基于乙酰膽堿酯酶傳感器檢測玉米中黃曲霉毒素B1

趙現(xiàn)鋒， 孫榮欣*， 丁 琳， 孫向陽

（1.河南輕工職業(yè)學院輕化工程系，河南鄭州450011；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品與生物工程學院，河南鄭州450046）

黃曲霉毒素B1（AFB1）是黃曲霉毒素中毒性最強的一種，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍（趙穎等，2018），其廣泛存在于土壤、堅果、谷物中，且在食物烹調(diào)過程中很難裂解，對人們的飲食、健康危害極大，被世界衛(wèi)生組織列為最強的致癌物之一。我國食品衛(wèi)生標準中明確規(guī)定玉米、花生、花生油中黃曲霉毒素B1允許量不得超過20μg/kg（劉冰等，2020；程慧等，2018；沈駿等，2015）。

目前，關(guān)于AFB1的檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等（惠媛媛等，2019；朱超等，2018；王瑞鑫等，2016）。這些方法具有檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點，但其設(shè)備體積大、操作復雜且費時，因此不適合現(xiàn)場的快速檢測。電化學法具有設(shè)備體積小、操作簡單等優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)方法的短板，因此在AFB1的快速檢測方面潛力巨大。

碳球納米復合材料具有比表面積較大、導電性好等優(yōu)點，在電化學傳感器方面應用廣泛，但其分散性不是很理想，這就限制了其優(yōu)良的特性（吳民富等，2020；Yanping等，2019；喻理等，2019；Lingwen Zeng等，2019）。目前關(guān)于AFB1定量分析的電化學方法已有報道，但鮮見關(guān)于氮摻雜碳球負載納米鉑基質(zhì)酶傳感器的報道。本文在碳球的基礎(chǔ)上引入氮元素，改善其分散性，同時為了提高其靈敏度，引入納米鉑粒子，制備氮摻雜碳球負載納米鉑納米復合材料（N-Cs@Pt），并以此為基質(zhì)制備電化學酶傳感器，對AFB1進行定量分析，旨在為玉米中AFB1的快速檢測提供一種新的方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 氯化乙酰膽堿、C3389型乙酰膽堿酯酶、黃曲霉毒素B1：Sigma公司生產(chǎn)；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀：洛陽市化學試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：上海實意化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器 CHI-660E電化學工作站：上海辰華儀器有限公司；JSM-IT800SHL場發(fā)射掃描電鏡：日本電子JEOL；FJD-120超聲波清洗儀：富嘉達超聲波設(shè)備有限公司；移液槍：德國艾本德股份公司

1.3 實驗方法 N-Cs@Pt制備：N-Cs參考Jinhui Tong等（2018）方法制備。取20 mL濃度為0.1 mol/L的檸檬酸鈉溶液，加熱沸騰10 min。在劇烈攪拌條件下加入5 mL濃度為50 mmol/L的H2PtCl6溶液，然后迅速加入10 mL濃度為0.1 mol/L的抗壞血酸溶液，繼續(xù)加熱攪拌30 min，然后于12000 r/min條件下分別用超純水、乙醇反復的離心-洗滌3次，最后將離心產(chǎn)物于60℃條件下真空干燥，即得N-Cs@Pt納米復合材料，備用。

N-Cs@Pt/GCE制備：GCE參考Fang-mei Liu等（2017）、Sujit Deshmukh等（2017）、Huakun Xing等（2016）的方法進行處理。用移液槍準確吸取5μL濃度為1 mg/mL的N-Cs@Pt溶液均勻涂布于GCE表面，然后于25℃條件下干燥，得Cs-N@Pt/GCE，備用。用移液槍分別吸取1μL牛血清蛋白（1.5%）、1μL殼聚糖溶液（1%）和1μL AChE（0.35 U/μL）于0.1 mL的離心管中，超聲分散2 min，然后用移液槍將混合液均勻涂布在Cs-N@Pt/GCE的表面，于0～4℃環(huán)境下干燥，即得N-Cs@Pt/AChE/GCE傳感器。

