土壤微生物宏基因組研究現(xiàn)狀
——基于Citespace文獻計量分析

李靜超，佘 容，楊曉燕,2,3

（1大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理671003；2中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理671003；3大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護與利用云南省創(chuàng)新團隊，云南大理671003）

0 引言

作為人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，土壤擁有豐富的微生物資源，其數(shù)量巨大、種類繁多。據(jù)估算，1 g土壤中有數(shù)千乃至數(shù)萬種、約數(shù)十億個微生物個體[1-5]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤的物質(zhì)循環(huán)和能量流動、生態(tài)平衡以及植物的養(yǎng)分轉(zhuǎn)換中發(fā)揮著舉足輕重的作用[6-8]。因此，土壤微生物受到了土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)W者的普遍重視，逐漸成為當代生命科學(xué)中最前沿的研究內(nèi)容之一[9]。

過去，土壤微生物的研究一般是通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行，但目前能夠使用培養(yǎng)方法培養(yǎng)的土壤微生物只占其總量的0.1%～1%[10]。依賴培養(yǎng)法獲取的信息有限，不能完全反映樣本中微生物群落的真實狀況，而這會導(dǎo)致對微生物的認知局限性[11]。隨著科學(xué)技術(shù)的進步，特別是以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)以及454焦磷酸測序儀的問世（2005年），測序技術(shù)迅速發(fā)展，其通量和讀長都得到了極大的改善，而以此為基礎(chǔ)發(fā)展起來的宏基因組技術(shù)也越來越受到微生物研究者的青睞[12]。宏基因組(metagenome)也稱環(huán)境微生物基因組或元基因組，是環(huán)境中全部微小生物（目前主要包括細菌和真菌）DNA的總和[13]。宏基因組技術(shù)不依賴傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)過程，以高質(zhì)量的樣品總DNA為研究材料，以DNA深度測序和功能基因篩選為研究手段，實現(xiàn)了對各樣品內(nèi)微生物群落多樣性、物種豐度、基因功能以及代謝通路的分析[14]?；诖?，利用宏基因組技術(shù)研究土壤中大量未知的微生物基因序列，跨越了微生物研究的初始瓶頸，很有可能改變?nèi)藗儗ν寥牢⑸锸澜绲恼J識，并在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛力。因此，近年來利用宏基因組技術(shù)進行土壤微生物研究的報道逐年增加[15-16]。

文獻計量學(xué)分析是應(yīng)用數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)的方法對某領(lǐng)域的文獻進行量化的分析方法，能客觀、定量地反映學(xué)科宏觀發(fā)展態(tài)勢，是探究學(xué)科發(fā)展的一種有效途徑[17]。另外，文獻計量學(xué)對評估科研機構(gòu)的競爭力也很重要，可以幫助科研機構(gòu)進行科技評價，戰(zhàn)略規(guī)劃，制定決策，挖掘其潛在競爭力和需求[18]。因此，該方法目前已被廣泛應(yīng)用于對各領(lǐng)域研究進展的分析。基于此，本研究對Web of Science核心數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)(CNKI)中利用宏基因組技術(shù)進行土壤微生物宏基因組研究的文獻進行計量學(xué)統(tǒng)計分析，以了解宏基因組技術(shù)在土壤微生物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并綜合分析應(yīng)用中存在的問題，提出在該技術(shù)應(yīng)用中應(yīng)注意的問題及可能的解決辦法，旨在為研究者們更好地利用宏基因組技術(shù)進行土壤微生物研究提供參考。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來源于中國知網(wǎng)(CNKI)和Web of Science核心數(shù)據(jù)庫。Roche 454測序儀的出現(xiàn)時間為2005年，所以2個數(shù)據(jù)庫檢索時間均以2005年為起點。選擇CNKI期刊論文數(shù)據(jù)庫進行檢索時，檢索式SU=‘土壤’AND SU=（‘宏基因組’+‘宏基因文庫’+‘宏基因組學(xué)’+‘宏基因’+‘宏基因測序’+‘高通量測序’+‘高通量’+‘擴增子’+‘擴增子測序’）AND SU（‘微生物’+‘真菌’+‘細菌’+‘放線菌’+‘微生物組’），檢索共獲得文獻1770篇，經(jīng)過篩選，去除會議論文65篇、學(xué)位論文947篇、成果論文5篇，最后納入分析的文獻共計753篇。選擇Web of Science數(shù)據(jù)庫進行檢索時，檢索式為TS=‘soil’AND TS=‘(metagenom*’OR‘highthroughout*’OR‘a(chǎn)mplication*’)AND TS=‘(Microb*’OR‘bacteria’OR‘fungi*’OR‘a(chǎn)ctinomycete*’OR‘microorganism’)，檢索共獲得文獻2024篇。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

