酵母硒對鯉魚魚種生長性能、肌肉硒沉積量及抗病能力的影響

劉家星， 陶麗竹， 楊 馬， 陳 健， 李良玉，魏文燕，陳 霞，唐 洪，張小麗，楊壯志

（成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川成都611130）

硒是人和動物機體生長發(fā)育與繁殖所必需的微量元素之一，已有研究證明，硒在機體抗氧化抗應(yīng)激方面有重要作用，還可以促進生長發(fā)育，提高機體免疫力等（Raymond等，2002），是水產(chǎn)動物在代謝、繁殖等方面的重要影響因素之一。硒的形式有兩種，無機礦物質(zhì)鹽類如亞硒酸鈉（Na2SeO3）或者硒酸鈉（Na2SeO4）；有機硒如酵母硒（Seleniumyeast，SY）等。無機硒的生物利用率低，毒性高，易與其他微量元素發(fā)生拮抗作用，且對環(huán)境有較大影響（宋清華等，2011）。酵母硒作為有機硒的代表，是在酵母培養(yǎng)過程中加入無機硒，使硒以有機的形式存在（Korhola，1986），目前主要通過啤酒酵母法生產(chǎn)（魏文燕等，2019）。酵母硒的生物利用率高、毒性小且對環(huán)境污染小，適量添加可以提高魚類生長性能、抗氧化能力、魚體免疫力，并且能夠通過其特有的代謝途徑，以有機的形式沉積在肌肉組織中，是替代無機硒的有效硒源（王美雪等，2017）。目前在鱸魚（Lateolabrax japonicus）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）等水產(chǎn)動物中均有所研究（龍萌，2015；Nugroho，2013；梁萌青，2006）。

本研究在試驗鯉魚魚種的基礎(chǔ)日糧中添加不同水平的酵母硒，研究其對鯉魚魚種生長性能、肌肉硒沉積量及抗病能力的影響，以期為酵母硒在鯉魚健康養(yǎng)殖中的聯(lián)合應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 飼料原料購自樂山市繼東飼料有限責(zé)任公司；亞硒酸鈉（Na2SeO3，分析純，98.5%）購自溫江瑞進特實驗器材公司；酵母硒購自安琪酵母股份有限公司（福邦動物營養(yǎng)事業(yè)）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自溫江博大萬科實驗器材經(jīng)營部。試驗魚選用體重約為30 g/尾的鯉魚魚種，購自成都泉源博帆漁業(yè)科技有限公司，為池塘養(yǎng)殖的當年繁育魚種，規(guī)格整齊、體表無傷、活力較高；試驗用水為成都市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)研究所科研基地蓄水池供水，水源為地下水，經(jīng)曝氣穩(wěn)定后供試驗使用。

1.2 試驗設(shè)計與管理 采用單因子完全隨機設(shè)計，將暫養(yǎng)后的鯉魚魚種隨機分為5個試驗組（A1～A5，A1為空白組）和1個對照組（A6），每組3個重復(fù)，每個重復(fù)60尾魚。A1～A5組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0、0.15、0.30、0.45、0.60 mg/kg的酵母硒（其中硒含量以硒元素計算），對照組在基礎(chǔ)日糧中添加0.60 mg/kg亞硒酸鈉（以硒元素計算）。養(yǎng)殖周期為12周。試驗進行期間，每日投喂2次（9：00、16：00），每次投喂量為每個重復(fù)組魚總重量的3%（根據(jù)具體情況適時調(diào)整投喂量），試驗過程中每2 d對試驗缸底部進行吸底清污，每周定時使用水質(zhì)測量儀及水質(zhì)快速檢測試劑盒對進水和試驗缸中的水進行測定，保證水體溶氧＞7 mg/L，氨氮＜0.02 mg/L，pH維持在7.5～8.5。參考楊馬（2010）、單玲玲（2015）等報道中鯉魚魚種的基礎(chǔ)日糧組成進行本試驗日糧配方設(shè)計，其中基礎(chǔ)日糧的礦物質(zhì)預(yù)混料不含硒添加劑，各試驗組在添加不同類型硒添加劑時通過沸石粉將礦物質(zhì)預(yù)混料調(diào)整至飼料組分的1%。經(jīng)檢測飼料配方符合GB/T 36782-2018《鯉魚配合飼料 魚種配合飼料》相關(guān)的營養(yǎng)成分指標標準，試驗用日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。檢測得知，基礎(chǔ)飼料中硒含量為0.04 mg/kg，測量酵母硒和亞硒酸鈉中的硒含量后，換算每千克日糧中的添加量，使得最終各試驗組日糧的硒含量實測水平接近預(yù)計的添加水平，各試驗組含硒添加劑日糧添加水平及實測水平見表2。

