干擾ELOVL6基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)及甘油三酯合成的影響

姚大為， 趙淑穎， 趙 欣， 楊春蕾， 李玉鵬， 丁向彬， 馬 毅*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津西青300381；2.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津西青300384；3.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津南開300071）

牛奶不僅能夠提供能量，并且含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素和鈣元素等，是國民飲食的重要營養(yǎng)物質(zhì)來源，其豐富的脂肪酸種類及較多不飽和脂肪酸含量顯現(xiàn)出了較高的營養(yǎng)價值（Demment等，2003）。研究表明，牛奶品質(zhì)與脂肪酸組成和含量有著密切的關(guān)系（Chilliard等，2003）。乳脂代謝過程包括脂肪酸的從頭合成、脂肪酸去飽和、脂肪酸的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)、甘油三酯的合成與降解等。因此，深入了解奶牛乳腺脂代謝調(diào)控機(jī)理，有助于為實(shí)施分子育種措施進(jìn)而改善牛乳品質(zhì)提供理論依據(jù)。

超長鏈脂肪酸延伸酶（ELOVLs）在長鏈脂肪酸合成過程中起關(guān)鍵作用，ELOVL6基因是其中的一員，主要功能是催化C12、C14、C16飽和與不飽和脂肪酸延伸為C18脂肪酸，主要參與脂肪酸延伸和脂酰輔酶A的生物合成（胡忠昌等，2018）。胡忠昌（2018）在轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟中克隆出ELOVL6基因，全長2500bp，編碼區(qū)長801 bp。ELOVL6基因廣泛分布于體內(nèi)的各個組織器官，在脂肪含量較高的組織或器官中高水平表達(dá)，其 余 組 織 或 器 官 表 達(dá) 量 較 低 （Li等，2019）。ELOVL6影響體外培養(yǎng)的小鼠肝臟細(xì)胞中C16和C18脂肪酸的比例，終產(chǎn)物為硬脂酸（C18：0）。硬脂酸在硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）的作用下生成油酸（C18：1，n-9）（Matsuzaka等，2009），進(jìn)而為甘油三酯的合成提供底物。在缺失ELOVL6基因的斑馬魚肝臟中SCD1表達(dá)水平顯著降低，表明ELOVL6基因的缺失可能會減少斑馬魚的脂肪生成（Wang等，2020）。再娜古麗·君居列克（2020）在牛脂肪細(xì)胞中過表達(dá)ELOVL6基因顯著上調(diào)了FABP3和SCD1等乳脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，表明ELOVL6是參與乳脂代謝的重要基因。有研究表明，處于妊娠期的鼠乳腺組織中ELOVL6基因表達(dá)量顯著上調(diào)（Rodriguez-Cruz等，2011）。在人和小鼠中，雌性ELOVL6基因的表達(dá)水平高于雄性，雌二醇和孕酮可以促進(jìn)ELOVL6基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育和功能維持（Schams等，1984）。綜上所述，ELOVL6基因可能通過改變脂肪酸的組成在乳脂代謝中發(fā)揮重要作用。目前，有關(guān)牛乳腺上皮細(xì)胞中的ELOVL6基因在脂質(zhì)代謝中的作用鮮有報(bào)道。

本研究通過克隆得到奶牛ELOVL6基因CDS區(qū)，篩選得到有效siRNA，將有效siRNA轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞，探究其對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)及甘油三酯合成的影響，對進(jìn)一步揭示該基因在乳腺組織脂質(zhì)代謝中的調(diào)控機(jī)制，提高奶牛的生產(chǎn)性能及牛奶質(zhì)量具有重要的指導(dǎo)意義。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動物 奶牛乳腺組織cDNA由山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院饋贈；奶牛乳腺上皮細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院饋贈。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒、LATaqDNA聚合酶、TBGreenRPremixExTaqTMII、限制性內(nèi)切酶（SalⅠ和EcoRⅠ）、pMD19-T載體連接試劑盒，均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNAmarkerⅢ、核酸染料，均購自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、LipofectamineRRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，均購自ThermoFisher公司；甘油三酯檢測試劑盒，購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)。

1.3 主要儀器 Taco核酸自動提取儀（型號為T0124），購自北京華安瑞基生物科技有限公司；熒光定量PCR儀（CFX-96），購自伯樂（中國）有限公司；PCR擴(kuò)增儀（型號為VeritiV255249），購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；多功能酶標(biāo)儀（SuPerMax3100），購自上海閃譜生物科技有限公司；凝膠成像分析儀（型號為GelDocXR），購自北京眾力挽生物科技有限公司；雙人單面超凈工作臺（型號為SW-CJ-2FD），購自上海昕儀儀器表有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 奶牛ELOVL6基因CDS區(qū)克隆 根據(jù)GenBank中牛的ELOVL6基因（NM_001102155）序列，利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（F：5’-ATATGTCAGTGTTGACTTTACAAGAAT-3’；R：5’-CAGTTCCGACACTAGTCAGCTTT-3’）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

