貉細(xì)小病毒RDPV-JL3株的分離鑒定及VP2基因序列分析

郭曉芹，于小亞，李滋睿，李卓宸，呂甜甜，曹海旭，宋海巖，趙傳芳※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春130112；2.吉林省科技創(chuàng)新平臺管理中心，吉林 長春130012；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院后勤服務(wù)中心，北京100081；4.吉林冠界生物技術(shù)有限公司，吉林 梅河口135000）

貉子，又名狗貍，是起源于東亞的一種本土食肉目犬科動物[1]。通過訓(xùn)化后人工養(yǎng)殖的貉子背部毛皮質(zhì)量能接近于藍(lán)狐的毛皮質(zhì)量[2]，使得貉皮在國際市場中的價格不斷上漲，給毛皮養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。而貉細(xì)小病毒（RDPV）能引發(fā)貉細(xì)小病毒腸炎，是危害養(yǎng)貉業(yè)的重要傳染病之一[3]。幼貉的發(fā)病率在70%以上，死亡率高達(dá)90%，成齡貉的感染率和死亡率均在30%以下，多呈慢性和隱性感染，其帶毒的排泄物（糞便和尿液等）成為最危險的傳染源[4]。

RDPV屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirinae）成員，與犬細(xì)小病毒（CPV）、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（FPV）、水貂腸炎病毒（MEV）、浣熊細(xì)小病毒（RPV）以及藍(lán)狐細(xì)小病毒（BFPV）的基因組同源性高達(dá)98%以上[5]，肉食動物細(xì)小病毒被科學(xué)家認(rèn)為是由同一始祖毒株在生態(tài)變化或自然選擇等因素的影響下，突破了種間屏障，獲得跨種屬傳播的能力后逐漸進(jìn)化成的一種具有種屬特異性的病毒[6-9]。1978年CPV以CPV-2型首次在犬體中被發(fā)現(xiàn)，CPV-2作為一種新病原其最被研究學(xué)者認(rèn)可的產(chǎn)生途徑是FPLV借助狐或貉等中間宿主變異進(jìn)而感染犬出現(xiàn)的[10]。RDPV也被認(rèn)為是CPV跨宿主感染貉產(chǎn)生[11]。RDPV自1984年（首次在我國黑龍江省發(fā)生）至今所分離出的毒株雖然大都屬于CPV-2亞型，但從2016開始，RDPV主要衣殼蛋白VP2上的多個氨基酸殘基發(fā)生了非同義性突變，如S27T、S297A和I418T，這種新型CPV-2可能是細(xì)小病毒進(jìn)化的過渡階段[12,13]。

本實驗從吉林某養(yǎng)殖場疑似患貉細(xì)小病毒的貉腸道組織中成功分離出1株貉細(xì)小病毒，并對此分離毒株的VP2基因進(jìn)行克隆測序和基因序列分析，了解該地區(qū)RDPV分子流行病學(xué)的變化趨勢，以期為更好的研究貉細(xì)小病毒病的診斷、疫苗防控以及揭示CPV-2進(jìn)化機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料病料來自吉林省吉林市某貉養(yǎng)殖場，發(fā)病貉表現(xiàn)為嘔吐及腹瀉等，臨床癥狀疑似為RDPV感染，Anigen Rapid CPV Ag Test Kit檢測糞拭子顯示陽性，采集病死貉的腸組織及腸道內(nèi)容物。

1.1.2 細(xì)胞及試劑貓腎傳代細(xì)胞F81株、RDPV陽性血清及RDPV VP2蛋白單抗由本實驗室保存；細(xì)胞培養(yǎng)用的胎牛血清、消化液胰酶及MEM購自Gibco公司；DNA Marker（DL5 000、DL2 000、DL1 000）基因組提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、Peasy-T1 Cloning Kit、大腸桿菌DH-5感受態(tài)細(xì)胞等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LA Taq DNA聚合酶、購自Takara公司；Goat Anti-Mouse IgG（H+L）/FITC購自北京博奧森生物有限公司；引物由庫美生物科技有限公司合成。

1.1.3 儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)（Thermo公司產(chǎn)品）；凝膠成像儀（GE公司產(chǎn)品）；組織研磨儀（Thmorgen公司產(chǎn)品）；熒光倒置顯微鏡（Leica公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 病料處理將采集的貉腸道組織及其內(nèi)容物研磨充分后用PBS按1:5的比例稀釋，于﹣79℃反復(fù)凍融3次，5000r/min，4℃離心45min，取上清用0.22m濾膜過濾除菌后加入雙抗（Penicillin-Streptomycin,100），使其終濃度為100U/mL，4℃過夜后放入﹣79℃保存。

