雙氫青蒿素對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

李 越，董 煒，周曉艷，尹 陽(yáng)，2，肖姍姍，3，何 謙

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710004；2.西電集團(tuán)醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安710002；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院兒科，陜西西安 710038）

乳腺癌是威脅全球女性健康和生存的常見(jiàn)疾病，發(fā)病率已占據(jù)女性惡性腫瘤的首位[1]。目前，對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療仍缺乏明顯的突破，針對(duì)三陰性乳腺癌的治療也缺乏有效的手段。近年研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和抑制血管生成[2-5]，但其抑制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）可以抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)。生物信息學(xué)結(jié)果提示，TGF-β1與CIZ1之間 存 在 蛋白 質(zhì) 相 互作 用 關(guān) 系[6]。因此，本研究將重點(diǎn)研究DHA對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的抑制作用及其分子機(jī)制，為后續(xù)癌癥機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究和三陰性乳腺癌治療靶標(biāo)的探索提供理論基礎(chǔ)，并為研發(fā)青蒿素等天然產(chǎn)物抗腫瘤新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料高侵襲轉(zhuǎn)移性的三陰性乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞系由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科惠贈(zèng)。DHA購(gòu)自合肥巴斯夫生物有限公司（BOSF），重組TGF-β1因子(HEK293 derived)購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，選擇性TGF-β1/Smads通路抑制劑SD208購(gòu)自上海碧云天生物公司（Beyotime），Trizol試 劑 購(gòu) 自 美 國(guó)Thermal Fisher公 司，Prime?ScriptTMRT Reagent kit購(gòu)自大連寶生物公司（TaKaRa），SYBR Green熒光定量super mix購(gòu)自北京全式金生物有限公司(TransGen)，兔抗人CIZ1抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克公司Abclonal，兔抗人TGF-β1及兔抗人snail購(gòu)自 美國(guó)Abcam公司，兔抗 人p-smad2/3及兔抗人t-smad2/3購(gòu)自Cell Signaling Technology，鼠抗人GAPDH購(gòu)自美國(guó)Origene公司。引物（Primer）由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 方法

1.2.1MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含100 mL/L小牛血清的1640培養(yǎng)基中，37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分組，行不同干預(yù)措施。實(shí)驗(yàn)組加入含20、40、60、80、120 μmol/L DHA的完全培養(yǎng)液，對(duì)照組僅為不含藥的完全培養(yǎng)基。每個(gè)藥物濃度有4個(gè)平行復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h或48 h。經(jīng)CCK-8溶液處理后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）和藥物半數(shù)致死量（IC50）。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)DHA對(duì)CIZ1、Snail及TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響藥物處理細(xì)胞48 h后，得到細(xì)胞總RNA并轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，采用熒光定量試劑進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，后運(yùn)行95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。設(shè)計(jì) 的引物如下。CIZ1基 因Primer F：ATATCCAGAGAGGAGTGGAAGG，Primer R：GGCAGATGCGGCAGATATAG；TGF-β1基 因Primer F：CGTGGAGCTGTACCAGAAATAC，Primer R：CACAACTCCGGTGACATCAA；Snail基因Primer F：TCGGAAGCCTAACTACAGCGA，Primer R：AGATGAGCATTGGCAGCGAG；GDAPH基因Primer F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Primer R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。以2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣本平均CT值表示qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4Western blotting檢測(cè)DHA對(duì)CIZ1、Snail及TGF-β1蛋白表達(dá)的影響藥物處理細(xì)胞48 h后，按照總蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取蛋白質(zhì)，將待測(cè)蛋白質(zhì)樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜以及封閉后，加入一抗，4℃過(guò)夜后棄去一抗，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗，室溫孵育2 h后化學(xué)發(fā)光試劑顯色、凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，掃描結(jié)果并通過(guò)軟件分析蛋白條帶。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力選用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將稀釋后的細(xì)胞懸液移入6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁且融合約95%后，在孔內(nèi)進(jìn)行垂直劃線，在各組加入含藥的5 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng) 基：5 ng/mL TGF-β1因 子、5 ng/mL TGF-β1+40 μmol/L DHA、5 ng/mL TGF-β1+80 μmol/L DHA、5 ng/mL TGF-β1+0.5 μmol/L SD208、5 ng/mL TGF-β1+0.25 μmol/L SD208+40 μmol/L DHA。行不同干預(yù)措施后，培養(yǎng)48 h，分別于0、12、24、48 h在倒置顯微鏡下查看劃痕區(qū)并拍照。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力在Transwell小室中添加稀釋好的基質(zhì)膠，37℃孵育過(guò)夜成膠。在小室中加入細(xì)胞懸液，具體分組同1.2.5項(xiàng)所述。下室加入含藥的150 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，行不同處理后繼續(xù)培養(yǎng)16 h，使用結(jié)晶紫進(jìn)行染色觀察。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s）表示，用GraphPad Prism 7.0作圖，運(yùn)用SPSS 18.0軟件計(jì)算分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，3組以上的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；當(dāng)多組（≥3組）間差異總體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，通過(guò)Dunnett法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DHA抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖利用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度DHA對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，選用三陰性乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，細(xì)胞增殖明顯；經(jīng)DHA處理后，細(xì)胞增殖活性受到藥物濃度依賴性抑制（表1），說(shuō)明DHA能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖。24、48 h處理后，DHA抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的IC50分別為57.40、39.28 μmol/L。

