張明曉,方 峰,楊 艷,范俊利,袁 鵬
(1.洛陽職業(yè)技術學院醫(yī)學院解剖教研室,河南洛陽 471000;2.河南科技大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科,河南洛陽 471000;3.天津醫(yī)學高等??茖W校解剖教研室,天津 300000)
缺氧缺血性腦損傷是全世界兒童神經障礙和死亡的主要病因之一,常見于足月兒和早產兒,若治療不及時,可能會導致兒童發(fā)育遲緩、智力低下、癲癇甚至腦癱等后遺癥[1]。研究表明,缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病機制是缺氧缺血引起腦組織谷氨酸大量釋放并作用于突觸后神經元谷氨酸受體,導致鈣離子內流,引起細胞內鈣過量產生,從而誘發(fā)腦組織損傷和神經元死亡[2]。人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分,在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調控作用[3-4]。雷勛明[5]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1能有效改善缺氧缺血性腦損傷小鼠學習能力和記憶能力。但人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷和神經元凋亡中的作用機制研究鮮見報道。因此,本研究探索人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷和神經元凋亡中的調控作用,初步了解人參皂苷Rg1的保護作用機制,為人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷的臨床應用提供參考。
1.1 試劑與儀器人參皂苷Rg1(純度≥98%)購自四川維克奇生物科技有限公司(批號:wkq00470);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(批號:CO105S)、TUNEL染色試劑盒購自Thermo公司(批號:KHO1001)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自美國Sigma公司(批號:RAB0302、RAB0308、RAB0331);丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)活性檢測試劑盒(批號:GL2091)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒(批號:BC0175)購自北京百奧萊博科技有限公司;尼氏染色液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號:DK0022100),兔單克隆抗體Bax(EPR18283)、兔單克隆抗體Bcl-2(EPR17509)、兔抗鼠單克隆抗體cas-3(EPR18297)、兔單克隆抗體cas-9(EPR18868)以及對應的山羊抗小鼠IgG(HRP)二抗均購自美國Abcam公司。病理切片機(上海徠卡儀器有限公司,RM2016),組織攤片機(浙江金華市科迪儀器設備有限公司),光學顯微鏡(日本尼康,Eclipse E100),脫色搖床(Ser?vicebio,TSY-B),掌上離心機(Servicebio,MX-F),酶標儀(Rayto,RT-6100),移液槍(Dragon,KE0003087/KA0056573),臺 式 高 速 離 心 機(DRAGONLAB,D3024R)。
1.2 實驗方法
1.2.1實驗分組與建模50只清潔級新生Wistar雄性大鼠(體質量10~15 g)由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0006,使用許可證號:SYXK(京)2017-0033。實驗動物使用嚴格遵守3R原則并經醫(yī)學倫理委員會批準,倫理審批號IACUC:LYZYJSXYYXY-20190201。每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴格、規(guī)范的卡片登記管理,24℃條件下封閉群養(yǎng)。將50只大鼠隨機分為健康對照組、模型組(HIBD)、HIBD+10 mg/kg人參皂苷Rg1、HIBD+20 mg/kg人參皂苷Rg1、HIBD+40 mg/kg人參皂苷Rg1 5組,每組10只,參照文獻[6-7]采用Rice-Vannucci法建立缺氧缺血性腦損傷模型,大鼠結扎左頸總動脈后置于80 mL/L O2、35℃封閉容器中2 h,本實驗中大鼠成模率為90%。造模成功后,模型加藥組參照文獻[8-9]分別腹腔注射10、20、40 mg/kg的人參皂苷Rg1,健康對照組和模型組同時腹腔注射等量的生理鹽水,每天1次,持續(xù)2周。待跳臺試驗結束后,立即采用斷頭法處死大鼠并取腦組織,海馬腦組織和大腦皮質用40 g/L多聚甲醛固定用于染色實驗,中央前回腦組織部分置于?80℃冰箱中凍存用于后續(xù)分子實驗。