1.4 樣品處理 以玉米為檢測對象，采取加標法對其進行檢測分析。樣品參照GB/T 18979-2003處理，向處理好的樣品液中加入一定量的AFB1，然后取100μL的濾液置于5 mL的PBS溶液中，使其濃度分別為5、10μg/mL和20μg/mL，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-Cs@Pt的SEM表征 利用掃描電鏡對制備好的N-Cs@Pt進行掃描，結(jié)果見圖1。N-Cs@Pt為球形結(jié)構(gòu)，其表面零散分布著制備好的Pt納米粒子，N-Cs@Pt的粒徑約為900～1000 nm。

圖1 N-Cs@Pt的掃描電鏡圖

2.2 不同傳感器的EIS表征 以10 mmol/L的[Fe（CN）6]3-溶液為電解質(zhì)溶液對不同的傳感器進行交流阻抗（EIS）表征，結(jié)果見圖2。

圖2 不同傳感器的EIS曲線

GCE、N-Cs/GCE、N-Cs@Pt/GCE和NCs@Pt/AChE/GCE的阻抗分別為653.39、145.34、76.94Ω和421.38Ω。修飾N-Cs后其阻抗比GCE降低了77.76%，且N-Cs負載Pt納米粒子后，其阻抗進一步降低了47.06%。這說明NCs@Pt具有良好的導電性，能有效降低傳感器的阻抗，提高傳感器靈敏度，但在N-Cs@Pt/GCE表面負載AChE后其阻抗增加了447.67%，這是因為AChE是生物大分子，為蛋白成分，因此當其負載到傳感器表面后阻抗顯著增加，這也證明AChE已經(jīng)很好的固定到了傳感器表面。

2.3 N-Cs@Pt/AChE/GCE檢測AFB1的機理以pH 7.2的PBS（0.1 mol/L）為支持電解質(zhì)，采用制備好的N-Cs@Pt/AChE/GCE對2.0 mmol/L的ATCl進行差分脈沖（DPV）掃描，然后向其中加入AFB1使其濃度為10μg/mL，抑制10 min然后再對其進行DPV掃描，結(jié)果見圖3。

N-Cs@Pt/AChE/GCE在2.0 mmol/L的ATCl獲得的氧化峰電流（Ip）為2.494μA，經(jīng)10μg/mL的AFB1抑制10 min后，Ip為1.503μA，Ip降低了39.74%，這是因為AFB1能對AChE產(chǎn)生可逆性非共價鍵抑制，影響AChE對ATCl的催化，進而影響Ip，且其抑制程度與AFB1存在一定劑量關(guān)系，據(jù)此可對AFB1進行定量分析。

2.4 分散劑種類 以0.5%殼聚糖為交聯(lián)劑，分別以1μL不同濃度的牛血清蛋白、奈酚和1μL超純水做空白對照，制備傳感器，對2.0 mmol/L的ATCl進行DPV掃描，結(jié)果見圖4。

圖4 分散劑對傳感器的影響

采用的分散劑對傳感器有顯著影響，且不同濃度的分散劑，對傳感器靈敏度的影響存在較大差異。奈酚的最佳濃度為2.0%，最佳濃度下對應的Ip為2.025μA；牛血清蛋白的最佳濃度為1.5%，最佳濃度下對應的Ip為2.512μA，與奈酚相比Ip提高了24.05%。這是因為牛血清蛋白有良好的生物相容性，可以有效防止酶分子的團聚，提高與底物的接觸，進而提高催化效率，奈酚雖然對減緩酶分子的聚集有一定作用，但其為有機溶劑，對酶的活性可能存在一定影響，因此，選取濃度1.5%的牛血清蛋白為分散劑。