表1 DHA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effect of dihydroartemisinin on the proliferation of breast cancer cell MDA-MB-231 (±s，n=4）

表1 DHA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effect of dihydroartemisinin on the proliferation of breast cancer cell MDA-MB-231 (±s，n=4）

與同處理時(shí)間的對(duì)照組比較，**P＜0.01。

?

2.2 DHA抑制乳腺癌細(xì)胞CIZ1、TGF-β1、Snail轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)為探討DHA抑制乳腺癌進(jìn)展的潛在分子機(jī)制，使用qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)DHA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞TGF-β1/Smads信號(hào)通路和核基質(zhì)蛋白CIZ1分子的影響。結(jié)果顯示，DHA能夠在mRNA表達(dá)水平上明顯抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路核心分子TGF-β1、Snail和CIZ1的表達(dá)，且抑制效應(yīng)呈劑量依賴性（圖1A）。40 μmol/L DHA干預(yù)48 h，對(duì)TGF-β1、Snail和CIZ1蛋白表達(dá)水平的抑制率分別為60.18%、59.43%和52.29%（圖1B）。DHA呈劑量依賴性地抑制TGFβ1、Snail和CIZ1蛋白的表達(dá)水平。

圖1 TGF-β1信號(hào)通路和CIZ1參與DHA的抗腫瘤機(jī)制Fig.1 TGF-β1 signaling pathway and the role of CIZ1 as the antitumor mechanisms of dihydroartemisinin

2.3 DHA逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)效應(yīng)多項(xiàng)研究表明，外源施加TGF-β1因子后，腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力均得到增強(qiáng)，這可能與TGF-β1因子誘導(dǎo)EMT過(guò)程促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用有關(guān)[7]。通 過(guò) 添 加5 ng/mL TGF-β1，TGF-β1因 子明顯增強(qiáng)了MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力（圖2）?；贒HA與TGF-β1信號(hào)通路和CIZ1的調(diào)控關(guān)系，本研究進(jìn)一步探討了DHA和TGF-β1通路抑制劑SD208對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移力增強(qiáng)效應(yīng)的影響，以及DHA和SD-208聯(lián)合治療（更低劑量的兩種藥物同時(shí)處理）的應(yīng)用可能性。

Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與TGF-β1處理的高侵襲性 細(xì) 胞 相 比，40、80 μmol/L DHA能 夠 明 顯 抑 制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲（圖2），其侵襲抑制率分別為(21.1±4.1)%、(33.6±3.5)%。結(jié)果表明，DHA以劑量依賴性的方式抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲，逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的高侵襲力現(xiàn)象。而SD-208或聯(lián)合方案均顯示出明顯的侵襲抑制潛能（圖2），對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用分別為(37.0±3.3)%、(52.3±2.5)%。