利用CiteSpace 5.7 R2軟件，對檢索所得文獻進行機構(gòu)和與作者的合作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析、關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析，并將分析結(jié)果導(dǎo)入Gephi軟件中進行繪圖；另外，利用HistCite軟件對發(fā)文機構(gòu)、文獻來源期刊進行統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果進一步利用Excel進行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)文量增長趨勢

發(fā)文量表征科學(xué)界對本領(lǐng)域的關(guān)注程度，其增長趨勢在一定程度上反映了該領(lǐng)域的發(fā)展速度和發(fā)展程度[19]。在所分析的文獻中，英文文獻發(fā)文量自2005年開始就持續(xù)增長，而中文文獻在2005—2013年發(fā)文量基本沒有大幅度增長，直至2013年后才持續(xù)增長，并在2019年達到最高（年發(fā)文量221篇），且該年增長幅度高于英文文獻（圖1）。

圖1 2005—2020年土壤微生物宏基因組研究發(fā)文量趨勢

2.2 核心國家分析

國家和地區(qū)的發(fā)文量分布和引用次數(shù)可以在一定程度上說明該國家和地區(qū)在某一學(xué)科上的研究規(guī)模和水平[19]。在Web of Science核心數(shù)據(jù)庫檢索到的文獻中，美國的發(fā)文量位居第一，發(fā)文量為647篇，占30.72%；中國位居第二，發(fā)文量為406篇，占比19.28%；第三是印度，發(fā)文量為187篇，占比8.88%（表1）。

表1 英文文獻中土壤微生物宏基因組研究領(lǐng)域發(fā)文量排名前10位的國家

2.3 研究機構(gòu)和研究人員分析

2.3.1 研究機構(gòu)分析 通過對英文文獻中不同機構(gòu)發(fā)文量的分析，可了解全球利用宏基因組學(xué)技術(shù)進行土壤微生物研究的重點機構(gòu)。分析結(jié)果顯示，發(fā)文量第一的是中國科學(xué)院，發(fā)文量為119篇，占所分析文獻的5.88%；其次是Univ Calif Berkeley（加利福尼亞大學(xué)伯克利分校），發(fā)文量為51篇，占所分析文獻的2.52%；Tsinghua Univ（清華大學(xué)）排名第三，發(fā)文量為43篇，占所分析文獻的2.13%。發(fā)文量排名前10位的機構(gòu)中，中國機構(gòu)的發(fā)文量占比接近60.00%，說明中國機構(gòu)在利用宏基因組技術(shù)進行土壤微生物研究方面多于其他國家（表2）。從機構(gòu)合作來看，國內(nèi)機構(gòu)聯(lián)系密切，美國各機構(gòu)之間也聯(lián)系密切。另外，中國科學(xué)院引領(lǐng)國內(nèi)其他機構(gòu)與其他國外機構(gòu)有密切的聯(lián)系，只有CSIC（西班牙國家研究委員會）、CNRS（法國國家科學(xué)研究中心）、Univ Waterloo（加拿大滑鐵盧大學(xué)）3個機構(gòu)和其他機構(gòu)沒有任何聯(lián)系（圖2）。

圖2 英文文獻的機構(gòu)合作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表2 英文文獻中土壤微生物宏基因組研究領(lǐng)域發(fā)文量排名前10位的機構(gòu)

