循環(huán)腫瘤細(xì)胞及磷酸酶張力蛋白同源物基因檢測在Ⅲ期結(jié)直腸癌中的臨床意義△

鄢少聰，應(yīng)學(xué)明，趙建華，汪茜

景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院腫瘤科，江西 景德鎮(zhèn) 333000

據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計，2013年結(jié)直腸癌新增病例達(dá)60 900例，位居第4位。由于早期診斷困難，且容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等因素，很大部分患者預(yù)后較差，而腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）雖具有一定的預(yù)測價值，但也僅作為參考。近年來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）檢測在多種實體腫瘤中得到了應(yīng)用，已被證實其計數(shù)的動態(tài)變化與腫瘤的療效、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等具有一定相關(guān)性。磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一個具有特異性磷酸酶活性的抑癌基因，能抑制腫瘤轉(zhuǎn)錄，與腫瘤病理分化及預(yù)后相關(guān)。本研究通過檢測CTC及PTEN基因表達(dá)，探討其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，為CTC及PTEN基因檢測在預(yù)后判斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2019年1月景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院腫瘤科收治的77例術(shù)后Ⅲ期結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②術(shù)后病理檢查明確診斷為Ⅲ期結(jié)直腸癌；③術(shù)前未行任何治療；④體力狀態(tài)評分為0～2分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有其他惡性腫瘤病史；②一般情況差不宜行抗腫瘤治療；③不宜參加本試驗。其中，男性51例，女性26例；年齡24～75歲，平均（54.0±3.5）歲；結(jié)腸癌40例，直腸癌37例；T期22例，T期40例，T期15例；N期57例，N期20例；分化程度：中分化43例，低分化34例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者自愿參與并知情同意。

1.2 檢測方法

于首次治療前2 h采集患者外周血5 ml，采用CanpatrolCTC二代技術(shù)，用免疫磁珠負(fù)向去除外周血中白細(xì)胞，然后通過納米膜過濾檢出CTC，再對每個CTC進行分型，同時采用多重mRNA原位分析技術(shù)標(biāo)記檢測PTEN基因。

1.3 結(jié)果判斷

細(xì)胞內(nèi)CD45（-）、EpCAM（+）以及 CK8/18/19（+），顯微鏡下看到紅色熒光信號，為上皮型CTC；細(xì)胞內(nèi)同時見到綠色熒光和紅色熒光信號，為混合型 CTC；細(xì)胞內(nèi) CD45（-），Vimentin（+）以及Twist（+），顯微鏡下可見綠色熒光信號，為間質(zhì)型CTC（圖1）。人工計數(shù)CTC個數(shù)，定義CTC計數(shù)≥3為CTC陽性。每例患者CTC中PTEN基因的表達(dá)程度分為3個等級：信號點1～2點為低表達(dá)，3～8點為中表達(dá)，≥9點為高表達(dá)。

圖1 熒光顯微鏡下的CTC分型

1.4 隨訪

制訂病例觀察表，記錄患者的臨床資料。從入組時間開始計算，每3個月復(fù)查，隨訪內(nèi)容包括肛門指診、血CEA、胸腹部CT，直腸癌患者可復(fù)查盆腔MRI；1年內(nèi)進行結(jié)腸鏡檢查。采用以患者復(fù)診為主加電話聯(lián)系的隨訪方式，隨訪至患者死亡、失訪或2020年6月30日，其中5例患者失訪。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC與臨床特征的關(guān)系

低分化結(jié)直腸癌患者CTC陽性率明顯高于中分化患者，且隨著T分期升高CTC陽性率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；不同性別、年齡、腫瘤部位、CEA水平、N分期結(jié)直腸癌患者的CTC陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者CTC情況的比較（n=77）