圖2 對(duì)照組、TGF-β1處理的高侵襲性細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)目的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.2 Quantitative statistical results of the TGFβ1-treated highly invasive cells and corresponding experimental group cells

2.4 DHA逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移力增強(qiáng)效應(yīng)同2.3項(xiàng)所述，外源應(yīng)用TGF-β1因子顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲（圖2）和遷移能力（圖3），提高了乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力。與TGF-β1誘導(dǎo)相比，40、80 μmol/L DHA能夠明顯降低其遷移能力，其遷移抑制率分別為（39.6±5.6）%、(56.6±4.0)%。表明DHA呈劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，發(fā)揮出對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的高遷移力現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)效果。SD-208處理對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞的遷移抑制率為(55.8±4.1)%，而聯(lián)合處理組對(duì)其遷移抑制率為(71.95±2.6)%。表明SD-208或聯(lián)合方案均能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞遷移，聯(lián)合處理組表現(xiàn)出更優(yōu)的抗轉(zhuǎn)移效果。

圖3 對(duì)照組、TGF-β1處理的高遷移性細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)組劃痕面積變化的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.3 Quantitative statistical results of changes in wound area in the TGFβ1-treated high migratory cells and correspond?ing experimental groups

2.5 TGF-β1/Smads通路對(duì)DHA抗轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響如圖4所示，外源添加TGF-β1因子，Smad2/3蛋白的磷酸化水平和Snail蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示細(xì)胞TGF-β1/Smads通路激活；通路抑制劑SD-208處理細(xì)胞，Smad2/3蛋白磷酸化水平和Snail表達(dá)降低。因此，促進(jìn)或抑制TGF-β1/Smads通路活性，使用Western blotting評(píng)估MDA-MB-231細(xì)胞中CIZ1、P-Smad2/3等蛋白表達(dá)水平，從而反映DHA調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。與TGF-β1誘導(dǎo)的高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞相比，DHA能明顯下調(diào)CIZ1和Snail表達(dá)及Smad2/3蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。DHA呈劑量依賴性抑制TGFβ1/Smads信號(hào)通路和CIZ1表達(dá)。SD-208以及聯(lián)合處理組均能明顯抑制CIZ1、Snail、磷酸化Smad2/3蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

圖4 促進(jìn)/抑制TGF-β1通路，Western blotting檢測(cè)DHA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞CIZ1、Smad2/3、Snail蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Promotion/inhibition of the TGF-β1 pathway and the effects of dihydroartemisinin on CIZ1,Smad2/3 and Snail pro?tein levels in MDA-MB-231 cells detected by Western blotting

此外，與對(duì)照組相比，TGF-β1處理明顯增強(qiáng)了MDA-MB-231細(xì)胞CIZ1蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與TGF-β1處理組相比，而SD-208處理則明顯下調(diào)CIZ1表達(dá)（P＜0.01）。提示TGF-β1-Smad信號(hào)通路和CIZ1之間有緊密的調(diào)節(jié)關(guān)系，并且TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移增強(qiáng)現(xiàn)象與TGFβ1/Smads和CIZ1信號(hào)通路密切相關(guān)。

3 討 論

乳腺癌是威脅全球女性健康和生存的常見(jiàn)疾病[1,8]。盡管手術(shù)和放療、化療等治療手段不斷進(jìn)步，但其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍是乳腺癌患者死亡的主要原因，尤其是針對(duì)三陰性乳腺癌的治療尚缺乏有效的手段，成為乳腺癌治療的主要障礙。