以奶牛乳腺組織中cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：PrimeSTARMaX12.5μL、上下游引物各1.0μL、cDNA模板1.0μL、無菌水9.5μL，共25.0μL體系。延伸時間為1min，退火溫度為55℃，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收約800bp的目的條帶并與pMD19-T載體連接，構(gòu)建克隆載體pMD19-T-ELOVL6，轉(zhuǎn)化E.coliTop10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑菌，37℃搖床12h，提質(zhì)粒，SalⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定正確后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

2.2 ELOVL6基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI中 的Blastn（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）進(jìn)行奶牛與其他物種ELOVL6基因核苷酸序列的同源性比對。利用ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）、ExPASyProteomicsServer（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）和TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對奶牛ELOVL6蛋白的相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、蛋白疏水性預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。

2.3 ELOVL6基因siRNA的設(shè)計(jì)與合成 利用Invitrogen公司BLOCK-iTTMRNAiExpress軟件（https：//rnaidesigner.invitro-gen.com/rnaiexpress/）在線設(shè)計(jì)靶向本試驗(yàn)克隆的奶牛ELOVL6基因的CDS區(qū)的siRNA和對照siRNA（表1），并由廣州銳博生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 針對奶牛ELOVL6基因的siRNA序列及對照組siRNA序列

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA的轉(zhuǎn)染 將奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）置于37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為D-MEM/F12、10%胎牛血清、5μg/mL胰島素、10μg/mL表皮生長因子、100μ/mL青霉素、100μ/mL鏈霉素、1μg/mL氫化可的松。每24h換一次液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。siRNA轉(zhuǎn)染時，根據(jù)LipofectamineRRNAiMAX轉(zhuǎn)染說明書配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，避光放置20min，同時轉(zhuǎn)染至對照組和試驗(yàn)組乳腺上皮細(xì)胞中，每組3個重復(fù)。

2.5 有效siRNA的篩選及RT-qPCR檢測干擾ELOVL6基因?qū)θ橹x關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響 轉(zhuǎn)染24h后進(jìn)行換液，48h后用PBS潤洗兩遍，采用Trizol法提取總RNA檢測濃度和純度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板通過RTqPCR檢測ELOVL6基因的表達(dá)量，ELOVL6基因的定量引物見表2，采用2-ΔΔct法進(jìn)行相對定量計(jì)算各組siRNA的干擾效率，篩選出干擾效率最佳的siRNA。

將干擾效率最佳的siRNA轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細(xì)胞，48h后采用Trizol一步法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于RT-qPCR。利用PrimerPremier5.0軟件，根據(jù)NCBI已經(jīng)公布的基因序列設(shè)計(jì)ELOVL6基因的定量引物，其他脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的定量引物參照表2，反應(yīng)體系：TB10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，RNase水6.4μL。反映步驟：95℃預(yù)變性30s，95℃5s，60℃30s，39個循環(huán)，95℃30s，65℃5s，95℃5s。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。采用UXT、MRPL39為內(nèi)參基因。通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表2 實(shí)時熒光定量PCR產(chǎn)物

2.6 檢測干擾ELOVL6基因?qū)δ躺窖蛉橄偕掀ぜ?xì)胞甘油三酯含量的影響 在乳腺上皮細(xì)胞中分別將對照組和干擾組（n=3）siRNA轉(zhuǎn)染后，棄去培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS清洗3次，加入甘油三酯檢測試劑盒中的裂解液室溫輕柔搖晃20min后，用細(xì)胞刮鏟將細(xì)胞碎片和裂解液全部轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行超聲破碎，根據(jù)試劑盒說明書利用酶比色法檢測甘油三酯含量。細(xì)胞中的總蛋白含量使用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行檢測。甘油三酯的總含量使用每孔對應(yīng)的蛋白含量進(jìn)行標(biāo)定校準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 奶牛ELOVL6基因CDS區(qū)的克隆 以奶牛乳腺組織提取的cDNA為模板，通過PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物為約800bp的片段，與預(yù)期結(jié)果基本相符（圖1A）。與pMD19-T載體連接后進(jìn)行雙酶切鑒定（圖1B），得到兩條清晰的條帶，其中一條與目的片段大小一致，確認(rèn)連接成功并進(jìn)行測序。結(jié)果通過Blast比對，確認(rèn)克隆得到牛ELOVL6基因的CDS區(qū)，全長795bp，編碼264個氨基酸，提交至GenBank，登錄號為MW960011。

