猴頭菌-人參雙向固體發(fā)酵菌質(zhì)顆粒的制備工藝研究

唐敏，王恩鵬，陳雪，李瓊，王歡，陳長寶

（長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春130117）

猴頭菌（Hericium erinaceus）隸屬擔(dān)子門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）紅菇目（Russulales）猴頭菌科（Hericiaceae）猴頭菌屬（Hericium）[1]，具有一定的抗氧化、抗菌、抗衰老、抗腫瘤和神經(jīng)保護、抗炎等作用[2-7]。作為我國傳統(tǒng)的藥食同源的大型真菌，因其具有重要的食用價值和藥用功效而受到了消費者的廣泛喜愛。人參（Panax ginseng C.A.Mey.）為多年生宿根陰性草本雙子葉植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有抗癌、抗腫瘤、抗焦慮和保護心腦血管等活性作用[8,9]，具有顯著的藥理活性和極高的藥用價值。

受猴頭菌及人參的資源限制及市場價格的影響，使這兩種珍貴資源未能得到很好地開發(fā)利用。首先，本實驗從微生物角度出發(fā)，采用新型發(fā)酵技術(shù)，即以猴頭菌為發(fā)酵菌種、人參為藥性基質(zhì)進行雙向固體發(fā)酵。在此發(fā)酵體系中，人參既能為猴頭菌的生長提供營養(yǎng)，又能通過猴頭菌次生代謝產(chǎn)物修飾某些藥效物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而獲得具有更高藥效活性的物質(zhì)；其次，以猴頭菌-人參雙向固體發(fā)酵得到的菌質(zhì)為原材料進行提取，利用提取物進行二次開發(fā)。希望通過這種猴頭菌與人參有機結(jié)合的新型發(fā)酵技術(shù)，可以大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物的食藥用價值，為日后中藥材藥渣的開發(fā)及利用提供新的思路，同時，希望通過該方法可深入挖掘其食藥用價值，實現(xiàn)對猴頭菌及人參的市場再開發(fā)，為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供新途徑及新思路。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料

猴頭菌由吉林省生物研究所張金亭研究員贈予；人參購自吉林省怡生對外貿(mào)易有限公司；葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母粉及瓊脂粉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；木糖醇、糊精、微晶纖維素、淀粉、乳糖及蔗糖購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

SLI-700恒溫培養(yǎng)箱（上海愛朗儀器有限公司）；YXQ-LS-50A壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）；ZQZY-85CNS震蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；BT25S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；A11BS025粉碎機（德國IKA）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

2 試驗方法

2.1 菌種培養(yǎng)及固體發(fā)酵菌質(zhì)提取物的制備

將保存于4℃冰箱的猴頭菌菌種在無菌條件下轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基中，于26℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，待猴頭菌菌絲布滿培養(yǎng)基表面時進行液體菌種的培養(yǎng)。取1 cm大小的菌塊接種于液體培養(yǎng)基中（葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO42 g、MgSO47 H2O 1 g、蒸餾水1 L），在26℃、160 r/min的黑暗條件下進行培養(yǎng)，當(dāng)液體培養(yǎng)基中含有大量黃色菌球時，終止液體發(fā)酵。

將人參藥材粉碎，過篩裝瓶，加適量水，121℃高壓滅菌30 min，待藥性基質(zhì)冷卻至室溫后，將液體菌種接至人參藥性基質(zhì)中，避光培養(yǎng)。當(dāng)猴頭菌菌絲布滿整個藥性基質(zhì)且形成明顯的菌蕾結(jié)構(gòu)時，即為發(fā)酵終點。取出發(fā)酵菌質(zhì)，40℃烘干，密封保存。稱取適量上述固體發(fā)酵菌質(zhì)，采用水煎煮法對其進行提取、濃縮，得菌質(zhì)浸膏（浸膏相對密度約為1.3），備用。

2.2 顆粒劑的制備工藝

采用濕法制粒，準(zhǔn)確稱取發(fā)酵菌質(zhì)提取物1 g，輔料適量，混勻，制軟材，過14目篩進行制粒，將濕顆粒置于60℃烘箱烘干2 h后，利用藥典1號篩與5號篩進行整粒，得菌質(zhì)顆粒劑，將制備好的顆粒劑裝入自封袋中，置于干燥器中保存。