通過對中文文獻的分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)文量排名第一的研究機構(gòu)是中國科學(xué)院大學(xué)，發(fā)文量為64篇，占總發(fā)文量的8.51%（表3）；排名二、三位的是中國科學(xué)院南京土壤研究所、寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，分別是39、38篇，占比5.19%和5.05%；其他機構(gòu)中，中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心、中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所、中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所等機構(gòu)發(fā)文量排名也比較靠前。但除排名前三的機構(gòu)發(fā)文量較多外，其他機構(gòu)的發(fā)文量均少于30篇。從機構(gòu)合作來看，以中國科學(xué)院及其分屬機構(gòu)為一個體系，中國礦業(yè)大學(xué)為一個體系，中國熱帶科學(xué)院為一個體系，各體系之間的聯(lián)系不密切（圖3）。2.3.2核心作者分析 英文文獻中，發(fā)文量最多的是Zhou Ji-Zhong，發(fā)文量為33篇，其次為He Zhi-Li，發(fā)文量為20篇，其余作者發(fā)文量均沒超過20篇。另外，在英文文獻中，發(fā)文量前三的作者均來自中國，說明國內(nèi)利用宏基因組技術(shù)進行開展的土壤微生物研究的較多（表4）。國際合作關(guān)系來看，以Zhou Ji-Zhong為中心的作者體系網(wǎng)絡(luò)與國內(nèi)外作者都有密切聯(lián)系，只有少數(shù)作者與該體系網(wǎng)絡(luò)沒有聯(lián)系（圖4）。

圖4 英文文獻作者合作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表4 英文文獻中土壤微生物宏基因組研究領(lǐng)域發(fā)文量排名前10位的作者

圖3 中文文獻的機構(gòu)合作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表3 中文文獻中土壤微生物宏基因組研究領(lǐng)域發(fā)文量排名前10位的機構(gòu)

在所分析的中文文獻中，第一名是秦華，發(fā)文量26篇，其他作者發(fā)文量均未到20篇。從研究者合作關(guān)系來看，國內(nèi)只有一個以秦華為中心的作者合作體系網(wǎng)絡(luò)，其余作者均沒有超過3個的合作網(wǎng)絡(luò)（表5，圖5）。

圖5 中文文獻作者合作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表5 中文文獻中土壤微生物宏基因組研究領(lǐng)域發(fā)文量排名前10位的作者

2.4 主要期刊分析

在中文文獻中，收錄文獻位居第一的是《生態(tài)學(xué)報》，共收錄41篇，占比5.45%；排名第二、三的是《環(huán)境科學(xué)》、《應(yīng)用生態(tài)學(xué)報》，收錄文章數(shù)量分別為32、25篇，占比分別為4.26%、3.32%；隨后是《土壤學(xué)報》、《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》、《中國中藥雜志》、《林業(yè)科學(xué)》、《中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報》、《草業(yè)學(xué)報》和《中草藥》，但其文獻收錄量很少，均在10篇以下（表6）。

表6 中文文獻中收錄土壤微生物宏基因組研究文獻數(shù)量排名前10位的期刊

在英文文獻中，《Frontiers in Microbiology》以122篇的文獻收錄量位居首位，占比6.03%；《Plos One》的文獻收錄量為95篇，居第二，占比4.70%；第三是《Applied and Environmental Microbiology》，文獻收錄量為86篇，占比4.25%（表7）。

表7 英文文獻中收錄土壤微生物宏基因組領(lǐng)域文獻數(shù)量排名前10位的期刊

2.5 核心文獻分析

被引頻次是衡量論文質(zhì)量的最直接指標，同時也能反映科研人員的科研水平和學(xué)術(shù)影響力[20]。

通過中國知網(wǎng)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，被引次數(shù)第一的文獻是《土壤微生物多樣性的科學(xué)內(nèi)涵及其生態(tài)服務(wù)功能》[21]，該文章于2008年9月發(fā)表于《土壤學(xué)報》，主要從物種多樣性、遺傳多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及功能多樣性4個方面探討微生物與環(huán)境之間相互作用的多樣化程度；其被引次數(shù)為554，下載次數(shù)達到9563。排名第二的文獻為《高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評價》[22]，該文章于2014年12月發(fā)表于《微生物學(xué)通報》，該文主要比較了高通量測序與傳統(tǒng)變性的梯度凝膠電泳(DGGE)指紋圖譜技術(shù)，并評價2種技術(shù)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的優(yōu)缺點；其被引次數(shù)400，下載次數(shù)10747。排名第三的文獻為《高通量測序技術(shù)在土壤微生物與多樣性研究中的研究進展》[23]，該文于2014年5月發(fā)表于《中國農(nóng)學(xué)通報》，主要介紹了Solexa、454和Ion Torrent等常用高通量測序技術(shù)的原理和優(yōu)點，并綜述了近年高通量技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中存在的問題、進展以及發(fā)展趨勢；其被引次數(shù)251，下載次數(shù)達到8382（表8）。

