不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的質(zhì)量評價

金銀萍，郝巖，曲正義，郭靖，張浩※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春130118）

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱為北五味子。五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有收斂固澀、益氣生津及補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴和心悸失眠等癥[1]。臨床應(yīng)用于治療病毒性肝炎、慢性傳染性肝炎和肝硬化等肝系疾病；急慢性支氣管炎、支氣管哮喘等肺系疾病；心血管及糖尿病的治療[2]。但是，五味子研究熱點(diǎn)均集中在藥用部位果實(shí)，隨著研究的不斷深入，五味子藤莖被認(rèn)為是一種具有很大潛在藥用價值和可持續(xù)利用的藥用資源，具有多種藥理活性，包括保肝、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和抗炎等[3-7]。五味子藤莖獨(dú)具的特有氣味及豐富的營養(yǎng)成分也被用作調(diào)味劑和食品添加劑等。

五味子是一種多年生落葉藤本植物，果實(shí)為近球形或倒卵圓形的紅色漿果。由于野生馴化的影響，五味子的果實(shí)在果色、果粒形狀、果穗緊密度以及果粒表面的腺點(diǎn)密度等方面都存在廣泛變異，尤其是果色的變異尤為明顯，除存在粉紅色、紅色、紫紅色和紫黑色等類型外，還存在黃色及白色等類型[8-10]。近年有報道[11]五味子果實(shí)顏色的多樣性對其木脂素含量的影響，但是關(guān)于果實(shí)顏色多樣性對五味子藤莖化學(xué)成分的影響至今未見報道。本文探討了不同果實(shí)顏色的五味子藤莖中常見的有效成分的含量，并評價了不同果實(shí)顏色的藤莖樣品之間的定量和定性變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用2018年3月17日采自通化國家農(nóng)業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園五味子優(yōu)良種苗示范推廣基地的藤莖樣本，白、黃、紅共3種果色的藤莖，每種采集3份，每份3個重復(fù)共計27份樣品。經(jīng)艾軍研究員鑒定為五味子科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的藤莖。D-無水葡萄糖對照品（純度≥99.5 %）購于北京化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸對照品（純度≥98.0 %）購于四川維克奇生物科技有限公司；沒食子酸（純度≥98.0 %）購于Acros公司；蘆丁和五味子醇乙（純度≥98.0 %）購于上海源葉生物有限公司；五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素對照品（純度≥98.0 %）購于中國食品藥品檢定研究所；色譜純乙腈、甲醇購于美國Fisher公司；純凈水購于杭州娃哈哈集團(tuán)，其他試劑為分析純。

1.2 儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Model Code UPB PDA檢測器；電子天平BSA 124S-CW（德國Sartorius公司）；KQ-500DE型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；ST-360酶標(biāo)儀（美國Biotek Epoch公司）；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 總?cè)频暮繙y定

1.3.1.1 供試品溶液的制備精密稱取五味子藤莖樣品2.0 g，粉碎過40目篩，將樣品放置于100 mL具塞三角瓶中，加入無水甲醇50mL，常溫超聲提取（500W，40 kHz）30 min，提取3次，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮至干，用無水甲醇將其定容至25 mL棕色容量瓶內(nèi)，搖勻即得供試品溶液。

1.3.1.2 對照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對照品5.0 mg，甲醇超聲溶解定容至25 mL的容量瓶中，搖勻即得濃度為0.20 mg/mL的對照品溶液。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品的含量測定精密吸取齊墩果酸對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至5 mL的容量瓶內(nèi)，氮吹儀吹干，然后精密加入5%香草醛-冰醋酸液0.2mL、高氯酸0.8mL，振蕩器上搖勻，60℃水浴15 min后，于冰水浴中放置5 min，取出，用冰醋酸定容至5.0 mL，搖勻即得系列齊墩果酸對照品溶液。按照相關(guān)文獻(xiàn)中的方法，于547 nm測定吸光值，以齊墩果酸的濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光值（y）為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，見表1。

精密吸取供試品溶液0.5 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“至5 mL的容量瓶內(nèi)”起依法操作，測定吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總?cè)频暮俊?/p>

1.3.2 木脂素的含量測定

1.3.2.1 對照品溶液的配制精密稱取各對照品適量，配成五味子醇甲、醇乙、甲素和乙素的混合對照品溶液，其質(zhì)量濃度分別為114.8g/mL、65.7g/mL、46.9g/mL和63.9g/mL。