2.2.1 矯味劑用量由于猴頭菌-人參發(fā)酵菌質(zhì)自身具有獨特的味道，為改善菌質(zhì)顆粒的口感，本實驗分別選用蘋果、葡萄、大棗和山楂4種水果，經(jīng)熱水提取、濃縮，得到相對應(yīng)的4種果味浸膏（浸膏相對密度為1.18~1.2）。以上述實驗室自制的4種水果浸膏與菌質(zhì)浸膏分別按0.5:1、1:1、1.5:1、2:1和3:1的比例逐一進行混合，以感官評價為評價標(biāo)準(zhǔn)，共10人對顆粒進行品嘗，根據(jù)評價結(jié)果選擇合適的矯味劑用量。

2.2.2 單一輔料篩選將浸膏與輔料微晶纖維素、木糖醇、蔗糖、淀粉、可溶性淀粉、麥芽糊精、甘露醇和乳糖分別按1:2、1:3、1:4和1:5的比例逐一進行制粒工藝的摸索，篩選出最佳輔料用量。

2.2.3 復(fù)合輔料篩選浸膏+乳糖+其他輔料、浸膏+蔗糖+其他輔料和浸膏+木糖醇+其他輔料進行最佳復(fù)合輔料處方的篩選。

2.3 顆粒劑指標(biāo)考察

通過測定顆粒劑的成型率、堆密度、休止角、溶化率和吸濕率，評判得出各處方相應(yīng)分值，以其綜合評分值為評判指標(biāo)，篩選得出最佳輔料配比。采用百分制的綜合評分方法對顆粒劑的質(zhì)量進行考察，綜合得分=（15/最大成型率值）成型率值+（最小休止角值15）/休止角值+（15/最大堆密度值）堆密度值+（20/最大溶化性值）溶化性值+（最小吸濕率值35）/吸濕率值[10]。

2.3.1 成型率的測定將制備好的顆粒劑稱重，分別過藥典1號篩和5號篩，收集能過1號篩但不能通過5號篩的顆粒，稱重。按如下公式進行計算，成型率=（能通過1號篩而不能通過5號篩的顆粒質(zhì)量/過篩前的顆粒質(zhì)量）100%。

2.3.2休止角的測定休止角指粉體堆積成的自由斜面與水平面所形成的最大角，休止角越小，流動性越好。本文采用固定漏斗法，將3只漏斗串聯(lián)并固定在水平的坐標(biāo)紙上1~2 cm的高度，將顆粒從最上面的漏斗壁慢慢加入，直到顆粒在坐標(biāo)紙上形成一個圓錐體，圓錐體的頂端與最下面的漏斗口接近為止，由坐標(biāo)紙測出圓錐體的直徑（2 R），并測定圓錐體的高度（H），按公式tg=H/R計算出休止角，重復(fù)測定5次，計算平均值。

2.3.3 堆密度的測定取適量整粒后的顆粒稱重，質(zhì)量記為（M），放入干燥的量筒內(nèi)，輕輕震搖均勻后，讀取量筒刻度（V），二者比值即為堆密度，堆密度值=M/V。

2.3.4 顆粒溶化率的測定精密稱取干燥顆粒0.5 g，加入到10 mL干燥恒重的離心管中，加入沸水5 mL，振蕩5 min，3 000 r/min的條件下離心15 min，棄上清液，將殘渣在80℃下烘干至恒重，精密稱定，計算顆粒的溶化率。溶化率=（顆?？傎|(zhì)量未溶化的顆粒質(zhì)量）/顆?？傎|(zhì)量）100%。

2.3.5 吸濕性的測定精密稱取烘干至恒重的一定量顆粒，平鋪于干燥至恒重的稱量瓶中，厚度不超過5 mm。將放有NaCl過飽和溶液的干燥器在室溫下放置48h，使其相對濕度為75%。將顆粒劑置于干燥器內(nèi)，定時補足NaCl至形成飽和溶液，于48 h后精密稱定，計算顆粒劑的吸濕率。吸濕率=（吸濕后顆粒質(zhì)量吸濕前顆粒質(zhì)量）/吸濕前顆粒質(zhì)量100%，計算吸濕率。

3 結(jié)果與分析

3.1 矯味劑用量結(jié)果

根據(jù)不同品嘗者的評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果味浸膏的比例較小時，顆?？诟休^苦；當(dāng)果味浸膏的比例過大時，掩蓋了菌質(zhì)本身的味道且顆?？诟羞^甜；最終確定果味浸膏（g）和菌質(zhì)浸膏（g）比例為2:1時，顆?？诟性u價最佳，具有較適宜的酸甜口感且保留了菌質(zhì)的味道，故以此浸膏比例為最佳的矯味劑用量。