圖1 ELOVL6基因的克隆與鑒定

3.2 奶牛ELOVL6基因生物信息學(xué)分析 經(jīng)NCBI中Blast進(jìn)行同源性分析后發(fā)現(xiàn)，奶牛ELOVL6基因CDS區(qū)核苷酸序列與牛（NM_001102155.1）、山 羊（NM_001314257.1）、大羚羊（XM_040237469.1）的相似度分別為100%、96.73%、96.35%。ELOVL6蛋白相對分子質(zhì)量為31.28ku，理論等電點(diǎn)為5.94。經(jīng)蛋白疏水性預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白疏水最大值為2.467，最小值為-2.411，具有較強(qiáng)的疏水性（圖2）。主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，具有6個跨膜區(qū)域（圖3）。

圖2 ELOVL6蛋白疏水性分析

圖3 ELOVL6蛋白跨膜區(qū)分析

3.3 奶牛ELOVL6基因有效siRNA序列的篩選及干擾效率檢測 將3對干擾組的siRNA及對照組siRNA分別轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行熒光定量PCR。由圖4可知，3對siRNA均有顯著的干擾效率，其中siELOVL6-003的干擾效率最高，達(dá)到90%以上（P＜0.01）。

圖4 奶牛ELOVL6基因siRNAs序列的干擾效率檢測

3.4 干擾ELOVL6基因?qū)χx相關(guān)基因表達(dá)的影響 將篩選得到的有效siRNA轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細(xì)胞48h后，進(jìn)行總RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板通過熒光定量PCR檢測脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，脂肪酸從頭合成及去飽和相關(guān)基因（ACACA、SREBF1、PPARG、SCD1）、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（FABP3）、甘油三酯合成相關(guān)基因（DGAT1和AGPAT6）、甘油三酯水解相關(guān)基因（HSL）的表達(dá)量顯著降低（圖5）。

圖5 干擾ELOVL6基因?qū)χx相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.5 干擾ELOVL6基因?qū)?xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響 在乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行對照組與干擾組siRNA轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS清洗3次，采用試劑盒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的測定并以每孔對應(yīng)的蛋白含量進(jìn)行標(biāo)定校準(zhǔn)，結(jié)果表明，干擾ELOVL6基因后細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量降低（圖6）。

圖6 干擾ELOVL6基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞中甘油三酯含量的影響

4 討論

在哺乳動物中，脂肪酸合酶（FASN）只能催化C16以下脂肪酸的生成，而不能催化C16以上脂肪酸的延伸。ELOVL6可以將FASN合成的棕櫚酸（C16：0）催化生成硬脂酸（C18：0）。ELOVL6在羊、嚙齒動物中通過改變脂肪酸的合成來影響甘油三酯的合成，對ACACA、FABP3等乳脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)有影響（吳皓，2014；吳敏，2014；Beigneux等，2006；）。然而，目前該酶在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中是否發(fā)揮同樣的作用還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過干擾ELOVL6基因的表達(dá)，驗(yàn)證了ELOVL6在奶牛乳腺上皮細(xì)胞對甘油三酯合成及相關(guān)基因表達(dá)的影響。

ACACA、SREBF1、PPARG等酶參與了脂肪酸的從頭合成（Wu等，2019）。乙酰CoA羧化酶是一種生物素依賴性酶，催化乙酰CoA轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A（Bionaz等，2008），ACACA是其中的一個亞型，在脂肪生成組織中產(chǎn)生，用于從頭合成脂肪酸，被認(rèn)為是控制脂肪酸合成的主要亞型（Witters等，1994）。本研究結(jié)果表明，當(dāng)ELOVL6基因被干擾后，ACACA表達(dá)量的下調(diào)降低了脂肪重新生成的能力，這與Harris（2011）的試驗(yàn)結(jié)果一致。包梅（2021）研究表明，SREBP1是人和動物的脂肪生成調(diào)控因子，通過調(diào)控參與乳脂代謝相關(guān)基因（FASN、SCD1）的表達(dá)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，進(jìn)而影響甘油三酯的合成。吳敏（2014）研究表明，在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中超表達(dá)ELOVL6基因?qū)е耂REBP-1基因表達(dá)量顯著下降。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，干擾ELOVL6基因的表達(dá)顯著下調(diào)SREBP1表達(dá)量，導(dǎo)致其下游靶基因SCD、ACACA等的表達(dá)量也隨之下調(diào)，甘油三酯合成減少，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）是核受體家族的成員，在多種組織和器官中表達(dá)，主要調(diào)控脂肪的合成與代謝（Marion-Letellier等，2016）。在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中的過表達(dá)ELOVL6基因?qū)PARG的表達(dá)量沒有影響，而本研究結(jié)果中干擾ELOVL6基因表達(dá)顯著下調(diào)PPARG的表達(dá)量，與上述結(jié)果不一致，原因可能是在不同的物種中脂肪酸對轉(zhuǎn)錄因子PPARG的調(diào)節(jié)機(jī)制不同。