表1 試驗用日糧組成及營養(yǎng)水平%

表2 各試驗組含硒添加劑日糧添加水平及實測水平 mg/kg

1.3 指標測定及方法

1.3.1 生長性能指標 生長性能指標由增重率、特定生長率（SGR）、餌料系數(shù)、凈重率組成，其計算公式如下：

增重率/%=[（試驗?zāi)~總體重-試驗初魚總體重）/試驗初魚總體重]×l00；

特定生長率/%=（ln末重-ln初重）/養(yǎng)殖時間×l00；

餌料系數(shù)=飼料總投喂量/（試驗?zāi)~總體重-試驗初魚總體重）；

凈重率/%=魚去內(nèi)臟體重/魚體重×100。

1.3.2 硒沉積量測定 硒沉積量參照GB 5009.93-2007《食品安全國家標準 食品中硒的測定》第一法“氫化物原子熒光光譜法”進行測定，試樣中硒含量計算公式如下：

式中：X為試樣中硒的含量，mg/kg或mg/L；ρ為試樣溶液中硒的質(zhì)量濃度，μg/L；ρ0為空白溶液中硒的質(zhì)量濃度，μg/L；V為試樣消化液總體積，mL；m為試樣稱樣量或移取體積，g或mL；1000為換算系數(shù)。

1.3.3 攻毒試驗及保護率測定 飼養(yǎng)后第12周進行攻毒試驗，攻毒細菌來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心分離保存的鯉魚源嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），以50倍LD50的細菌濃度進行攻毒，每尾魚腹腔注射0.2 mL，每個試驗組各選取30尾魚進行攻毒，攻毒后連續(xù)觀察14 d，記錄各組鯉魚的臨床癥狀及死亡情況，另分別取瀕死魚體的腎、脾、血液進行接菌培養(yǎng)，同時鑒定病原菌種類。繪制累計死亡曲線并計算相對保護率（RPS），RPS計算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用SPSS 22軟件，以ANOVA方法進行分析，LSD檢驗進行多重比較，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示。P＜0.05時表示兩者差異性顯著，P＜0.01時表示兩者差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母硒對鯉魚魚種生長性能的影響

2.1.1 生長情況 分別在第0、2、4、6、8周對各試驗組魚進行稱重，從表3可以看出，鯉魚魚種的增重隨著日糧中酵母硒添加量水平的提高而逐漸增大，添加水平為0.6 mg/kg酵母硒的試驗組（A5）的平均末重為所有試驗組中最高，為（94.85±10.13）g；除與A4組差異不顯著外（P＞0.05），與其他試驗組均呈極顯著差異關(guān)系（P＜0.01）。A1組平均末重最低。

表3 添加不同組分硒添加劑的鯉魚魚種生長情況（n=3）g

2.1.2 生長性能 由表4可知，添加酵母硒試驗組（A2～A5）的增重率和特定生長率均高于對照組（A6）及空白組（A1）；其中以A5組的增重率（217.89±36.12）%和SGR（2.05±0.2）%/d最高；增重率中A5組與A4組差異顯著（P＜0.05），與其他各試驗組差異極顯著（P＜0.01）；SGR中A5組與A4組差異不顯著（P＞0.05），與其他各試驗組差異極顯著（P＜0.01）。添加酵母硒試驗組的餌料系數(shù)均低于對照組及空白組；其中以A5組的餌料系數(shù)最低，為（1.25±0.15）；其中，A5組與A4、A3組差異不顯著（P＞0.05），與A1、A2、A6組差異顯著（P＜0.05）。凈重率中，添加酵母硒各試驗組之間的差異不顯著（P＞0.05），但均與對照組差異極顯著（P＜0.01），以A4組最高，為（88.12±2.51）%。

表4 添加不同組分硒添加劑對鯉魚魚種生長性能的影響（n=3）

2.2 酵母硒對鯉魚魚種肌肉硒沉積量的影響將鯉魚肌肉組織采樣后送往四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司進行檢測，結(jié)果見表5所示，酵母硒試驗組中，肌肉組織的硒沉積量隨酵母硒添加量的增加而增加，其中，A5組的肌肉硒沉積量在所有試驗組中最大，為（0.47±0.02）mg/kg；A5組除與A6組差異不顯著（P＞0.05）外，與其他各試驗組差異極顯著（P＜0.01）。

表5 添加不同組分硒添加劑對鯉魚魚種肌肉硒沉積量的影響（n=3）mg/kg

2.3 酵母硒對鯉魚魚種抗病能力的影響 攻毒前進行LD50測定，采用改良寇氏法分組試驗并測算出嗜水氣單胞菌的LD50為3.5×106cfu。于飼養(yǎng)后第12周，以50個LD50的劑量進行攻毒，每尾魚注射0.2 mL。攻毒后8 h內(nèi)開始有魚死亡，部分魚表現(xiàn)出典型的出血癥狀，解剖死亡魚觀察可發(fā)現(xiàn)：脾臟，肝臟均充血、出血，體表有不同部位出血。接種死亡魚的血液和腎臟于腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基中，長出一致的細菌菌落，經(jīng)革蘭氏染色和分子鑒定為嗜水氣單胞菌。攻毒期間記錄各時間點死亡情況繪制累積死亡曲線（圖1）。攻毒14 d后計算各組抵抗嗜水氣單胞菌的相對保護率（表6）。根據(jù)結(jié)果可知，試驗魚在接受嗜水氣單胞菌攻毒后，對照組在第12天所有魚均死亡，其余添加不同組分硒添加劑的試驗組均有一定的保護效果，以A5組相對保護率最高，為46.67%。

