基于線粒體ND1基因和核糖體ITS2基因?qū)ωi疥螨的分子鑒定

黃福強(qiáng)，唐志強(qiáng)，李靜，孫悅翔，鐘秉洲，戚少賢

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山528225）

疥螨病通常是指由疥螨科、疥螨屬的疥螨（Sarcoptes scabie）寄生于人和其他哺乳動物表皮內(nèi)，引起稱為疥瘡（又稱疥癬、癲?。┑囊环N頑固性、接觸性和傳染性皮膚病[1]。疥螨的宿主種類較多，且地理分布廣泛，受環(huán)境因素的影響使疥螨的形態(tài)和生物學(xué)特性發(fā)生了一定的遺傳變異，因此采用傳統(tǒng)的分類學(xué)方法難以將不同宿主和不同地理來源的疥瞞進(jìn)行分類[1,2]。一直以來，學(xué)者們對疥螨屬的螨蟲分類持有兩種截然不同的觀點，即不同宿主和地理來源的疥螨分離株應(yīng)歸類為不同的種；不同宿主和地理來源的疥螨分離株應(yīng)為一個種的不同變種，如疥螨人變種（Sarcoptes scabiei var.hominis）、疥螨豬變種（S.scabiei var.suis）和疥螨犬變種（S.scabiei var.canis）等。各變種之間在形態(tài)上差別甚微，對宿主特異性并不十分嚴(yán)格，如經(jīng)常接觸家畜的人受到家畜疥螨的侵襲，也能轉(zhuǎn)移到人體上，但在生物學(xué)和致病性上有差異[1,2]。豬感染疥螨多發(fā)生在5月齡以前，通常由頭部開始，常發(fā)生在眼圈、頰部和耳朵等部位，癢感劇烈，有時患部因摩擦而出血。病程延長時，食欲不振，營養(yǎng)衰退，甚至死亡[2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。

2020年10月作者收到廣東某豬場寄送給實驗室的患有豬皮膚病病例的皮屑時，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)皮屑中存在疑似疥螨樣昆蟲尸體，為了進(jìn)一步確診該豬場是否感染了疥螨病及初步探究本次所采集樣本與nt數(shù)據(jù)庫中疥螨的同源性以及疥螨亞目各種屬的進(jìn)化關(guān)系，本研究以疥螨線粒體ND1基因序列和核糖體ITS2基因為靶標(biāo)分子對所采集樣品進(jìn)行分子鑒定及進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 疥螨

采自廣東某豬場患皮膚病豬的皮屑。

1.2 儀器設(shè)備

雙人雙面凈化工作臺（青島海爾股份有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），LabCycler PCR儀UNO-II型（Biometra公司），小型高速冷凍離心機(jī)（Cenfrifuge 5424R），DYY-4C型電泳儀（北京六一儀器廠），JJ500型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠），XH-C旋渦混合器（金壇市華城開元實驗儀器廠），WFH-201-B全封閉紫外透射儀（廣州市深華生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要試劑

LB/Amp/X-gal/IPTG平板培養(yǎng)基，5 TBE buffer（pH 8.3），1%瓊脂糖凝膠，PBS，生理鹽水，Premix Tap，E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞，EcoR I酶，HindIII酶，DL2000Maker，TaKaRa MiniBEST Agarose Gel，DNA Extraction Kit Ver.4.0，Omega Bio-tek Stool DNA Kit（D4015-01），TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit。

1.4 疥螨總DNA提取

將從廣東某豬場采集的疥螨樣品按Omega Biotek Stool DNA Kit試劑盒所推薦的方法對皮屑樣品進(jìn)行DNA提取，消化時間為5 h。

1.5 引物設(shè)計

疥螨ND1基因引物根據(jù)GenBank序列號為MF 083743的疥螨線粒體基因組ND1基因序列設(shè)計引物對ND1_F（5’-AGCGGAAGGTGAGTCAGAAATTG-3’）和ND1_R（5’-ACGAATACGAGGAAATCTACAACGA-3’），而ITS2基因引物對ITS2_F（5’-GGGCTGCAGTATC CGATGGCTTCGT-3’）和ITS2_R（5’-CGGGATCCTT CRCTCGCCGYTACT-3’）參考自文獻(xiàn)[3]，此引物擴(kuò)增出來的序列包含了5.8S rDNA基因部分序列、ITS2基因全部序列以及28S rDNA基因部分序列[3]，本實驗中對該序列命名為“ITS2+”。兩基因引物對由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.6 目的基因片段PCR擴(kuò)增