2.2 CTC分型與腫瘤臨床分期及分化程度的關(guān)系

不同T分期、分化程度的結(jié)直腸癌患者上皮型CTC比例比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=8.131、8.545，P＜0.05）；不同T分期、N分期的結(jié)直腸癌患者混合型CTC比例比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=9.994、7.036，P＜0.05）；不同分化程度的結(jié)直腸癌患者間質(zhì)型CTC比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=6.338，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床分期及分化程度結(jié)直腸癌患者的CTC分型

2.3 CTC與PTEN基因的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CTC與PTEN基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。（表3）

表3 CTC與PTEN基因的相關(guān)性分析

2.4 CTC陽性與陰性患者生存情況的比較

CTC陰性組患者的中位生存時間（overall sur-vival，OS）為19個月，明顯長于CTC陽性組的14個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=11.608，P＜0.01）。CTC陰性組的中位無進展生存期（progression-free survival，PFS）為11個月，明顯長于CTC陽性組的7個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=8.082，P＜0.01）。（圖2、圖3）

圖2 CTC陰性組（n=32）與陽性組（n=45）患者的OS曲線

圖3 CTC陰性組（n=32）與陽性組（n=45）患者的PFS曲線

2.5 不同分型CTC陽性患者與陰性患者生存情況的比較

上皮型、混合型CTC陰性組與陽性組患者的中位OS及中位PFS比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4～圖7）。間質(zhì)型CTC陰性組患者的中位OS為19個月，長于陽性組患者的15個月，間質(zhì)型CTC陰性組患者的中位PFS為11個月，長于陽性組患者的7個月，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=4.679、5.324，P＜0.05）（圖8、圖9）。

圖4 上皮型CTC陰性組（n=50）與陽性組（n=27）患者的OS曲線

圖5 上皮型CTC陰性組（n=50）與陽性組（n=27）患者的PFS曲線

圖6 混合型CTC陰性組（n=21）與陽性組（n=56）患者的OS曲線

圖7 混合型CTC陰性組（n=21）與陽性組（n=56）患者的PFS曲線

圖8 間質(zhì)型CTC陰性組（n=44）與陽性組（n=33）患者的OS曲線

圖9 間質(zhì)型CTC陰性組（n=44）與陽性組（n=33）患者的PFS曲線

2.6 PTEN基因低表達(dá)與中表達(dá)患者生存情況的比較

PTEN基因低表達(dá)患者的中位OS為10個月，明顯短于中表達(dá)患者的19個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=23.676，P＜0.01）。PTEN基因低表達(dá)患者的中位PFS為5個月，明顯短于中表達(dá)患者的11個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ=17.644，P＜0.01）。（圖10、圖11）

圖10 PTEN低表達(dá)組（n=13）與中表達(dá)組（n=30）患者的OS曲線

圖11 PTEN低表達(dá)組（n=13）與中表達(dá)組（n=30）患者的PFS曲線

3 討論

近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且在發(fā)達(dá)國家中的發(fā)病率明顯高于發(fā)展中國家。早診斷、早治療、預(yù)后監(jiān)測是提高腫瘤患者生存率、降低病死率的關(guān)鍵。CTC攜帶有原發(fā)腫瘤組織或轉(zhuǎn)移灶的表型和遺傳型，痕量存在于外周血中，取樣便捷。越來越多研究表明，CTC檢測可成為一種新型、非創(chuàng)性的診斷方法，是精準(zhǔn)醫(yī)療的一個重要研究方向，在臨床上發(fā)揮重要作用。既往研究顯示，通過CellSearch系統(tǒng)檢測外周血CTC是最常用的方法之一。但采用該檢測系統(tǒng)無法富集到間質(zhì)型CTC，因此，存在一定的局限性。本研究采用CanpatrolCTC二代技術(shù)，用免疫磁珠負(fù)向去除外周血中白細(xì)胞，然后通過納米膜過濾檢出CTC，同時根據(jù)上皮-間充質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況，采用RNA-ISH對CTC進行分型鑒定，使早期腫瘤精準(zhǔn)診斷成為可能。

