超高效液相測定茶樹水楊酸含量方法的建立

陳蓉，黃小貞2,，趙德剛,3

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽550025；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部DUS中心貴陽分中心，貴州 貴陽550006）

茶樹[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是山茶科山茶屬植物，它是許多國家重要的木本經(jīng)濟作物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶國家[1]。水楊酸（salicylic acid，SA）是一種類似于植物酚類的激素，被認為是介導(dǎo)防御機制的信號分子，在植物抗病防御過程中起著十分重要的作用[2]。大量已有研究表明SA的合成代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了植物生長發(fā)育調(diào)控和脅迫應(yīng)答反應(yīng)[3,4]。另外，內(nèi)源SA含量對茶葉特殊香氣的形成以及病害響應(yīng)有重要作用[5-7]，因此，準確測定茶樹中SA的含量具有重要意義。

目前檢測水楊酸含量的方法有紫外分光光度法和酸堿滴定法[8]、反相高效液相色譜法[9]、分光光度法[10]和在線光纖傳感同步吸收-熒光光譜法[11]等，其中高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography,HPLC）廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)學(xué)和法醫(yī)藥理學(xué)等領(lǐng)域[12]。其包括檢測器、色譜柱、進樣器、色譜泵及控制器、數(shù)據(jù)處理和控制儀器的配置[13]，具有適用性比較廣泛、分析速度很快、分離效率極高、檢測靈敏及樣品回收利用簡單等特點[14]，應(yīng)用前景廣泛。相較于傳統(tǒng)的HPLC，超高效液相色譜法（ultra-efficient liquid chromatography,UPLC）具有分析速度更迅速、分離度更高和靈敏程度更強等優(yōu)點[15]。目前未見報道使用UPLC方法檢測茶樹水楊酸的含量，而且提取茶樹水楊酸的方法還未見報道，所以建立茶樹水楊酸提取和UPLC的檢測方法尤為必要。

本研究選用4個關(guān)鍵可控參數(shù)進行正交試驗，分別為流動相配比、流速、進樣量和柱溫，建立UPLC檢測水楊酸的體系，并通過方法學(xué)實驗檢驗其可靠性，以期為茶樹水楊酸的快速檢測提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器材料

本實驗使用的黔茶一號茶苗購自貴州省湄潭星興茶葉專業(yè)合作社。

主要化學(xué)試劑：甲醇（TEDIA，色譜純）；甲醇（天津富宇，分析純）；磷酸（天津科密歐，色譜純）；乙酸（天津科密歐，色譜純）；水楊酸標準品（ACMEC，純度≥98%）；三氯乙酸（天津科密歐，分析純）；乙酸乙酯（天津富宇，分析純）；環(huán)己烷（天津致遠，分析純）。

主要實驗操作儀器：UItiMate 3000超高效液相色譜儀（Thermo Scientific），Waters POSSIBLETMC18柱（4.6 mm 250 mm，5 um）。

1.2 試驗方法

色譜條件：色譜柱；1%磷酸，1%乙酸-甲醇為流動相；檢測波長276 nm。

樣品處理：精確稱取新鮮葉片組織1.000g、2.000g、3.000g，放入20℃的冰箱冷凍30 min，研磨成勻漿，分別加入20 mL、40 mL和60 mL 90%的甲醇，將其轉(zhuǎn)移至3個干凈的50 mL的離心管中，渦旋震蕩1 min后，以10 000 r/min離心30 min，分別取其上清液，下層再加20mL、40mL和60mL純甲醇，渦旋震蕩1 min后，以10 000 r/min離心30 min，取上清液，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥（水溫40℃），分別用15 mL 5%的三氯乙酸溶解，再加入40 mL的乙酸乙酯和環(huán)己烷1:1混合物萃取。重復(fù)萃取一次，合并有機相，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干（水溫40℃）后，用10mL最佳溶劑定容，用0.45m微孔有機濾膜進行過濾，置于4℃保存。

