產(chǎn)茸相關(guān)SNP位點在7個梅花鹿群體中的驗證

田雪琪，李洋，劉匯濤，王天驕，邢秀梅

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟動物分子生物重點實驗室，吉林 長春130112）

2020年5月29日，以梅花鹿等16種特種畜禽列入《國家畜禽遺傳資源目錄》[1]。鹿茸作為傳統(tǒng)的中藥材在中國已有兩千多年的應(yīng)用歷史[2]，產(chǎn)茸性能一直是評估梅花鹿優(yōu)劣的重要指標。梅花鹿的選種育種一直停留在常規(guī)表型選種階段，茸重、茸型、茸色和對稱性是梅花鹿茸用品種培育的主要選種依據(jù)。分子標記輔助選種仍處于起步階段，田萬年等[3]對雙陽梅花鹿胰島素樣生長因子-1（IGF-1）基因的研究，發(fā)現(xiàn)在824 bp處存在T→C突變，所產(chǎn)生的AB基因型個體的產(chǎn)茸性能顯著高于其他兩種基因型個體；杜智恒等[4]對東北梅花鹿生長激素基因（GH）進行研究，發(fā)現(xiàn)在第2內(nèi)含子中存在G→A突變，這個SNP位點不同基因型可能對梅花鹿產(chǎn)茸性狀有影響，尤其是對第5鋸的產(chǎn)茸量有顯著影響趨勢；熊家軍[5]以兩個地區(qū)梅花鹿種群作為研究對象，對褪黑素基因（MTNR1A）、生長激素基因（GH）以及雄激素受體基因（AR）的SNPs與產(chǎn)茸量相關(guān)性進行了分析，發(fā)現(xiàn)在MTNR1A第2外顯子中存在G→C的位點突變，對湖北荊門五三梅花鹿種群產(chǎn)茸量具有顯著影響；GH基因139 bp處存在C→T突變對吉林東豐地區(qū)梅花鹿種群產(chǎn)茸量具有顯著影響；AR第3外顯子存在的C→T突變對兩個種群的產(chǎn)茸量均有顯著影響；陳斌[6]對梅花鹿轉(zhuǎn)化生長因子-1基因（TGF-1）的研究，發(fā)現(xiàn)在371 bp處的SNP位點存在3種基因型，其中AA基因型與其他兩種基因型的產(chǎn)茸量存在顯著差異。由此可見，在IGF-1、GH、MTNR1A、AR、TGF-1基因上均存在著與產(chǎn)茸量相關(guān)的SNP位點，且不同群體中與產(chǎn)茸相關(guān)的SNP位點存在一定差異，見表1。前期實驗室在四平梅花鹿、東大梅花鹿兩個群體篩選得到8個與產(chǎn)茸性能相關(guān)的SNP位點。其中，SNP1427_255為極顯著相關(guān)，其余SNP位點為顯著相關(guān)。本試驗應(yīng)用KASP分型技術(shù)在7個梅花鹿群體中進行基因分型，并對不同基因型與產(chǎn)茸量做關(guān)聯(lián)分析，以探究東北梅花鹿產(chǎn)茸量相關(guān)基因型或SNP組合，為早期選種提供依據(jù)。

表1 各研究中與產(chǎn)茸相關(guān)SNP位點信息Table 1 The information of SNP locus in studies

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用雄性梅花鹿個體共計190頭，分別采集于吉林省遼源市東豐縣文福鹿場、吉林省通化市通化縣通化山寶鹿業(yè)、吉林省長春市雙陽區(qū)東鰲鹿業(yè)、吉林省遼源市東豐縣鑫利達鹿業(yè)、吉林省梅河口市大成加隆畜禽有限公司、吉林省四平市吉梅花鹿種鹿場和吉林省長春市雙陽區(qū)鹿業(yè)良種繁育有限公司。所有試驗個體使用抗凝真空采血管采集頸靜脈血約10 mL，帶回實驗室后﹣20℃保存，用于后續(xù)基因組DNA提取。同時記錄所有試驗個體的原始產(chǎn)茸記錄，用于后續(xù)產(chǎn)茸性能關(guān)聯(lián)分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取使用天根生化科技（北京）有限公司所生產(chǎn)的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取試驗樣品的基因組DNA，相關(guān)操作參照試劑盒說明書。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性；用NanoDrop分光光度計測DNA的濃度，確定基因組DNA質(zhì)量合格后，置于﹣20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 試驗樣品Table 2 The samples submitted to this study