1.8 PCR產(chǎn)物的克隆及測序

用TaKaRa pMDTM18-T載體克隆試劑盒推薦的方法進(jìn)行擴(kuò)增片段的克隆和轉(zhuǎn)化；利用TaKaRa質(zhì)粒純化試劑盒所推薦的方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行抽取，然后在0.2 mL的EP管中配制20L的酶切反應(yīng)體系并在37℃水浴2 h后進(jìn)行電泳檢測。將酶切反應(yīng)陽性的菌樣送樣，并委托生工生物工程（上海）有限公司對其測序。

1.9 生物信息分析

1.9.1 blastn相似性比較為了獲取本次測序的ND1基因及ITS2+序列與nt數(shù)據(jù)庫中疥螨目已有相關(guān)基因序列相似性高低，本研究在nt數(shù)據(jù)庫中以“Sarcoptiformes and(nd1 or nad1)”為檢索詞搜索疥螨目的ND1基因，共獲得66條序列；以“Sarcoptiformes and(ITS2 or internal transcribed spacers 2)”為檢索詞，共獲得663條ITS2基因相關(guān)序列。以下載的上述兩組疥螨目ND1及ITS2基因序列分別作為測序所得ND1和ITS2+序列的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫。通過本地blastn程序，按照命令“blastn-query query_name-db database_nameout result_name-evalue 1E-5-max_hsps 1-max_target_seqs 1000”進(jìn)行局部比對，blastn比對結(jié)果用circoletto（http://tools.bat.infspire.org/circoletto） 進(jìn)行優(yōu)化（由于nt數(shù)據(jù)庫對中ITS2基因序列過多，可視化時blastn結(jié)果比中Alignment length、Percentage of identical matches、Expect value、Bit Score及物種信息都相同的序列僅保留一條）。

1.9.2 進(jìn)化分析為了應(yīng)用本次測序的ND1基因及ITS2基因序列分析不同動物及地區(qū)分離的疥螨屬基因突變情況及進(jìn)化關(guān)系，應(yīng)用MEGA-X軟件對測序數(shù)據(jù)和nt數(shù)據(jù)庫中下載到的19條疥螨屬ND1基因[以Sarcoptes and(nd1 or nad1)進(jìn)行檢索]和301條ITS2基因[以“Sarcoptes and(ITS2 or internal transcribed spacers 2)”進(jìn)行檢索]進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。由于ITS2基因序列較多，進(jìn)化分析時相同宿主來源序列只保留一條最長的ITS2基因序列，共有56條nt數(shù)據(jù)庫中的序列參與建樹。構(gòu)建進(jìn)化樹時先用MEGA-X軟件嵌套的ClustalW程序?qū)Ρ敬螠y序獲得的ND1基因及ITS2基因和nt數(shù)據(jù)庫中下載的相應(yīng)基因序列進(jìn)行（默認(rèn)參數(shù)）比對，然后手動校正得到的矩陣，對同一基因的所有序列都修剪到相同的長度，然后采用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的支持率利用自展法（Bootstrap,1 000次重復(fù)）進(jìn)行檢驗，ND1基因以塵兔癢螨（Psoroptes cuniculi）為外群，ITS2基因以貓背肛螨（Notoedres centrifera）為外群。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

利用DNA提取試劑盒提取皮屑總DNA，然后再行PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染和酶切。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增片段大小，其中ND1基因擴(kuò)增序列在200 bp左右，ITS2基因擴(kuò)增序列在400 bp左右，均與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，見圖1。