本研究共納入術(shù)后Ⅲ期結(jié)直腸癌患者77例，有63例患者檢出了CTC，檢出率達(dá)81.8%，與Zhao等研究的檢出率86.9%相近。有數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)Cut-off值為3時，CTC檢測可對患者良惡性作出較好區(qū)分，因此，本文亦采用3為Cut-off值，陽性率為58.4%（45/77），說明腫瘤細(xì)胞在早期就已存在于患者血液中，并可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，而TNM分期無法早期預(yù)判腫瘤的微轉(zhuǎn)移，這也提示Ⅲ期患者需要進行充分的輔助治療。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著T分期升高，CTC陽性率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與其他學(xué)者的結(jié)果相似，證實CTC與腫瘤侵犯深度有明顯的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)CTC的檢出率與病理分期有顯著的相關(guān)性。另外，本研究結(jié)果顯示，腫瘤分化程度低，CTC陽性率則高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與既往研究結(jié)果不一致，需擴大樣本進一步證實。CEA是結(jié)直腸癌診斷和監(jiān)測治療反應(yīng)的重要標(biāo)志物，高CEA水平可能與結(jié)直腸癌進展相關(guān)，也有研究顯示，CEA異常組CTC陽性率也高于CEA正常組，本研究中CTC與CEA并無相關(guān)性。對CTC分型后，統(tǒng)計出上皮型、混合型、間質(zhì)型CTC比例分別為35.1%、72.7%、42.9%，并發(fā)現(xiàn)，不同T分期、N分期的結(jié)直腸癌患者混合型CTC比例比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；不同分化程度的結(jié)直腸癌患者間質(zhì)型CTC比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這項結(jié)果既往未見報道，而這和CTC與患者臨床特征的關(guān)系大致相符。

多項研究提示CTC可以作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的預(yù)后指標(biāo)。Gennaro等也發(fā)現(xiàn)，CTC＜3的結(jié)直腸癌患者3年P(guān)FS長于CTC≥3者。在本研究中，CTC陰性組患者中位PFS和中位OS均明顯長于CTC陽性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明CTC是與Ⅲ期結(jié)直腸癌患者生存時間密切相關(guān)的指標(biāo)，但能否作為臨床預(yù)后的決定性因素，還需要進一步研究。對CTC分型后，研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，隨著病情的不斷惡化，間質(zhì)型細(xì)胞比例會隨之升高，在肝細(xì)胞肝癌中，轉(zhuǎn)移患者的間質(zhì)型CTC陽性率明顯高于無轉(zhuǎn)移患者，提示間質(zhì)型CTC具有較強的轉(zhuǎn)移侵襲及抗凋亡能力。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌患者中，僅間質(zhì)型CTC陰性組和陽性組患者的生存時間有顯著差異，這與間質(zhì)型CTC的侵襲能力密切相關(guān)，也說明間質(zhì)型CTC可能是影響腫瘤患者預(yù)后的主要CTC類型。

PTEN基因通過與多種基因協(xié)同作用抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。研究表明，PTEN與細(xì)胞的生長發(fā)育、分化及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后均有關(guān)。在卵巢癌中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PTEN高表達(dá)患者的生存期是低表達(dá)者的2.5倍，認(rèn)為PTEN可作為無病生存期的預(yù)測指標(biāo)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中，PTEN基因中表達(dá)患者較低表達(dá)患者生存時間長。有研究表明，PTEN低表達(dá)會增加結(jié)直腸癌患者的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險，并提高腫瘤細(xì)胞對放化療的耐受性。另外，本研究結(jié)果顯示，CTC與PTEN基因表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)，提示CTC低表達(dá)且PTEN高表達(dá)患者預(yù)后較好。

綜上所述，CTC及PTEN與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)，可以考慮在患者首診時進行常規(guī)檢測。另外，本研究病例數(shù)有限，結(jié)果在一定程度上存在偏倚，需要更大宗的病例以及多中心研究進一步證實。