1.2.2 競爭性等位基因特異性PCR分型技術(shù)本實驗室提供8個SNP位點的序列信息，后續(xù)KASP分型實驗中引物設(shè)計、合成及位點檢測均由北京康普森公司完成。該技術(shù)是根據(jù)對終端熒光信號的讀取對位點進行判斷，每孔反應(yīng)都是采用雙色熒光檢測1個SNP位點的2種基因型，不同的SNP對應(yīng)著不同的熒光信號。通過掃描試驗用多重PCR板，采集不同的熒光信號得出檢測位點的具體信息。

1.2.3 產(chǎn)茸性能估測在實際生產(chǎn)中，由于鹿場的管理模式、養(yǎng)殖人員更換等因素，可能會造成某些個體的產(chǎn)茸記錄部分缺失。李和平等[7]建立了根據(jù)整個群體和個體產(chǎn)茸記錄來準確估測公鹿產(chǎn)茸能力的數(shù)學模型，這個模型中假設(shè)存在一個包含若干頭公鹿的群體，其中第i頭公鹿有Ki次產(chǎn)茸記錄，則這頭公鹿i最有可能的產(chǎn)茸能力（Pi）為

其中P指鹿群鋸平均產(chǎn)茸量；t指同一公鹿不同鋸別產(chǎn)茸記錄之間的相關(guān)（重復(fù)力）；Xi指公鹿的鋸平均產(chǎn)茸量。本試驗根據(jù)這個模型對試驗個體進行產(chǎn)茸能力估測。

1.2.4 SNP位點統(tǒng)計分析根據(jù)群體遺傳學的研究方法，運用Cervus軟件對群體的遺傳參數(shù)進行計算，其中包括基因頻率、基因型頻率、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）和哈迪-溫伯格（H-W）平衡檢驗等[8]，同時運用SPSS19.0軟件，采用一般線性模型對遺傳信息與產(chǎn)茸性能的關(guān)聯(lián)性進行最小二乘法分析。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取

將所提取的基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000進行基因組DNA完整性、純度和濃度檢測，結(jié)果見圖1，電泳條帶單一且清晰明亮，大小位于15 000 kb Marker頂端條帶之上；Nano-Drop2000檢測結(jié)果顯示，所提取的DNA濃度在50~100ng/L，OD值介于1.8~2.0之間，紫外吸收峰峰型正常。

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Genomic DNA agarose gel electrophoresis

2.2 引物設(shè)計結(jié)果及相關(guān)信息

應(yīng)用Primer 5軟件，對8個位點所在序列進行分析，經(jīng)過篩選得出最適引物。本試驗中所用8個SNP位點的引物序列及相關(guān)信息見表3。

表3 SNP位點引物信息Table 3 The information of SNP’s primer

2.3 SNP位點分型結(jié)果

運用KASP技術(shù)，對190個樣本的8個SNP位點進行分型。研究表明，用于表型關(guān)聯(lián)分析的位點，基因型檢出率不低于94%[9]。本研究對8個SNP位點檢出率情況進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，位點的檢出率介于95.26%~98.42%，平均檢出率為97.43%，均大于94%，全部分型成功。同時還對這些位點進行最小等位基因頻率（MAF）計算分析，平均MAF值為0.188，結(jié)果見表4。

表4 SNP位點MAF值計算結(jié)果Table 4 The calculated results of MAF value of SNP locus

2.4 群體遺傳多樣性分析

運用KASP對8個SNP位點在驗證群體進行基因分型，所得到的基因型信息使用Cervus軟件計算。通過得到的基因型信息對該群體的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果見表5。8個SNP位點中，有7個位點具有多態(tài)性，其多態(tài)信息含量（PIC）介于0.078~0.369，平均值為0.231 6；最小基因等位基因頻率（MAF）介于0.044~0.396之間，平均值為0.188；各位點的觀測雜合度（Ho）介于0.090~0.426，平均值為0.265；期望雜合度（He）為0.082~0.490，平均值為0.282；有效等位基因數(shù)（Ne）介于1.2~2.8，平均值為1.9。觀測雜合度與期望雜合度不存在統(tǒng)計學上的顯著差異（P＞0.05）。Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果顯示，SNP614_2585、SNP1881_130和SNP596_3774這3個SNP位點顯著偏離平衡（P＜0.05）。