2.2 blastn相似性比較

通過檢索nt數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，nt數(shù)據(jù)庫中分別有66條ND1和663條ITS2基因相關(guān)序列（截止2021年3月14日），通過blastn比對（E-value<1E-5）發(fā)現(xiàn)疥螨目中共有56條線粒體ND1基因序列與本實驗獲得的ND1基因序列有比對結(jié)果（圖2 A），且本實驗獲得的ND1基因部分序列與19個疥螨（Sarcoptes scabiei）線粒體基因組ND1基因相似性最高（紅色彩帶對應(yīng)序列，Identity>99%，E-value<6.20E-106），其次是戶塵螨（Dermatophagoides pteronyssinus，NC_012218.1，EU884425.1，Identity=80%，E-value=1.37E-44）、兔癢螨（Psoroptes cuniculi，NC_024675.1，KJ957822.1，Identity=74%，E-value=9.84E-34）和粉塵螨（Dermatophagoides farinae，NC_048990.1，GQ465336.1，Identity=74%，E-value=4.18E-32）（綠色彩帶對應(yīng)的序列）；本實驗獲得的ITS2+序列與疥螨屬ITS2基因序列相似性最高，與其他疥螨目ITS2序列差異較大（圖2 B），但blastn結(jié)果提示在現(xiàn)有的nt數(shù)據(jù)庫序列中疥螨屬與背肛螨屬（Notoedres）ITS2基因序列最為相似（比對序列長度為85~89，比對序列部分相似性為95.50%~97.80%，E-value為7.16E-35~4.83E-37）。以上結(jié)果表明本次測序獲得的序列為疥螨屬基因組中的基因序列。

圖2 疥螨豬變種ND1序列（A）和ITS2+（B）序列與疥螨目相應(yīng)基因序列blastn比對結(jié)果紅色彩帶代表E-value值相對最小，橙色次之，綠色再次之，藍(lán)色最大，彩帶寬度表示比對序列長度。Fig.2 The blastn comparisons of the Sarcoptes scabiei var.suis against the ND1 and ITS2 sequences in the NT database.The red lines connect DNA sequences with the lowest quartile of e-value and blue lines with the highest quartile of E-value.The line width means the alignment length.

2.3 序列比對及分子進(jìn)化樹構(gòu)建

本次擴(kuò)增的ND1基因序列長度為211 bp，運(yùn)用擴(kuò)增的ND1基因序列長度及其全長序列分別構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示本次擴(kuò)增獲得的長211 bp的ND1基因序列與澳大利亞地區(qū)犬、考拉和袋熊真皮內(nèi)采集到的疥螨屬基因序列聚類（圖4 A）。ND1全長序列分析顯示nt數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有19條ND1基因全長序列可以聚為5個分支（分支中序列數(shù)大于等于2條，bootstrap值大于50%）（圖4 B），而以本次擴(kuò)出的211 bp長度僅僅有2個聚類。但不論是全長聚類還是部分序列聚類，聚類序列中均有不同來源的動物。ITS2基因聚類分析顯示，疥螨屬所有57條序列及背肛螨屬的4條序列能各自聚為一大類，疥螨屬序列和背肛螨屬序列明顯地分開，但在參與建樹的57條（包含本實驗獲得的序列）疥螨屬ITS2基因序列中，僅有6條序列可以先形成2個小的聚類，其他51條序列沒有聚類，見圖3。

圖3 基于核糖體ITS2基因構(gòu)建的疥螨環(huán)狀進(jìn)化樹Fig.3 The circle ML phylogenetic trees of rDNA ITS2 of Sarcoptes mites

3 討論

形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)或動物的雌性疥螨分離株在形態(tài)學(xué)上有所差異，但有些研究也發(fā)現(xiàn)即使是來自同一分離株的不同個體疥螨也存在差異[3]。因此在形態(tài)學(xué)上很難說清楚雌性疥螨形態(tài)的差異是由不同分離株引起還是由不同的個體引起。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，研究員期望通過DNA分子標(biāo)記技術(shù)來闡明疥螨各地區(qū)或不同宿主的遺傳變異關(guān)系。