最佳溶劑確定：分別用1%磷酸、1%乙酸、甲醇和無水乙醇作為溶劑，進行超高效液相。

標準品配制：精確稱取水楊酸標準品20 mg（精確至0.000 1 g）溶于最佳溶劑中，置于50 mL容量瓶中，用最佳溶劑溶解并定容至刻度，搖勻。用0.45m微孔有機濾膜過濾，制成0.400 mg mL-1標準品溶液。

分別從標準品溶液取出1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、16 mL、32 mL于50 mL容量瓶中，用最佳溶劑混勻并定容至刻度。以峰面積為橫坐標，水楊酸濃度為縱坐標，建立線性回歸方程。

正交試驗因素水平：通過設(shè)計正交試驗從而對茶樹中水楊酸的檢測方法進行優(yōu)化，包括考察流速（A）、柱溫（B）、1%磷酸、1%乙酸－甲醇溶液的配比（C）和進樣量（D）對檢測效果的影響，見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 The factor level of the the orthogonal test

加標回收試驗：取同一樣品3份，分別加入標準品溶液（終濃度分別為32g mL-1、64g mL-1、128g mL-1），在同一色譜條件下測定茶樹水楊酸含量，每個條件重復(fù)3次。

加標回收率=［（加標后測得量－樣品量）/加標量］100%。

重復(fù)性和精密度試驗：在優(yōu)化后的色譜條件下，取3份不同濃度標準品溶液，1份標準品溶液分為6份，分別測定茶樹中水楊酸含量，計算6份樣品之間的相對標準偏差（RSD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Microsoft Excel和SPSS Statistics 26.0對數(shù)據(jù)進行處理、分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳溶劑的確定

無水乙醇和流動相1%磷酸、1%乙酸與水楊酸有相同保留時間，且水楊酸難溶于流動相1%磷酸、1%乙酸中，水楊酸在流動相甲醇中溶解性好且沒有相同保留時間，故選擇甲醇作為最佳溶劑。

2.2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)正交試驗設(shè)計表（表2）進行9組試驗，每組重復(fù)3次，均進行標準品含量測定。

水楊酸的濃度設(shè)置為y軸，峰面積設(shè)置為x軸。根據(jù)表2內(nèi)容，繪制9個不同處理組相應(yīng)標準曲線，并通過數(shù)據(jù)求出標準曲線方程（表3）。結(jié)果表明，在9個不同檢測條件下，水楊酸標準品在0.008~0.256 mg mL-1之間且R2在0.998 8~0.999 8之間浮動，濃度及峰面積均呈現(xiàn)出良好的線性相關(guān)關(guān)系。

表3 水楊酸標準曲線（n=9）Table 3 The standard curve of salicylic acid(n=9)

回收率方差和分離度方差分析結(jié)果（表4）表明，4因素對回收率影響均顯著；除了D因素，其他3因素對分離度影響也顯著?；厥章蕵O差（表2）大小為：C＞A＞D＞B，RSD在0.20%~0.55%之間波動，分離度極差分析（表2）順序為C＞A＞B＞D，RSD在0.9%~1.24%之間波動，且均未超過2%。綜合方差分析和極差分析來看，4因素中對分離度影響最大的為C，對回收率影響最大的為A。

表2 正交試驗設(shè)計和結(jié)果（n=6）Table 2 The design and result of the orthogonal test(n=6)

表4 方差分析Table 4 ANOVA analysis

綜合回收率、分離度的極差分析與方差分析，4因素中對回收率和分離度的影響最大為C，最小是B。在4因素中選取最佳檢測方法為A2B1C2D2，流速為0.8 mL min-1，柱溫為30℃，進樣量為3L，1%磷酸、1%乙酸水溶液－甲醇的比為30:70。

2.3 方法學(xué)檢驗

2.3.1 標準曲線與靈敏度 以最佳檢測方法：流速設(shè)置為0.8mL min-1，柱溫設(shè)置為30℃，進樣量為3L，1%磷酸、1%乙酸水溶液－甲醇的配比為30:70。檢測水楊酸標準品溶液，以峰面積為橫坐標，水楊酸濃度為縱坐標作標準曲線圖（圖1）。曲線方程為y=0.062 9x-0.002 1，R2=0.999 8。表明水楊酸在0.008~0.256 mg mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 優(yōu)化條件下水楊酸濃度標準曲線Fig.1 The standard curve of salicylic acid concentration under the optimized conditions