1.3.2.2 供試品溶液的配制精密稱取五味子藤莖樣品2.0 g，粉碎過40目篩，將樣品放置在100 mL具塞三角瓶內(nèi)，精密加入無水甲醇50 mL，超聲（500 W，40 kHz）提取，每次30 min共提取3次，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮至干，經(jīng)適量蒸餾水溶解后，用石油醚進(jìn)行脫色處理，萃取液棄去，水層減壓濃縮，用無水甲醇定容至25 mL棕色容量瓶中，搖勻，即得。

1.3.2.3 色譜條件及樣品的含量測定 采用ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱（2.1mm 50mm，1.7m）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?~1 min，48~50%A；1~3 min，50~70% A；3~4.5 min，70~95% A；4.5~6.5 min，95%A；6.5~7.0 min，95~48%A；7~9 min，48%A；柱溫35℃，樣品溫度15℃，檢測波長254 nm，流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量1.0L。結(jié)果表明，各對照品在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中各木脂素的含量，樣品中總木脂素含量以五味子醇甲、醇乙、甲素和乙素的含量之和計算[13]。

1.3.3 總黃酮和總黃酮醇的含量測定

1.3.3.1 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品7.6 mg，于50mL容量瓶中用無水甲醇溶解定容，配制成0.152 mg/mL的對照品儲備液。經(jīng)適量無水甲醇稀釋成系列濃度梯度的蘆丁對照品溶液。

1.3.3.2 供試品溶液的制備 同1.3.1.1。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的含量測定 精密吸取120L的2% AlCl3乙醇溶液，加入120L的系列濃度蘆丁對照品溶液，混勻，室溫放置1.0 h，以不加蘆丁對照品的試劑作空白對照，于420nm處測定其吸光度值[14]。繪制蘆丁對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。精密吸取120L的2%AlCl3乙醇溶液，加入120L的系列濃度蘆丁對照品溶液，再加入160L的醋酸鈉溶液，混勻，室溫放置2.5 h，以不加蘆丁對照品的試劑作空白對照，于440 nm處測定其吸光度值[14]。繪制蘆丁對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

1.3.4 總酚的含量測定

1.3.4.1 對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸5.0mg，于5 mL容量瓶中經(jīng)蒸餾水溶解定容，配制成濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸對照品儲備液，經(jīng)適量蒸餾水稀釋成系列濃度梯度的沒食子酸對照品溶液。

1.3.4.2 供試品溶液的制備 同1.3.1.1。

1.3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的制備精密吸取系列濃度梯度的沒食子酸對照品溶液0.1 mL，依次加入0.5 mL的Folin&Ciocalteu's phenol reagent和1.5 mL 20%的碳酸鈉，混勻，用蒸餾水定容至10 mL的棕色容量瓶內(nèi)，室溫放置2.0 h，以不加沒食子酸對照品的試劑作空白對照，于765 nm處測定吸光度[14]。繪制沒食子酸對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

表1 五味子藤莖各種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 1 The standard curves,correlation coefficients and linear ranges of the compositions from the stems of S.chinensis

1.3.5 多糖的含量測定

1.3.5.1 供試品溶液的制備精密稱取五味子藤莖樣品2.0 g，粉碎過40目篩，放置于250 mL軟底燒瓶中，加入50倍量的80%乙醇，冷凝回流提取2次，每次1.0 h，過濾棄去濾液，將藥材揮干后加入50倍量的蒸餾水，回流提取2次，每次2.0 h，過濾，合并濾液，濾液經(jīng)減壓濃縮至一定體積，加入乙醇進(jìn)行醇沉處理（醇沉濃度80%），4℃靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，無水乙醇洗滌兩次，干燥即得供試品多糖。供試品多糖經(jīng)蒸餾水溶解定容至100mL，即得供試品溶液。

1.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及樣品的含量測定精密稱取D-無水葡萄糖對照品10.0 mg于100 mL容量瓶中加水溶解定容，得0.10 mg/mL的對照品溶液。精密量取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL的葡萄糖對照品溶液于10 mL具塞刻度試管中，用蒸餾水將其體積補(bǔ)至1.0 mL，加入6%苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入2.5 mL濃硫酸，立即搖勻。室溫放置30 min，490 nm處測定樣品的吸光值[12]，繪制D-無水葡萄糖對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 總揮發(fā)油的含量測定精密稱取不同果色的樣品25 g置于1 000 mL的軟底燒瓶中，加入250 mL蒸餾水，經(jīng)揮發(fā)油提取器提取至不再有揮發(fā)油流出即可。將揮發(fā)油收集在密封離心管中，加入適量的無水硫酸鈉去除多余水分，然后置于棕色玻璃瓶中，于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。樣品揮發(fā)油的產(chǎn)量按每100 g干物質(zhì)中所得的體積數(shù)來表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件SIMCA-P 14.0進(jìn)行主成分分析和聚類分析，使用Excel 2013進(jìn)行其他數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析