1.2.2跳臺試驗檢測學習和記憶能力記錄各組大鼠首次由通電銅柵找到安全臺所需時間即反應時間,動物跳下圓臺次數(shù)即錯誤次數(shù)作為學習測試成績。24 h后直接將各組大鼠置于安全臺上,同時銅柵通電,記錄小鼠第一次從臺上跳至銅柵的時間即潛伏時間,動物跳下圓臺次數(shù)即錯誤次數(shù)作為記憶測試成績,結果取平均值。
1.2.3干濕重法檢測腦含水率和腦指數(shù)采用腦組織干濕重法檢測腦含水率、腦指數(shù),斷頭法處死大鼠,取出大腦,剝去腦膜、小腦和腦干,用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖清洗,濾紙吸干并稱取腦質量。取左腦并稱取濕質量;隨后置于70℃烘箱中干燥24 h,取出并稱取左腦干質量,計算腦含水率、腦指數(shù)。腦含水率(%)=(左腦濕質量?左腦干質量)/左腦濕質量×100%;腦指數(shù)(%)=腦質量/體質量×100%。
1.2.4HE染色觀察腦組織病理損傷斷頭法處死大鼠,取出大腦,40 g/L多聚甲醛固定腦組織,石蠟包埋切片;經脫蠟、水化后,行HE染色;光鏡下拍照并觀察記錄組織形態(tài)學變化。
1.2.5TUNEL染色觀察腦組織細胞凋亡斷頭法處死大鼠并迅速取出大腦皮質于40 g/L多聚甲醛溶液中充分固定,48 h后脫水、浸蠟、石蠟包埋;按照TUNEL染色試劑盒說明書進行染色;凋亡細胞即陽性細胞在光鏡下呈棕黃色或棕褐色,非凋亡細胞即陰性細胞呈藍色。
1.2.6尼氏染色檢測神經元凋亡斷頭法處死大鼠并迅速取出腦組織,石蠟包埋切片,二苯甲脫蠟3次,每次10 min,依次放入無水乙醇5 min、900 mL/L乙醇2 min、700 mL/L乙醇2 min、蒸餾水2 min,尼氏染色液染色3 min,蒸餾水洗滌2次,950 mL/L乙醇5 s,950 mL/L乙醇脫水2次(2 min/次),二甲苯透明5 min,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,尼氏小體呈藍紫色或深藍色。
1.2.7Western blotting檢測凋亡蛋白表達取右側腦組織研磨均勻,用RIPA蛋白裂解液于冰上提取腦組織總蛋白,用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定腦組織蛋白濃度,每孔上樣20 μg,經SDS-PAGE電泳、轉模、脫脂奶粉封閉,加入cas-3、cas-9、Bax、Bcl-2兔單克隆抗體(1∶200),4℃孵育搖床過夜?;厥找豢梗尤氚幢壤♂孒RP標記的對應二抗(1∶4 000),室溫孵育120 min。采用ECL化學發(fā)光法于暗室下曝光顯影(ACTIN作內參)。將膠片進行掃描存檔,PhotoShop整理去色,Alpha軟件分享吸光度值。獨立實驗重復3次,取平均值。
1.2.8MDA和SOD含量檢測斷頭法處死大鼠并取腦組織,腦組織勻漿離心取上清,采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量,MDA與硫代巴比妥酸在酸性條件下煮沸縮合,生成紅色化合物,此化合物在波長532 nm處有最大吸收峰,其吸光度與MDA含量呈正比;羥基法測定SOD含量,超氧陰離子自由基(O2-)能氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色,在550 nm處有最大吸收峰,其吸光度與SOD活性呈反比。
1.2.9ELISA法檢測外周血中IL-6、IL-4、iNOS含量 收集外周血,4℃、3 000 r/min離心25 min,收集上清液,按照E L I S A試劑盒說明書測定IL-6、iNOS和IL-4含量。
1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。多組數(shù)據比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠腦功能、腦含水率和腦指數(shù)的影響與健康對照組相比,模型組HIBD幼齡大鼠跳臺試驗犯錯次數(shù)顯著增多(P<0.05),腦含水率和腦指數(shù)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠跳臺試驗犯錯次數(shù)、腦含水率和腦指數(shù)變化差異無統(tǒng)計學意義(F=2.674、2.075、3.520,P=0.182、0.195、0.127),20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠跳臺試驗犯錯次數(shù)、腦含水率和腦指數(shù)顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1)。結果顯示,人參皂苷Rg1可改善HIBD幼齡大鼠學習和記憶能力,降低腦組織水腫。
圖1 人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠腦組織功能的影響Fig.1 The effect of Rg1 on brain tissue function of HIBD young mice