3.2 單一輔料篩選結(jié)果

當(dāng)浸膏與淀粉、乳糖的比例分別為1:2、1:5時可成功制粒，但浸膏與輔料微晶纖維素、可溶性淀粉和麥芽糊精等輔料單獨制粒時，軟材不合格，無法成功制粒。

3.3 復(fù)合輔料篩選結(jié)果

根據(jù)單一輔料的篩選結(jié)果，進一步選擇適宜輔料進行混合輔料的篩選。稱取浸膏適量，分別與復(fù)合輔料進行制粒，制粒結(jié)果見表1、表2和表3。通過對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定的輔料比例下，乳糖及木糖醇可與大多數(shù)輔料進行制粒工藝的研究，同時，通過本實驗對蔗糖進行工藝對比發(fā)現(xiàn)，蔗糖與淀粉復(fù)合使用時，顆粒劑具有更高的成型性。

表1 乳糖與微晶纖維素、糊精、甘露醇、淀粉比例考察Table 1 The investigation of the ratio of lactose to microcrystalline cellulose,dextrin,mannitol and starch

表2 蔗糖與微晶纖維素、糊精、甘露醇、淀粉比例考察Table 2 The investigation of the ratio of sucrose to microcrystalline cellulose,dextrin,mannitol and starch

表3 木糖醇與微晶纖維素、糊精、甘露醇、淀粉比例考察Table 3 The investigation of the ratio of xylitol to microcrystalline cellulose,dextrin,mannitol and starch

3.4 最佳符合輔料處方篩選結(jié)果

通過對以上復(fù)合輔料的篩選，最終得到8種最優(yōu)輔料處方，見表4。采用綜合評分法對該8種處方的成型率、休止角、堆密度和溶化率等指標(biāo)進行測定，測定結(jié)果，見表5。根據(jù)表5結(jié)果可知，處方4的評分最高，即當(dāng)浸膏、乳糖和淀粉的比例為1:2:1時，可作為猴頭菌-人參菌質(zhì)顆粒劑的最優(yōu)處方。根據(jù)最優(yōu)處方的復(fù)合輔料配比進行工藝放大驗證，得到的顆粒成粒性好，溶化性佳，證明該顆粒劑的工藝條件穩(wěn)定可行，為進一步開發(fā)猴頭菌-人參菌質(zhì)產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

表4 復(fù)合輔料最佳處方篩選結(jié)果Table 4 The screening results of the best prescriptions for compound excipients

表5 復(fù)合輔料最佳處方綜合評價結(jié)果Table 5 The comprehensive evaluation results of the best prescription of compound excipients

4 討論

利用猴頭菌與人參雙向發(fā)酵得到的固體菌質(zhì)，既保留了猴頭菌與人參的原有營養(yǎng)價值，又提高了藥效物質(zhì)的含量、豐富了藥效物質(zhì)的種類。王洪峰等[11]在研究人參雙向固體發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)微生物次生代謝產(chǎn)物的作用下，人參的化學(xué)成分發(fā)生了一定的轉(zhuǎn)化，在人參藥性菌質(zhì)中檢測到大量稀有人參皂苷，推測人參皂苷Rg1、Re和Rb可能轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3和Rh等。而稀有人參皂苷在更利于人體吸收的同時具有更高效的藥理活性作用，如Rg2和Rg3具有更高效的抗焦慮、抗炎和抗癌活性作用[8,9]，CK和F12在抗腫瘤、抗突變、抗炎保肝及抗哮喘等諸多方面都表現(xiàn)出良好的藥效活性[12-18]。

本文以發(fā)酵菌質(zhì)為原材料，采用濕法制粒法對猴頭菌-人參固體發(fā)酵菌質(zhì)顆粒劑的制粒工藝進行探索。利用水煎煮工藝提取菌質(zhì)中的有效活性物質(zhì)，以乳糖、蔗糖和木糖醇等傳統(tǒng)輔料進行顆粒劑最佳輔料的摸索，同時以水果浸膏為矯味劑調(diào)整顆粒劑的口感，使顆粒劑滿足大多數(shù)人的感官需求。通過對復(fù)合輔料處方配比的進一步優(yōu)化，以成型率、休止角、堆密度、溶化率和吸濕性為評價指標(biāo)進行顆粒劑的綜合評分，確定了輔料浸膏、乳糖和淀粉配比為1:2:1，為猴頭菌-人參固體菌質(zhì)顆粒劑的最佳輔料配比。希望通過本文的實驗結(jié)果，為我國傳統(tǒng)的猴頭菌及人參加工方式提供新的思路，為進一步研發(fā)相關(guān)食品及保健品提供新的發(fā)展方向，為深入開發(fā)猴頭菌與人參的寶貴資源提供科學(xué)背景。