表5 群體中9個SNP位點的遺傳參數(shù)信息Table 5 The genetic parameter information of 9 SNP locus in the population

2.5 產(chǎn)茸性能估測結(jié)果

運用茸重估測模型，計算驗證群體中每個個體的產(chǎn)茸估測值。計算結(jié)果顯示，試驗群體的產(chǎn)茸估測值介于1.12~8.55 kg。對所有個體的產(chǎn)茸估測值進行統(tǒng)計分析，根據(jù)相關(guān)研究，將產(chǎn)茸估測值分大于3.5 kg的高產(chǎn)組和小于2.5 kg的低產(chǎn)組[10]。對兩組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果顯示兩組產(chǎn)茸估測數(shù)據(jù)存在極顯著差異（P＜0.01），證明本群體中存在高、低產(chǎn)個體。部分樣本的產(chǎn)茸記錄和估測值，見表6。

表6 部分梅花鹿產(chǎn)茸性能估測Table 6 The estimation of the antler performance

2.6 SNP位點與產(chǎn)茸性狀的關(guān)聯(lián)分析

對190頭梅花鹿進行產(chǎn)茸性狀與SNP標記相關(guān)性分析。經(jīng)過計算，7個SNP位點的相關(guān)性P值介于0.264~0.849之間，均大于0.05，顯示所有位點SNP位點與產(chǎn)茸性狀均不存在顯著相關(guān)性（P＞0.05），結(jié)果見表7。

表7 SNP位點關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果Table 7 The phenotypic interpretation rate of SNP Locus

根據(jù)檢測結(jié)果顯示，位點SNP219_9123所有個體基因型均為CC，無多態(tài)性。SNP1427_255、SNP307_1564、SNP123_7847、SNP2027_423、SNP614_2585和SNP596_3774均存在3種基因型，但各基因型所占比例不同。SNP1881_130中僅存在兩種基因型，CC和CT，其中CC為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.91。SNP1427_255中，純合CC為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.56。SNP307_1564中，純合GG為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.63。SNP123_7847中，純合TT為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.56。SNP2027_423中，雜合AG為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.43。SNP614_2585中，純合AA為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.87。SNP596_3774中，純合TT為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.82。對每個SNP位點不同基因型的產(chǎn)茸性估測值均值進行單因素方差分析。結(jié)果顯示，各位點的不同基因型間產(chǎn)茸估測值均值不存在顯著差異。進一步驗證了8個SNP位點在本驗證群中與產(chǎn)茸性能不存在顯著相關(guān)性。但在SNP307_156、SNP614_258和SNP596_377位點具有明顯的高產(chǎn)基因型。在SNP307_156中，存在與已知研究相同的高產(chǎn)CC基因型[11]，分別高于CG基因型和GG基因型14.36%和17.85%。在該位點中，對具有CC基因型個體的產(chǎn)茸值與CG基因型和GG基因型個體進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組產(chǎn)茸量具有顯著差異性（P＜0.05）。還發(fā)現(xiàn)SNP614_258位點高產(chǎn)基因型為GG，SNP596_377位點高產(chǎn)基因型為CC。具體位點詳細信息見表8。

表8 多態(tài)性位點的基因型信息Table 8 The genotype information of the polymorphic locus

3 討論

根據(jù)群體遺傳學的研究方法，運用Cervus軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）、平均期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）和Hardy-Weinberg群體平衡，以分析群體遺傳多樣性。多態(tài)信息含量這一指標是由Botsticn等[12]在1980年提出，該參數(shù)的高低用以描述家系連鎖分析標志基因（或標志序列）的多態(tài)性大小。Botsticn認為，當多態(tài)信息含量大于0.5時，該標志基因具有高度信息含量，小于0.5而大于0.25則為中度信息含量，小于0.25時具有低度信息含量。本試驗中所驗證的7個SNP位點的多態(tài)信息含量（PIC）介于0.078~0.369，其中SNP614_2585、SNP1881_130和SNP596_3774為低度多態(tài)性位點，SNP1427_255、SNP307_1564、SNP123_7847和SNP2027_423為中度多態(tài)性位點，沒有高度多態(tài)性位點。相關(guān)研究表明，與微衛(wèi)星標記相比，SNP的多態(tài)性較低，但因SNP位點為全基因組層面內(nèi)分布，可在一定程度上彌補其相較于微衛(wèi)星等其他分子標記方法中多態(tài)性較低的問題，使得SNP位點可用于相關(guān)性狀分析[13]。