2.2 人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠腦組織病理損傷的影響HE染色檢測腦組織病理損傷程度,結果顯示,與健康對照組相比,模型組大鼠腦組織結構紊亂,可見大量細胞胞質空泡化、細胞核固縮破裂,炎性細胞浸潤嚴重。與模型組相比,10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織病理損傷程度無明顯差異,20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中細胞胞質空泡化數(shù)、細胞核固縮破裂程度顯著減少,未見炎性細胞,腦組織接近正常生理結構(圖2)。結果顯示,人參皂苷Rg1緩解HIBD幼齡大鼠腦組織病理損傷。
圖2各組幼齡大鼠腦組織HE染色Fig.2 HE staining of brain tissue of young rats in each group(×400)
2.3 人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠腦組織細胞凋亡的影響與健康對照組相比,模型組HIBD幼齡大鼠陽性細胞數(shù)(棕黃色或棕褐色)顯著增多(P<0.05)。與模型組相比,10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠陽性細胞數(shù)無顯著差異(F=1.601,P=0.265),20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組幼齡大鼠陽性細胞數(shù)顯著減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果顯示,人參皂苷Rg1可以減輕HIBD幼齡大鼠腦組織細胞凋亡(圖3)。
圖3各組幼齡大鼠腦組織TUNEL染色結果Fig.3 Brain tissue apoptosis of young rats in each group(×400)
2.4 人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠神經元凋亡的影響健康對照組幼齡大鼠神經元排列整齊,結構較完整,多數(shù)細胞呈圓形或橢圓形,細胞尼氏小體明顯,著色清晰可見(紫藍色或深藍色)。與健康對照組相比,模型組神經元分布少且結構紊亂,細胞核濃縮,基本上看不見細胞尼氏小體,平均吸光度值明顯減小(P<0.05)。與模型組相比,10 mg/kg人參皂苷Rg1組尼氏小體和平均吸光度值無顯著差異(F=5.673、5.218,P=0.842、0.0817),20、40 mg/kg人 參 皂 苷Rg1組細胞排列逐漸整齊,細胞形態(tài)也逐漸正常,層次明顯,尼氏小體明顯增多,著色清晰,平均吸光度值顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果顯示,人參皂苷Rg1可以抑制HIBD幼齡大鼠神經元凋亡,緩解神經元損傷(圖4)。
2.5 人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠腦組織中凋亡蛋白表達的影響與健康對照組相比,模型組HIBD幼齡大鼠腦組織高表達Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9(P<0.05)。與模型組相比,10 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達無顯著差異(F=3.067、5.439、4.330,P=0.092、0.070、0.086),20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋 白 表 達 顯 著 下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖5)。結果顯示,人參皂苷Rg1可以抑制腦組織凋亡蛋白表達,減少HIBD幼齡大鼠腦組織細胞凋亡。
2.6 人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠腦組織氧化應激水平的影響與健康對照組相比,模型組大鼠腦組織中MDA含量異常升高,SOD含量減少(P<0.05)。與模型組相比,10 mg/kg人參皂苷Rg1組大鼠腦組織中MDA和SOD含量無顯著差異(F=5.360、6.102,P=0.078、0.061),20、40 mg/kg人參皂苷Rg1組HIBD幼齡大鼠腦組織中MDA含量顯著降低,SOD含量增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果顯示,人參皂苷Rg1可以抑制HIBD幼齡大鼠腦組織氧化應激,緩解腦組織損傷(圖6)。
圖6 各組幼齡大鼠腦組織MDA、SOD含量變化Fig.6 Changes in MDA and SOD contents in brain tissue of young rats in each group