由于核糖體RNA基因和線粒體基因受到的選擇壓力較小，進(jìn)化率快，在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多樣性，因此常用核糖體DNA的ITS區(qū)域和線粒體基因作為蟲種鑒定分子標(biāo)記[4]。近年來對疥螨的分子鑒定往往應(yīng)用ITS2基因序列作為分子標(biāo)記，有些研究也應(yīng)用疥螨CO1等線粒體基因進(jìn)行進(jìn)化分析[5,6]，但還未見ND1基因用于疥螨各變種基因變異分析的文章。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已有不同動物來源的疥螨線粒體全基因組被解析[6,7]。疥螨ND1基因全序列也已通過第二代測序方法拼接完成[6,7]，鑒于此，本研究應(yīng)用了疥螨分析常用的核糖體ITS2基因及目前為止還未用于疥螨分類和進(jìn)化分析的線粒體ND1基因序列。

本試驗中ITS2基因序列分析結(jié)果顯示，所獲得序列與nt數(shù)據(jù)庫中疥螨屬各變種ITS2基因相似度最高，與疥螨亞目中背肛螨屬進(jìn)化關(guān)系相對較近，且所有疥螨的ITS2序列能聚類在一起，有較高的自展值（99），然后再與外群聚類。同時疥螨屬內(nèi)部聚類時ITS2僅有少部分序列能有分支聚類。Zahler等[3]1999年在對疥螨ITS2序列分析時發(fā)現(xiàn)來自四大洲9種不同宿主的23株疥螨分離株的變異程度較小，建議將各地分離株歸為一個獨立的種，S.Alasaad[8]和Li等[9]也于2009年和2018年通過擴(kuò)增世界各地收集到的疥螨ITS2基因序列及GenBank中登錄的疥螨ITS2基因進(jìn)行分析，指出ITS2在疥螨各變種間變異非常小，無法對采至不同地區(qū)或不同動物的疥螨ITS2序列進(jìn)行有效聚類。本試驗也發(fā)現(xiàn)雖然ITS2作為分子標(biāo)記能有效地區(qū)分疥螨亞目中不同屬的螨蟲，如癢螨、背肛螨等，但由于在疥螨屬內(nèi)ITS2基因序列差異很小，無法區(qū)分疥螨屬內(nèi)其他的種或變種。通過對ITS2基因序列的分析，本試驗也支持疥螨屬各分離株為單獨種的結(jié)論。

本試驗中ND1基因序列分析結(jié)果顯示，所獲得序列也與nt數(shù)據(jù)庫中疥螨屬各變種ND1基因相似度最高，其次為戶塵螨、兔癢螨和粉塵螨，且疥螨屬內(nèi)各變種進(jìn)化分析顯示，有部分疥螨ND1基因序列可以分支聚類，但聚類的序列與采集的地區(qū)和宿主種類無關(guān)，且ND1基因全長序列的分支聚類要比部分序列多，說明不同分離株ND1基因序列變異位點信息比ITS2基因變異位點信息豐富，且ND1基因全長序列變異位點要較本次擴(kuò)增序列多。在以后的實驗中，應(yīng)用ND1基因全長序列對不同地區(qū)或不同宿主來源的疥螨進(jìn)行分析，將會獲得更多有效變異位點信息。

最后，通過本次試驗得出在廣東某豬場豬皮膚結(jié)痂中發(fā)現(xiàn)的昆蟲樣生物為疥螨，且本實驗再次驗證常用的ITS2基因序列不宜作為疥螨屬內(nèi)各變種變異進(jìn)化分析的分子標(biāo)記，但本實驗所篩選出的ND1基因在疥螨各變種中有較豐富的變異位點信息，可以作為疥螨屬內(nèi)各變種進(jìn)化分析的有效候選分子。