1.2.2 病毒分離培養(yǎng)將生長良好的F81細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，按2%同步接種病料上清，用含10%血清的MEM于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時設(shè)立正常細(xì)胞對照，每天觀察細(xì)胞病變的情況。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%左右收毒，反復(fù)凍融3次后置于﹣79℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA提取及PCR鑒定合成檢測引物后[14]于第三代細(xì)胞培養(yǎng)物中提取DNA進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)總體積20L，模板1L，2 LA Taq酶10L，上、下游引物各1L，加dd H2O至總體積20L。PCR擴(kuò)增程序94℃預(yù)變性4 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；最后72℃延伸6min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用0.9%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4 血凝試驗（HA）使用96孔微量血凝板對RDPV陽性第3代細(xì)胞培養(yǎng)物上清進(jìn)行HA測定，每孔先加入25L PBS緩沖液（pH 7.2），每排第1孔中加入25L的抗原，吹打混勻后吸25L至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，棄掉25L。第12孔作為紅細(xì)胞對照組，實驗設(shè)置2個重復(fù)和陽性對照組。每孔補(bǔ)加25L PBS，最后每孔加入50L 1%豬紅細(xì)胞懸液，震蕩均勻后于4℃靜置45 min后進(jìn)行判定。將100%的紅細(xì)胞凝集判為陽性標(biāo)準(zhǔn)，對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為該病毒的血凝效價。

1.2.5 病毒TCID50測定 調(diào)整F81細(xì)胞濃度約為2 105個/mL，每孔100L均勻鋪于96孔培養(yǎng)板中，同時將收取的有典型病變的第3代細(xì)胞培養(yǎng)液依次按10倍做倍比稀釋，分別接種于F81細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，每個滴度做8個重復(fù)，100L/孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照組，觀察并記錄4 d內(nèi)的病變孔數(shù)，按Reed-Muench法計算病毒TCID50。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）首先將F81細(xì)胞均勻鋪在96孔板并按體積的5%同步接種分離株病毒，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，棄上清液，用PBST洗3次；依次進(jìn)行固定（加入4%多聚甲醛4℃感作45 min，用PBST清洗3次）、穿透（用0.1% Triton-X100室溫感作15 min，用PBST清洗3次）、封閉（加入4% FBS，37℃封閉1 h）等步驟，棄掉封閉液，加入一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜。用PBST清洗3次加入1:200稀釋的二抗100L。室溫避光孵育1 h，清洗3次后，于熒光倒置顯微鏡中觀察。同時設(shè)未接種病毒的細(xì)胞作為陰性對照。

1.2.7 VP2基因克隆及遺傳進(jìn)化分析 參照Genbank上登錄號為（GQ857614）的RDPV株的VP2基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，擴(kuò)增目的片段大小為1 755 bp，引物序列為R：ATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC（5′~3′），F(xiàn)：-TTAATATAATTTTCTAGGTGC TAGTTGAG（-5′~3′），PCR反應(yīng)體系為50L：模板2L，2 LA Taq 25L，上、下游引物各1L，加ddH2O至總體積50L。PCR擴(kuò)增中關(guān)鍵程序：退火30 （s55℃）；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.8 克隆測序及遺傳進(jìn)化分析VP2基因擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接到Peasy-T1克隆載體上，轉(zhuǎn)化至DH-5感受態(tài)細(xì)胞并于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿上37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。次日挑取單克隆菌落進(jìn)行鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)并提取陽性質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往吉林省庫美生物科技有限公司測序并進(jìn)行拼接。登錄NCBI用BLAST選取與VP2基因序列相似性高的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，用DNASTAR中的MegAlign程序?qū)Ψ蛛x株VP2基因序列與GenBank發(fā)布的其他19株肉食獸細(xì)小病毒VP2基因序列進(jìn)行分析并利用Mega7.0軟件用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

正常細(xì)胞輪廓清楚，形態(tài)大小較均一；接種RDPVJL3毒株后的F81細(xì)胞，細(xì)胞變得腫大，呈拉網(wǎng)樣典型的病變，見圖1。

圖1 RDPV-JL3感染F81細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 The morphology of F81 cells infected by the RDPVJL3

2.2 PCR鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在573 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期目的條帶片段大小一致，見圖2。

圖2 RDPV-JL3 PCR鑒定結(jié)果Fig.2 The PCR-amplified form the RDPV-JL3

2.3 HA結(jié)果

RDPV-JL3第3代細(xì)胞病毒培養(yǎng)物的血凝效價保持在28以上。

2.4 TCID50結(jié)果

利用Reed-Muench法算得RDPV-JL3分離株的病毒含量為105.67 TCID 50/mL。

2.5 間接免疫熒光結(jié)果

熒光顯微鏡下分離毒株RDPV-JL3可見特異性綠色熒光；正常細(xì)胞對照未見特異性熒光，證實了該分離毒株為RDPV，見圖3。

圖3 RDPV-JL3的IFA結(jié)果Fig.3 The IFA result for the RDPV-JL3 strains of the parvovirus infected F81 cells