圖4各組幼齡大鼠神經元尼氏染色結果Fig.4 Nissl body staining of neurons in young rats of each group(×200)
圖5各組幼齡大鼠腦組織凋亡蛋白表達Fig.5 The expression level of apoptotic protein in the brain tissue of young rats in each group
2.7人參皂苷Rg1對HIBD幼齡大鼠炎癥因子表達水平的影響與健康對照組相比,模型組大鼠外周血中IL-6、iNOS和IL-4含量均升高(P<0.05)。與模型組相比,10 mg/kg人參皂苷Rg1組大鼠外周血中IL-6、iNOS、IL-4含量無顯著差異(F=4.802、5.750、3.011,P=0.081、0.074、0.125),20、40 mg/kg人參皂苷Ra1組大鼠外周血中IL-6和iNOS含量顯著下調,IL-4含量上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果顯示,人參皂苷Rg1通過上調HIBD幼齡大鼠腦組織中促炎因子表達,下調抗炎因子表達,緩解腦組織損傷(圖7)。
圖7各組幼齡大鼠外周血中炎癥因子含量Fig.7 Inflammatory factors in the peripheral blood of young rats in each group
缺氧缺血性腦損傷常伴隨著嚴重的神經元損傷,缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時,釋放大量的活性氧和活性氮,進而引起神經元退化和死亡,影響腦組織和神經元正常功能[10]。減少腦組織細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應是改善缺氧缺血性腦損傷和神經元凋亡的關鍵基礎。文獻報道,人參皂苷Rg1具有抗衰老、抗細胞凋亡、抗氧化應激和抗炎等作用[11-14],但未見人參皂苷Rg1在成年或老年大鼠缺氧缺血性腦損傷中作用的研究報道。本研究通過建立缺氧缺血性腦損傷幼鼠模型,探究人參皂苷Rg1在缺氧缺血性腦損傷幼鼠腦組織功能和神經元凋亡中的作用。
缺氧缺血性腦損傷誘發(fā)的氧化應激和炎癥反應致使神經元炎性浸潤,蛋白酶分泌增加,產生大量的炎癥因子和氧化中間產物致使神經元損傷。缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時,腦組織功能受損嚴重,大量腦組織細胞凋亡并伴隨炎癥反應[15-17]。已有研究表明,人參皂苷Rg1通過多種信號通路在組織損傷和多種疾病中發(fā)揮抗細胞凋亡、抗氧化應激和抗炎癥等作用[18-20]。本研究結果顯示,人參皂苷Rg1改善缺氧缺血性腦損傷幼齡大鼠腦組織功能,緩解腦組織損傷,抑制神經元凋亡。
Bax、Bcl-2、cas-3和cas-9是細胞凋亡重要調控因子,在缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時,上游細胞凋亡起始蛋白cas-9誘導并活化下游細胞凋亡執(zhí)行蛋白cas-3,凋亡蛋白cas-3和cas-9被異常激活,使得大腦組織產生大量的cleaved cas-3和cleaved cas-9,并進一步執(zhí)行DNA裂解及細胞凋亡過程,加重腦組織損傷[21-23]。本研究結果顯示,人參皂苷Rg1顯著上調抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達,下調促凋亡蛋白Bax、cleaved cas3和cas9蛋白表達。提示人參皂苷Rg1抑制腦組織細胞凋亡,緩解幼齡大鼠缺氧缺血性腦損傷。
MDA和SOD在線粒體氧化應激反應過程中發(fā)揮著重要作用,MDA是膜脂過氧化標志物,MDA高表達促使線粒體膜損傷,抑制三羧酸循環(huán)相關酶活性,導致機體組織功能嚴重受損。SOD在氧化和抗氧化平衡中起調控作用,在腦組織發(fā)生氧化應激時,SOD通過清除超氧陰離子自由基抑制腦組織氧化應激超氧化物生成,緩解因氧化應激造成的腦損傷[24-25]。本研究結果顯示,經人參皂苷Rg1給藥處理后,缺氧缺血性腦損傷幼齡大鼠腦組織中MDA和SOD蛋白含量明顯減少。說明人參皂苷Rg1抑制缺氧缺血性腦損傷氧化應激水平,降低腦組織損傷程度。
IL-6和iNOS是炎癥反應過程中重要的促炎因子,參與多種生理病理和細胞免疫過程,誘導機體發(fā)生炎癥反應,在缺氧缺血性腦損傷中主導負調控作用。IL-4是由活性T細胞分泌的生長因子,在缺氧缺血性腦損傷中抑制促炎因子產生,調節(jié)腦組織免疫系統(tǒng)[26-27]。本研究結果顯示,人參皂苷Rg1顯著減少促炎因子IL-6和iNOS蛋白含量,增加IL-4蛋白含量。提示人參皂苷Rg1通過下調腦組織促炎因子蛋白表達,緩解幼齡大鼠缺氧缺血性腦損傷。
綜上所述,人參皂苷Rg1通過抑制腦組織細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應在幼齡大鼠缺氧缺血性腦損傷和神經元凋亡中發(fā)揮保護作用。