雜合度用來評價群體在檢測位點上出現(xiàn)雜合的頻率，是評價群體遺傳變異的重要參數(shù)。通過對比觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）的相對大小來判定群體近交程度。當觀測雜合度小于期望雜合度時，群體遺傳多樣性低，為近親繁殖；當兩者相等時，群體內(nèi)個體為隨機交配；當觀測雜合度大于期望雜合度，群體遺傳多樣性較高，為遠親繁殖。本試驗群體的平均觀測雜合度（Ho）為0.265，平均期望雜合度（He）為0.282，呈觀測雜合度略小于期望雜合度，表明群體雜合度低，群體遺傳多樣性低。

Hardy-Weinberg平衡是以完全隨機交配所組成的自然種群為基礎(chǔ)而做出的假設(shè)。因此，通過Hardy-Weinberg群體平衡卡方檢測來衡量群體遺傳平衡狀態(tài)。本研究群體經(jīng)過Hardy-Weinberg群體平衡檢測發(fā)現(xiàn)，在具有多態(tài)性的7個位點中，有3個位點顯著偏離平衡狀態(tài)?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，在小規(guī)模種群中，近親交配和無效等位基因等因素會導致雜合度不足，造成位點偏離Hardy-Weinberg平衡[14]。所以這3個顯著偏離Hardy-Weinberg平衡的位點可能與群體遺傳多樣性低、人工選育干預(yù)強度大的情況有關(guān)。東北地區(qū)的家養(yǎng)梅花鹿均為野生東北梅花鹿的后裔，結(jié)合本研究群體的多個遺傳信息結(jié)果可以看出，東北地區(qū)各梅花鹿種群間的遺傳背景十分相似。

本試驗是對已知與產(chǎn)茸量相關(guān)的SNP位點進行驗證。在試驗群體中，這些SNP位點與本群體中的產(chǎn)茸量不存在顯著相關(guān)性。推測其原因，可能是由于在篩選群體中，主要是以四平梅花鹿和東大梅花鹿為主。這兩個品種的梅花鹿在已知品種中為高產(chǎn)品種。特別是東大梅花鹿群體，在產(chǎn)茸性能方面極顯著高于四平梅花鹿和其他群體。據(jù)統(tǒng)計，東大梅花鹿和四平梅花鹿的上鋸三杈鮮茸平均單產(chǎn)為4 kg和3.42 kg，明顯高于其他品種，如雙陽梅花鹿上鋸三杈鮮茸單產(chǎn)為2.9 kg[15]，敖東梅花鹿上鋸三杈鮮茸單產(chǎn)為3.34kg[16]。究其原因可能與東大梅花鹿在育種期間引入馬鹿血源及高強度人工選擇有關(guān)[11]。本研究中的190頭梅花鹿群體經(jīng)全基因組SNP鑒別芯片檢測，判定為純種梅花鹿，純種梅花鹿在產(chǎn)茸量方面較雜交個體相差甚遠。因此，我們推測群體遺傳背景差異可能是造成與產(chǎn)茸相關(guān)性SNP位點在本試驗中不相關(guān)的主要原因。后續(xù)對梅花鹿產(chǎn)茸性能相關(guān)的SNP位點的篩選，建議擴大篩選群體，增加群體數(shù)量。在表型數(shù)據(jù)中，除依據(jù)產(chǎn)茸估測之外，還可以通過相同鋸齡的實際產(chǎn)茸量進行關(guān)聯(lián)分析，為吉林梅花鹿的產(chǎn)茸性能SNP位點提供有效參考。

4 結(jié)論

本研究運用競爭性等位基因特異性PCR分型技術(shù)對190個個體的8個SNP位點進行基因分型檢測，得出7個具有多態(tài)性的SNP位點。使用一般線性模型對這7個SNP位點遺傳信息與產(chǎn)茸量進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在本試驗中所建立的隨機驗證群體中，所有SNP位點與產(chǎn)茸量均不存在顯著關(guān)聯(lián)，但存在SNP307_156、SNP614_258和SNP596_377位點具有明顯的高產(chǎn)基因型。本研究表明，前期基于部分群體篩選出的與產(chǎn)茸量相關(guān)SNP位點在本試驗群體的適用性不理想。