2.5 固載方式的選擇 分別采取a：殼聚糖、AChE和牛血清蛋白混合均勻后涂布于電極表面制備傳感器；b：先將AChE和牛血清蛋的混合液涂布于GCE表面，然后再滴加殼聚糖溶液制備傳感器；c：先滴加殼聚糖溶液，然后再將AChE和牛血清蛋的混合液涂布于GCE表面制備傳感器。然后對2.0 mmol/L的ATCl進行DPV掃描，結(jié)果見圖5。

圖5 固載方式對傳感器的影響

采取方式a、b、c所獲得的Ip分別為2.501、1.711、2.246μA，這是因為，a固載方式，既能保證酶分子很好的固定在電極表面，又能保證酶分子與底物的充分接觸催化，所以其獲得的Ip值最大，因此，選取a固載方式制備傳感器。

2.6 酶固載量的優(yōu)化 分別采取0.2、0.25、0.3、0.35 U和0.4 U的AChE制備傳感器對2.0 mmol/L的ATCl進行DPV掃描，結(jié)果見圖6。

圖6 酶固載量對Ip的影響

隨著酶固載量的增加，Ip先增大后減小，這是因為酶是生物大分子，當其適量增加時，對底物的催化作用明顯增強，但當其過量使用時，會導致電極表面的阻抗增大，進而導致Ip減小，因此，酶固載量選取0.35 U。

2.7 抑制時間的選擇 采用制備好的N-Cs@Pt/AChE/GCE對2.0 mmol/L的ATCl進行DPV掃描，記錄氧化峰電流I0，然后向其中加入AFB1使其濃度為10μg/mL，每隔2 min對其進行掃描一次，分別記錄氧化峰電流I2、I4……In。然后計算出其抑制率（抑制率=1-In/I0），結(jié)果見圖7。

圖7 抑制時間對抑制率的影響

隨著抑制時間的延長，抑制率逐漸增加，且在2～10 min內(nèi)增加相對較快，10 min后增加趨勢逐漸減弱，因此，抑制時間選取10 min。

2.8 標準曲線繪制 在最佳實驗條件下，對不同濃度的AFB1進行抑制測定，結(jié)果見圖8。

圖8 AFB1濃度與抑制率間的關(guān)系曲線

AFB1濃度與其對傳感器的抑制率在1～30μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.9618X+30.214，R2=0.9989，檢出限為0.23μg/mL（S/N=3）。

2.9 加標回收率實驗 在最佳實驗條件下，對不同濃度的AFB1進行加標回收率實驗，結(jié)果見表1。

由表1可知，其加標回收率為97.83%～102.88%，與HPLC所得到的97.56%～99.26%一致，說明該方法準確度較高。

表1 AFB1的加標回收率實驗

2.10 穩(wěn)定性研究 將制備好的N-Cs@Pt/AChE/GCE置于0～4℃環(huán)境中保存，每隔7 d對2.0 mmol/L的ATCl進行DPV掃描，研究傳感器的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖9。

圖9 保存時間對N-Cs@Pt/AChE/GCE的影響

隨著儲存時間的延長，N-Cs@Pt/AChE/GCE對底物的催化效果會略為減弱，但6周后其對底物的催化作用仍能達到正常傳感器的95.5%，說明該傳感器的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本實驗制備了N-Cs@Pt納米復合材料，并在此基礎(chǔ)上制備了N-Cs@Pt/AChE/GCE。結(jié)果表明，N-Cs@Pt能顯著改善N-Cs@Pt/AChE/GCE的導電性，提高其靈敏度。利用N-Cs@Pt/AChE/GCE對AFB1進行定量分析，AFB1濃度與其對傳感器的抑制率在1～30μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其加標回收率為97.83%～102.88%，與HPLC所得結(jié)論一致，準確度較高。N-Cs@Pt/AChE/GCE的穩(wěn)定性較好，6周后其對底物的催化作用仍能達到正常傳感器的95.5%。所制備的傳感器簡單、便捷且成本低，為AFB1的快速檢測分析提供了一種新的方案。