表8 土壤微生物宏基因組研究相關(guān)中文文獻分析

將英文文獻導(dǎo)入HistCite軟件中分析得到文獻被引數(shù)據(jù)。其中，引用頻次排名第一的文獻為《Cloning the soil metagenome:a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms》，該文章于2000年6月發(fā)表在《Applied and Environmental Microbiology》，主要探討了將環(huán)境DNA克隆到大腸桿菌BAC文庫中的可行性，該方法為研究宏基因組的系統(tǒng)發(fā)育和功能特性提供了一條途徑[24]，其LCS為164，GCS為729（表9）。排名第二的文獻為《Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes》，該文于2012年12月發(fā)表在《PNAS》，證明了在跨陸地生物群落中，宏基因組學(xué)方法可用于建立對微生物多樣性和功能如何變化的預(yù)測性理解[25]，其LCS為135，GCS為679。排名第三的文獻為《Molecularbiologicalaccessto the chemistry of unknown soil microbes:A new frontier for natural products》，該文章于 1998年發(fā)表在《Chemical＆Biology》，探討了克隆宏基因組以獲取土壤微生物區(qū)系的集體基因組和生物合成機制的概念，其LCS為125，GCS為880[26]。整體來看，LCS排名前10的文獻中70%來源于美國，說明美國在該研究領(lǐng)域的影響力最高。

表9 土壤微生物宏基因組研究相關(guān)英文文獻HistCite分析

2.6 主要研究內(nèi)容分析

利用CiteSpace軟件對文獻進行關(guān)鍵詞共現(xiàn)分析，可以反映出本領(lǐng)域的主要研究內(nèi)容及其相互關(guān)系，進而對未來的發(fā)展做出合理的預(yù)測。從中文文獻的關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖譜來看，目前以宏基因組技術(shù)進行的土壤微生物研究主要是研究土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，其次是土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。研究所選的生境主要有根際、亞熱帶森林以及秸稈還田和香蕉枯萎病所影響的生境，并重點關(guān)注了comammox（全程氨氧化細菌）、amoa（氨氧化細菌）基因和cbbl（固碳細菌）基因。從英文文獻的關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖譜看，目前宏基因組技術(shù)進行的土壤微生物研究主要是細菌群落，所研究的生境包含了根際、沉積物等相關(guān)的生境，并關(guān)注了抗生素耐藥相關(guān)的問題。另外，從關(guān)鍵詞的共現(xiàn)關(guān)系看，中文文獻中各關(guān)鍵詞共現(xiàn)的聯(lián)系頻次沒有英文文獻密集，說明中文文獻在研究內(nèi)容上顯得較單一（圖6～7）。

圖6 土壤微生物宏基因組研究中文文獻的關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖譜

圖7 土壤微生物宏基因組研究英文獻的關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖譜

3 討論

3.1 高通量測序技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，但國內(nèi)缺乏創(chuàng)新性研究

通過中英文文獻的國內(nèi)外機構(gòu)發(fā)文量、影響力的比較分析可見，國內(nèi)科研人員對于新技術(shù)的采用態(tài)度是開放、積極的，積累了大量的研究報道[27]，但是高頻引用文獻較少，而論文的被引頻次是反映科研成果受關(guān)注程度和影響力的基本指標[28]，說明國內(nèi)學(xué)者對于新技術(shù)的使用僅是簡單的應(yīng)用，缺少創(chuàng)新，無論是對方法的創(chuàng)新還是應(yīng)用目的上都需要不斷的完善與進步。基于本研究中關(guān)鍵詞共現(xiàn)圖譜中所呈現(xiàn)的結(jié)果，不論是國內(nèi)還是國外的研究，對于土壤微生物的功能探索仍然較為缺乏，而土壤微生物的研究目標是了解并運用其功能，服務(wù)于整體生態(tài)系統(tǒng)的維持與修復(fù)[29]。因此，建議科研工作者在應(yīng)用高通量測序技術(shù)進行土壤微生物研究的同時，綜合考慮遺傳多樣性與功能多樣性的關(guān)系、土壤微生物多樣性與動植物多樣性的關(guān)系等內(nèi)容。