有研究表明，ELOVL6可為甘油三酯合成提供基質(zhì)，在山羊乳腺上皮細(xì)胞過表達(dá)ELOVL6基因后，甘油三酯濃度增加，在ELOVL6被敲除后降低（Shi等，2017），本試驗(yàn)與上述結(jié)果一致。干擾ELOVL6基因顯著下調(diào)DGAT1、AGPAT6基因的表達(dá)量，表明ELOVL6基因或其底物參與甘油三酯的合成。研究結(jié)果表明，DGAT1與乳脂含量顯著相關(guān)（Pacheco-Pappenheim等，2019；Tzompa-Sosa等，2016；Tabaran等，2015），在牛肌肉細(xì)胞中過表達(dá)DGAT1顯著提高甘油三酯含量（Liu等，2007）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DGAT1酶含量的降低是導(dǎo)致甘油三酯含量減少的原因之一，干擾ELOVL6基因的表達(dá)使得DGATI酶含量降低，進(jìn)而影響甘油三酯的含量。Massimo和Loor（2008）的研究表明，AGPAT6是小鼠、牛、羊等動物甘油三酯合成的關(guān)鍵酶，AGPAT6在牛哺乳期的表達(dá)顯著上調(diào)。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，干擾ELOVL6基因顯著下調(diào)AGPAT6基因的表達(dá)量。油酸（C18：1n-9）是合成甘油三酯的首選底物（Green等，2010），其是在C18：0去飽和后生成的（Stone等，2004）。硬脂酰-CoA去飽和酶-1（SCD1）負(fù)責(zé)脂肪酸的去飽和，由ELOVL6基因催化生成的硬脂酸（C18：0）經(jīng)SCD1去飽和為油酸（C18：1，n-9）。SCD1和ELOVL6在甘油三酯合成過程中處于連鎖反應(yīng)（Marion-Letellier等，2016）。本試驗(yàn)研究表明，干擾ELOVL6基因顯著下調(diào)SCD1基因的表達(dá)量，與上述結(jié)論一致。陳俐靜（2020）認(rèn)為，乳脂代謝是一個合成與分解動態(tài)平衡的過程，HSL基因?qū)⒏视腿ァ⒏视投ズ透视鸵货シ纸鉃橛坞x脂肪酸和甘油，是脂肪分解過程中的限速酶。本試驗(yàn)結(jié)果表明，干擾ELOVL6基因顯著下調(diào)HSL基因的表達(dá)量，可能是為了維持細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的穩(wěn)態(tài)。

從頭合成脂肪酸對甘油三酯的合成具有重要作用，而從外周循環(huán)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中攝取長鏈脂肪酸在乳脂合成中也很重要（Green等，2010）。Bionaz和Loor（2008）認(rèn)為，F(xiàn)ABP3結(jié)合長鏈脂肪酸將其運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，為SCD提供底物。本試驗(yàn)結(jié)果表明，干擾ELOVL6顯著下調(diào)FABP3基因表達(dá)量，可能是由于FABP3可結(jié)合的底物長鏈脂肪酸含量減少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)SCD1的底物含量減少，甘油三酯含量降低。

雖然本研究提供了干擾ELOVL6基因表達(dá)可以降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸合成和甘油三酯合成的試驗(yàn)結(jié)果，但是還是要考慮本試驗(yàn)的一些局限性。應(yīng)該測量其中一些酶的活性，以更好地反映和量化脂肪酸去飽和及延長的速率。ELOVL6基因和與乳脂代謝相關(guān)基因之間的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆了奶牛ELOVL6基因并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。成功篩選到奶牛ELOVL6基因的有效siRNA（干擾效率達(dá)到90%以上），通過RT-qPCR檢測乳脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，通過與對照組對比發(fā)現(xiàn)，干擾ELOVL6基因的表達(dá)可 顯 著 下 調(diào)ACACA、SREBF1、PPARG、SCD1、FABP3、DGAT1、AGPAT6和HSL基因的表達(dá)量，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量顯著降低。該結(jié)果為研究ELOVL6基因在奶牛乳脂合成中的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。