木脂素和多糖類等成分是五味子的主要活性成分，是其發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是五味子質(zhì)量評價和品種選育需要考察的重要因素[16-19]。表2是27份五味子藤莖化學(xué)成分的測試分析結(jié)果，由表2可知，五味子藤莖化學(xué)成分中木脂素、多糖和揮發(fā)油的變異系數(shù)較大，說明這些成分存在明顯差異，遺傳多樣性比較豐富，可做為五味子藤莖質(zhì)量評價的主要理化指標(biāo)。其中變異系數(shù)最大的是木脂素類成分，其也是歷代藥典評價五味子質(zhì)量的主要技術(shù)指標(biāo)，因此木脂素成分是五味子品種選育需要考察的重要因素之一。

表2 五味子藤莖主要化學(xué)成分的變異系數(shù)分析Table 2 The variation coefficient analysis of the main chemical compositions from the dried stems of

2.2 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的含量分析

從表3和圖1可以看出，不同果色五味子藤莖的化學(xué)成分含量間存在明顯差異。其中白果五味子藤莖樣品中木脂素、三萜和黃酮醇的含量最高，分別高達(dá)0.611%、6.435%和0.600%。紅果五味子藤莖樣品中多糖和黃酮的成分含量較高，分別為8.370和0.567%。黃果五味子藤莖中酚類和揮發(fā)油的成分含量較高，分別為3.361%和1.920%。通過對不同果色藤莖樣本的測試分析，結(jié)果表明五味子藤莖種質(zhì)資源間化學(xué)成分含量的差異非常明顯。

圖1 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的含量Fig.1 The contents of chemical composition from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

表3 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的含量Table 3 The contents of chemical compositions from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

2.3 聚類分析

本研究采用HCA，根據(jù)化學(xué)成分的相似性來區(qū)分五味子藤莖種質(zhì)資源間的差異。聚類分析結(jié)果如圖2所示，27份來自不同果色五味子藤莖的樣品被分成了3個類群。白果的五味子藤莖能夠與另外兩種果色藤莖明顯地分開，兩者的落點(diǎn)距離在27左右，紅果和黃果藤莖樣品兩者間的落點(diǎn)距離也很遠(yuǎn)在14左右。因此，HCA能成功地用于不同果色五味子藤莖的種質(zhì)資源鑒定。

圖2 聚類分析圖Fig.2 The dendrogram of the cluster analysis

2.4 主成分分析

從得分散點(diǎn)圖及成分載荷圖3中可以看出，不同果色五味子藤莖的樣本能夠得到較好的分離，說明不同果色五味子藤莖間的化學(xué)成分存在明顯差異。通過PC1能夠優(yōu)先將白果藤莖與紅果藤莖及黃果藤莖分離開；而紅果藤莖和黃果藤莖之間能夠被PC2分離開，這個主成分分析結(jié)果與HCA的結(jié)果是一致的。

圖3 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的得分散點(diǎn)圖（左）及成分載荷圖（右）Fig.3 The scatter plots(left)and loading plots(right)from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

在PC1載荷圖中，三萜和木脂素類成分具有較高的正值，且成分貢獻(xiàn)率在90%左右，表明白果五味子藤莖中含有較高含量的三萜與木脂素類成分。在PC2載荷圖中，黃酮醇和多糖的成分貢獻(xiàn)均大于90%且具有較高的正值，表明紅果五味子藤莖中含有較高的多糖類成分，而白果五味子藤莖中含有高含量的黃酮醇類成分。

表4 化學(xué)成分的貢獻(xiàn)率Table 4 The contribution of chemical compositions

3 討論

從本文的研究中可以清晰的發(fā)現(xiàn)，不同果色五味子藤莖的化學(xué)成分含量差異顯著。在前人的文獻(xiàn)報道[20-24]中指出，五味子的化學(xué)成分含量受種類、品種、地理來源、氣候條件、采收加工及貯藏等因素的影響很大，而在我們的研究中，所有樣品都來自同一種植園，具有相同的地理來源和氣候條件，采收加工及貯藏等條件也一致。具有不同果色的五味子藤莖樣品之間化學(xué)成分的差異很可能更多地受基因型的影響而非環(huán)境因素的影響。這些化學(xué)成分的差異可為五味子藤莖種質(zhì)資源的鑒定以及質(zhì)量評價提供理論參考。同時，亦可為五味子藤莖的資源利用與開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。