3.2 研究機構(gòu)與人員之間合作有待提高

在中英文文獻發(fā)文機構(gòu)以及作者的合作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析中可以看出，英文文獻對應(yīng)的研究機構(gòu)及研究人員之間有緊密的合作，而中文文獻所對應(yīng)的國內(nèi)研究機構(gòu)及研究人員中主要是圍繞中科院體系的機構(gòu)及人員形成了一定的合作，而其他機構(gòu)與人員之間合作較少。究其原因，一方面可能是因為不同機構(gòu)與作者所關(guān)注的研究對象和研究內(nèi)容不同；另一方面，是國內(nèi)研究者在交叉學(xué)科領(lǐng)域的研究不足所致。近年來，交叉學(xué)科研究被認為是最容易產(chǎn)生新的科學(xué)和重大突破的研究領(lǐng)域，也是國內(nèi)雙一流建設(shè)的基礎(chǔ)與核心[30-31]。而為了更好地推動世界一流學(xué)科的建設(shè)，相關(guān)管理部門也正在為學(xué)科交叉創(chuàng)設(shè)良好的環(huán)境，鼓勵和推動交叉學(xué)科研究的開展，為此，國家自然科學(xué)基金在時隔11年后于2020年再次成立新的科學(xué)部——交叉科學(xué)部，與目前的八大學(xué)部并列。由此可見，交叉學(xué)科研究是科研創(chuàng)新的新思路，而不同機構(gòu)與人員之間的合作是交叉學(xué)科研究的基礎(chǔ)，加強不同學(xué)科、領(lǐng)域中機構(gòu)與人員之間的合作與聯(lián)系，有利于創(chuàng)新成果的產(chǎn)出，同時也利于提高中國科研人員的國際影響力。

3.3 高通量測序技術(shù)應(yīng)用的研究對象選擇需更全面

土壤微生物包括細菌、真菌、放線菌，但從文獻所關(guān)注的類群來看，CNKI數(shù)據(jù)庫中對于細菌的研究幾乎占了7成，WOS數(shù)據(jù)庫基本只有關(guān)于細菌的研究，由此可見，在土壤微生物的宏基因組研究領(lǐng)域，對不同物種的關(guān)注度是不平衡的。另外，當分別以細菌、真菌、放線菌為主題詞檢索中國知網(wǎng)和Web of Science數(shù)據(jù)庫時，獲得的文獻數(shù)量分別是95.96萬、29.86萬、3.91萬和64.34萬、23.42萬、0.52萬，這也說明當前對于微生物的研究，在類群選擇上比較側(cè)重于細菌類群。從文獻報道來看，土壤微生物中細菌的數(shù)量是最多的，放線菌次之，真菌最少[32]，因此，人們首先將目光投向細菌也是可以理解的，但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在受干擾的生態(tài)系統(tǒng)中，真菌網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性強于細菌，可能在生態(tài)恢復(fù)中發(fā)揮著重要作用[33]，而放線菌是近來發(fā)現(xiàn)的諸多新型抗生素的產(chǎn)生菌[34]，因此，在進行細菌研究的同時，應(yīng)加強對真菌、放線菌的研究。

另外，不同的生境棲息著差異顯著的土壤微生物類群[35]，而由目前2個數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻所呈現(xiàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境的選擇方面中文數(shù)據(jù)庫重點關(guān)注了森林和農(nóng)田的相關(guān)研究，英文數(shù)據(jù)庫則重點關(guān)注于植物根際土壤微生物的研究，對其他環(huán)境如溫泉、極地的關(guān)注較少，而往往正是在這些特殊生境中，人們發(fā)現(xiàn)了大量新物種和新代謝產(chǎn)物[36]。因此，在土壤微生物高通量測序分析中應(yīng)加強對這些特殊生境的研究，這將有可能擴展人們對于微生物遺傳多樣性、物種多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性和功能多樣性的認識[37]。

4 展望

高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，極大地推動了土壤微生物研究，可以預(yù)見，該技術(shù)將繼續(xù)在土壤微生物的研究中發(fā)揮重要作用。同時，基于測序技術(shù)本身的局限，未來的研究應(yīng)同時結(jié)合其他研究手段，如宏蛋白質(zhì)組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏病毒組學(xué)和宏代謝組學(xué)技術(shù)進行功能研究，但也不能忽視傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的作用。