圖1 嗜水氣單胞菌攻毒后鯉魚累計死亡曲線

表6 嗜水氣單胞菌攻毒后相對保護率

3 討論

日糧中硒的缺乏會抑制魚類的生長，而酵母硒的添加可以提高水產(chǎn)動物的生長性能，是魚類生長發(fā)育必要的元素。其中脫碘酶（DIO）是硒發(fā)揮促進生長作用的重要形式，其能催化4-碘甲腺原氨酸（T4）脫碘形成活性高的3-碘甲腺原氨酸（T3），在合成和調(diào)節(jié)生長激素過程中有重要作用（Arthur等，1990）。此外，酵母硒除可作為硒源使用外，本身還富含多肽、糖類、B族維生素等生物活性物質(zhì)，可以提供多種營養(yǎng)物質(zhì)促進動物生長（譚暢等，2018）。已有研究發(fā)現(xiàn)，在斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）飼料中添加適量酵母硒使其產(chǎn)生顯著的生長優(yōu)勢（Wang等，1997）。在飼料中添加0.3%、0.6%和1.2%的酵母硒可以提高異育銀鯽的生長，并且提高飼料利用率（華雪銘等，2001）。與上述結(jié)果相似，在本試驗中，鯉魚的增重隨著日糧中酵母硒添加量的增加而逐漸增大，在添加水平為0.6 mg/kg時平均末重達到最高，此外，其增重率以及特定生長率均高于亞硒酸鈉添加組。上述研究均能看出，酵母硒的添加對水產(chǎn)動物的生長性能有促進作用。但也有研究表示，添加酵母硒對大口黑鱸的生長性能只是稍有改善，且飼料系數(shù)也隨之提高（李寧，2014）。不同的研究結(jié)果說明，酵母硒的作用對動物的種類、發(fā)育的階段、對硒的吸收等方面有一定的差異。

日糧中添加硒能夠提高硒在動物組織的沉積量，可以在硒攝入不足時，利用體內(nèi)存積的硒，來補充機體生長和代謝的需求。但不同的硒源以及不同程度的攝入量對硒沉積量的影響不同，在不同物種之間都有研究，如酵母硒可以顯著提高湖羊肌肉、肝臟中的硒含量（朱翱翔等，2017），還可以提高雜種野豬血清硒和組織硒的含量（郭新懷，2008）。水產(chǎn)動物中，大西洋鮭的硒沉積量隨飼料硒含量的增加而升高，其中蛋氨酸硒組的全魚沉積量比亞硒酸鈉高（Lorentzen，1994）。這與本研究的結(jié)果一致，在本試驗中，肌肉組織中的硒沉積量隨著飼料中酵母硒添加量的增加而增加，且添加量相同的情況下，酵母硒中硒的沉積量比亞硒酸鈉稍高。由此說明，有機硒較無機硒更有利于硒的沉積。其原因可能與不同硒源的代謝方式有關(guān)。有機硒攝入機體后可以在合成蛋白的過程中替代含硫氨基酸中的硫，固定到蛋白質(zhì)中，進而增加動物機體中的硒含量（馬美蓉，2021）。

硒以硒蛋白的形式在機體的巨噬細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞以及網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞中都有分布（Carlson等，2011）?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)T淋巴細胞、B淋巴細胞的功能發(fā)揮免疫作用，可以促進機體合成抗體IgM、IgG等（李光輝，1999），從而增強免疫功能。此外，還能促進吞噬細胞發(fā)揮吞噬和殺菌等功能。因此，硒的缺乏在一定程度上會影響機體的免疫作用。目前的研究得出，飼料中添加酵母硒可以提高中華鱉白細胞的吞噬活性（劉至治，2006）；可顯著提高異育銀鯽非特異性免疫力（朱春峰，2009）。動物對病原體的抵抗力與其免疫能力密切相關(guān)，本研究的結(jié)果證實了在注射了嗜水氣單胞菌以后，同對照組相比，添加不同組分硒添加劑的試驗組均有一定的保護效果，以添加量為0.6 mg/kg相對保護率最高，為46.67%。這與Wang和Lovell（1997）在斑點叉尾鮰攻毒后，添加0.4 mg/kg酵母硒和0.2 mg/kg蛋氨酸硒能顯著提高存活率的研究結(jié)果相似。除去硒的作用，也有可能是因為酵母細胞壁上酵母多糖的活性成分β-葡聚糖的作用，其也可以促進巨噬細胞吞噬，或通過不同途徑激活體液免疫（郭亮等，2000）。

4 結(jié)論

本試驗條件下，不同水平的酵母硒可以提高鯉魚魚種的生長性能、增加肌肉硒沉積量及提高抗病能力，添加量以0.6 mg/kg為適宜。