DHA、青蒿琥酯是青蒿素的常見(jiàn)衍生物，已成為一種高效、耐受性良好的抗瘧藥[9]。青蒿素及其衍生物的抗癌作用極具應(yīng)用前景，但其作用和分子機(jī)制尚未完全證實(shí)和闡明。研究表明，青蒿素及其衍生物可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA損傷和凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞周期阻滯、抑制腫瘤血管生成、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）過(guò)程等，發(fā)揮一定的抗腫瘤效果[2-5]。青蒿琥酯呈劑量依賴性誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSB），促進(jìn)癌細(xì)胞DHA損傷，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞死亡[10]。在不同的細(xì)胞模型中，青蒿素及其衍生物可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性、線粒體和外源性的Fas受體驅(qū)動(dòng)的凋亡通路。DHA處理肺腺癌ASTC-a-1細(xì)胞，引發(fā)Bax移位和線粒體膜去極化、細(xì)胞色素c釋放，caspase-9/8/3活化，證明了DHA通過(guò)caspase-8/Bid激活和線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。有研究也證明了青蒿素及其衍生物可以在多種腫瘤細(xì)胞系中抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。例如，青蒿琥酯可以明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系侵襲能力，其主要機(jī)制與下調(diào)MMP-2和MMP-7表 達(dá) 有 關(guān)[13]。

研究表明，EMT與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，EMT過(guò)程的出現(xiàn)通常預(yù)示腫瘤惡性改變，并受到Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因 子 和TGF-β等多 通路的調(diào)控[14]。LI等[15]就報(bào)道了DHA能夠明顯抑制Snail、Slug和Twist的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，從而抑制卵巢癌EMT過(guò)程，發(fā)揮出抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用。已有研究證明，青蒿素類化合物在多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中均可以上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平，抑制間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin水平[2,16]，說(shuō)明了DHA對(duì)腫瘤EMT的抑制能力。

DHA等抗癌化合物的廣譜抗癌特性，其分子機(jī)制較復(fù)雜。關(guān)于青蒿素及其衍生物的一些相關(guān)研究集 中 在 其 對(duì)WNT/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT途徑的調(diào)控[2,17-18]。目前看來(lái)，關(guān)于青蒿素及其衍生物調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以及其如何通過(guò)信號(hào)通路調(diào)節(jié)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，還有待進(jìn)一步探索。本課題組前期已經(jīng)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中探討了DHA和TGF-β1信號(hào)通路、核基質(zhì)蛋白CIZ1的調(diào)控關(guān)系[6]。本研究使用了具有更高轉(zhuǎn)移能力的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，從而重點(diǎn)探究DHA抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用及其分子機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移增強(qiáng)效應(yīng)，并且抑制CIZ1、Snail和磷酸化Smad2/3蛋白的表達(dá)水平。

有研究表明，TGF-β1通路主要通過(guò)Smads依賴性途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和EMT等，從而調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移[19]。核基質(zhì)蛋白CIZ1可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展及其惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，高表達(dá)的CIZ1增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力，提示CIZ1可能成為癌癥轉(zhuǎn)移的有效診療靶點(diǎn)[20-21]。在對(duì)其機(jī)制的探索中，ZHANG等[22]表明，CIZ1與轉(zhuǎn)錄因子TCF4相互作用，激活WNT通路，從而上調(diào)通路下游靶點(diǎn)c-Myc、Snail和cyclin D的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究表明，DHA通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路和核基質(zhì)蛋白CIZ1，發(fā)揮抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力的作用。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，核基質(zhì)蛋白CIZ1在TGF-β1誘導(dǎo)后升高，而在TGF-β 1/Smads信號(hào)通路抑制劑干預(yù)時(shí)表達(dá)水平降低，表明TGF-β1/Smads通路與CIZ1具有密切的調(diào)節(jié)關(guān)系，從而初步證實(shí)了TGF-β1/Smads信號(hào)通路與CIZ1蛋白及其級(jí)聯(lián)調(diào)控關(guān)系可能成為調(diào)控三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程的新作用機(jī)制。當(dāng)然，這一發(fā)現(xiàn)仍需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞更便于建立體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移模型，并有利于探討DHA對(duì)三陰性乳腺癌的潛在治療前景。進(jìn)一步研究DHA的抗轉(zhuǎn)移作用和分子機(jī)制，從而明確乳腺癌尤其是三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于腫瘤預(yù)測(cè)、早期診斷及提高治療的成功率有著非常重要的意義。