保護(hù)作用。