2.6 酶切鑒定

酶切鑒定與預(yù)期的目的條帶片段大小一致，見圖4。

圖4 RDPV-JL3基因重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.4 The identification of the pEASY-T1-VP2 vector by restriction endonuclease digestion

2.7 VP2基因進(jìn)化分析結(jié)果

將分離毒株RDPV-JL3 VP2序列與GenBank中公布的FPV、MEV、CPV和RDPV等19株肉食獸細(xì)小病毒VP2基因序列進(jìn)行比對，通過對該株病毒與19個參考毒株VP2蛋白10個關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明其80R、87M與FPV、MEV的氨基酸位點(diǎn)相同，根據(jù)其93N、103A、297S和426N位置氨基酸特性確定該株細(xì)小病毒屬于CPV-2株，未發(fā)現(xiàn)有S27T、S297A和I418T等氨基酸位點(diǎn)的同義替換，見表1。核苷酸進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，RDPV-JL3株與RDPV HeB10-3（登錄號KJ194463）及RDPV-17-JL-9（MH581183）株處于同一進(jìn)化分支，與CPV-Vac1疫苗株親緣關(guān)系比較近，見圖5。

表1 RDPV-JL3株與GenBank中已知病毒的關(guān)鍵氨基酸比較Table 1 The comparison of key amino acids of known viruses between the RDPV-JL3 strain and GenBank

圖5 RDPV-JL3 VP2基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic relationships among 19 parvoviruses of carnivores isolates based on the nucleotide sequences of the VP2 gene

3 討論

細(xì)小病毒科是一種小的DNA病毒，具有線形單鏈DNA基因組，全長約5 kb，兩端有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該病毒有兩個主要的開放閱讀框，一個編碼兩個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2），另一個編碼衣殼蛋白VP1和VP2[15]。其中，VP2蛋白與病毒的致病性、毒力以及血凝特性密切相關(guān)。VP2蛋白上幾個關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的改變就可以影響病毒的抗原性、宿主范圍和血凝特性，如VP2蛋白的aa77、aa88、aa370、aa375和aa377等位點(diǎn)發(fā)生突變后，細(xì)小病毒便失去血凝特性；aa426和aa297位的氨基酸特征是鑒定CPV-2變異株（CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c）的關(guān)鍵因素[16,17]。1979 1980年，在美國，從狗身上發(fā)現(xiàn)了一種抗原性變異株，命名為CPV-2a。與原CPV-2不同的是VP2有5個氨基酸突變（Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp 305 Tyr和Val 555 Ile）[18]，與此同時，另外兩個變異株CPV-2b（Asp 426）和CPV-2c（Glu 426）分別于1984年和1996年出現(xiàn)[19]。在過去的幾十年中，VP2蛋白Ser 297 Ala突變的CPV-2a和CPV-2b被命名為NewCPV-2a和NewCPV-2b[20]。

本試驗從貉腸道中成功分離出一株RDPV，經(jīng)NCBI對其VP2基因序列進(jìn)行BLAST分析表明，分離株RDPV-JL3與RDPV HeB10-3（KJ194463）相似性為100%，與RDPV-17-JL-9株相似性為99.94%。將其與Genbank上已公布的CPV分離株、CPV-Vac1疫苗株、RDPV分離株、FPV分離株和MEV分離株等19株已知毒株進(jìn)行氨基酸同源性比較以及遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離毒株與RDPV-17-JL-9株和CPVHeB10-3株的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)一致，且根據(jù)103A、297S、300A和426N幾個關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)判定為CPV-2型。RDPV-JL3分離株與RDPV-17-JL-9分離株相比僅在S192F不一致，說明本次分離毒株與RDPV HeB10-3（KJ194463）和RDPV-17-JL-9株具有共同的起源；與同型的美國野生毒株CPV-b、CPV-d對比分析，在D375N位有突變，可能是地理因素造成的；與CPV-Vac1疫苗株相比，存在D375N、Q386K的突變，這是否對疫苗防疫失敗有影響還需要進(jìn)一步深入研究。從系統(tǒng)進(jìn)化樹上來看，RDPV-JL3與RDPV-17-JL-9株、CPVHeB10-3株處于同一進(jìn)化分支并與CPV-Vac1疫苗株親緣關(guān)系比較近，推測可能是由于養(yǎng)殖場對犬使用犬細(xì)小病毒弱毒疫苗（CPV-2型）進(jìn)行免疫，免疫后的犬持續(xù)性排毒，被CPV-2易感的貉子接觸感染發(fā)病[21]。