圖2 標準品（A）和樣品（B、C、D）色譜圖Fig.2 The chromatograms of the standard(A)and spmples(B,C,D)

2.3.2加標回收率結(jié)果如表5所示，3濃度條件下加標樣品的回收率均高于96%，RSD=1.04%，RSD低于2%，加標回收試驗結(jié)果表明，此研究方法具有良好的回收率和準確度，符合檢測的所需要求。

表5 回收率結(jié)果（n=9）Table 5 The results of the recovery rates(n=9)

2.3.3 精密度和重復(fù)性取3份不同濃度標準品溶液，1份標準品溶液分為6份，在優(yōu)化條件下，分別測定后，計算6次進樣的平均RSD，分別測得為0.23%、0.15%和0.11%（n=6），都低于2%，結(jié)果表明該方法精密度高，重復(fù)性良好，符合檢測要求。

2.3.4 樣品檢測在優(yōu)化后的色譜條件下，檢測水楊酸出峰時間（即保留時間）為4.323 min，峰型良好，樣品保留時間與標準品的保留時間一致，檢測樣品的濃度分別為0.038 mg g-1（圖B）、0.024 mg g-1（圖D）和0.013mg g-1（圖C）。結(jié)果表明，檢測提取的樣品效果良好，并且出峰時間和標準品的顯示一致，目標峰沒有分叉和拖尾的現(xiàn)象，且分離度高，說明提取的茶樹水楊酸可以被此檢測方法分離出來。

3 討論

水楊酸在植物中含量較少且提取過程易升華[16,17]，因此，影響到分析結(jié)果最主要的因素是樣品的提取[18,19]。趙偉偉、鮑峰偉等[20,21]檢測蓬蘽懸鉤子和煙草中水楊酸含量，采用高效液相色譜法對懸鉤子和煙草中的水楊酸進行了甲醇直接萃取、三氯乙酸萃取、乙醚反萃取和三氯乙酸萃取，但是通過分析結(jié)果顯示，使用甲醇提取的樣品成分比較復(fù)雜，對水楊酸的測定干擾極大；三氯乙酸萃取樣品的目標峰與雜峰不能完全分離。本試驗參照楊國慧、王倩倩等[22,23]提取樹莓葉片和果實中水楊酸的方法，利用有機溶劑甲醇粗提、乙酸乙酯和環(huán)己烷萃取的方法，液相分析結(jié)果表明，提取的茶樹水楊酸峰形良好，雜峰比較少，但是提取的水楊酸溶液中摻雜有色素污染。與王倩倩[23]的報道相似。因此，色素的去除還有待于進一步研究，從而穩(wěn)定水楊酸的檢測方法。

在整個提取茶樹水楊酸和檢測含量過程中，水楊酸易分解的性質(zhì)在一定程度上會給檢測到的結(jié)果帶來誤差。本研究對提取茶樹水楊酸和測定的過程中進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)若在提取過程中操作迅速并且在避光狀態(tài)下，可以有效減少水楊酸分解。提取的水楊酸避光并短時間保存于4℃效果最佳，檢測過程中樣品放置溫度宜在4℃條件下；宜用HPLC或UPLC檢測的物質(zhì)沸點高、熱穩(wěn)定性差且具有生理活性以及相對分子質(zhì)量較大[24]。本研究結(jié)果表明，UPLC的柱效較高，9個處理的回收率均不低于85%，在85.78%~98.91%之間波動，各組的RSD均小于2%。本研究探索出的UPLC檢測方法，不但分離效果與回收率得到了保證，而且低流速流動相的使用和待測物的迅速出峰，最終達到了減少流動相的使用和縮短檢測用時的目的[25]。

本研究通過優(yōu)化色譜條件，發(fā)現(xiàn)此條件下檢測茶樹水楊酸樣品的效果良好，具有出峰時間短、峰型良好且分離度高等優(yōu)點，此UPLC檢測方法可為茶樹水楊酸的快速高效檢測提供參考。