手性差異對水產(chǎn)養(yǎng)殖沉積物環(huán)境中農(nóng)藥氰戊菊酯降解的影響

宋 超，鄒劍敏，汪 倩，陳 曦，方龍香，裘麗萍，陳家長

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫214081；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險評估實驗室（無錫），江蘇無錫214081；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京100000）

0 引言

底泥是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境不可忽略的一部分，既是水體營養(yǎng)的沉積地，也是環(huán)境污染物的蓄積場所[1]。底泥生態(tài)環(huán)境中的物質(zhì)循環(huán)不僅影響著底棲生物的生存，也關(guān)系著整個水體的物質(zhì)和能量平衡。隨著工業(yè)的發(fā)展，有機(jī)污染物在水生態(tài)底泥環(huán)境中的不斷富集，必然會威脅整個養(yǎng)殖環(huán)境。近年來，擬除蟲菊酯不斷被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生安全等領(lǐng)域[2]，氰戊菊酯(fenvalerate，F(xiàn)V)作為常用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，自然成了底泥污染物中常見的一類，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖底泥環(huán)境中也開始被頻繁檢出[3-4]。徐春娟[5]在四川的一些養(yǎng)殖水體中發(fā)現(xiàn)FV殘留的存在，Wang等[6]在沉積物中發(fā)現(xiàn)了FV的普遍存在。FV在環(huán)境中的生態(tài)毒性已經(jīng)被學(xué)者們廣泛研究，其對養(yǎng)殖產(chǎn)品和其他水體生物存在較高的毒性作用[7-9]。然而，F(xiàn)V在底泥環(huán)境中到底存在著怎樣的降解規(guī)律，并沒有研究進(jìn)行探究。FV在底泥中的降解轉(zhuǎn)化將直接決定水體生物的安全，在養(yǎng)殖環(huán)境中，甚至?xí)g接影響?zhàn)B殖產(chǎn)品的質(zhì)量安全。陳莉等[10]研究了FV在不同土壤環(huán)境中的降解趨勢，并發(fā)現(xiàn)其在土壤中的半衰期長達(dá)17.7～25.3天之久。底泥作為類似的復(fù)雜環(huán)境，F(xiàn)V的降解趨勢需要進(jìn)行進(jìn)一步探究。

另外，F(xiàn)V的4種手性異構(gòu)體在環(huán)境中的生態(tài)毒性具有較大的差異[11]，其在底泥環(huán)境中的降解差異并沒有學(xué)者進(jìn)行詳細(xì)闡述。為探究FV及其不同異構(gòu)體在養(yǎng)殖底泥環(huán)境中的降解消除規(guī)律，本研究以池塘底泥為試驗對象，觀察不同添加濃度和不同異構(gòu)體的FV在底泥中的降解情況，以期為養(yǎng)殖池塘底泥中FV殘留的去除及環(huán)境監(jiān)測工作提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用FV標(biāo)準(zhǔn)品（4種手性異構(gòu)體混合物，純度>95%）購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，F(xiàn)V乳油（純度95%）購自湖北安博共創(chuàng)科技有限公司。FV的4種手性異構(gòu)體分別為αR-2S-FV(FV1)、αS-2R-FV(FV2)、αR-2R-FV(FV3)和αS-2S-FV(FV4)，其中FV1和FV2為反式異構(gòu)體，F(xiàn)V3和FV4為順式異構(gòu)體，這4種異構(gòu)體均由95%FV乳油分離純化得到[12]。所用丙酮和正己烷為色譜純?nèi)軇徺I于德國默克試劑生物科技公司。標(biāo)準(zhǔn)品溶于丙酮，在-20℃的條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

底泥樣品材料于2018年5月23日采自揚州江都市吳堡縣羅氏沼蝦養(yǎng)殖塘（取表層1～10 cm底泥）[13]。采樣池塘的主要水質(zhì)指標(biāo)和底泥相關(guān)指標(biāo)詳見表1和表2。試驗開始前對底泥樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留情況進(jìn)行排查，采用1.3的檢測方法，確保所選底泥樣品沒有常規(guī)的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。

表1 采樣池塘底泥的理化指標(biāo)

表2 采樣池塘水的理化指標(biāo)

1.2 試驗設(shè)計

配制濃度分別為10、100 mg/L的FV、αS-2S-FV、αR-2S-FV、α-2R-FV和αR-2R-FV 5種儲備溶液，溶于丙酮。取經(jīng)過滅菌的500 mL三角瓶30個，分為10組，每組設(shè)置3個平行。第1～5組為低濃度組，6～10組為高濃度組，每組中均加入330 g底泥，具體試驗分組設(shè)計如表3。

表3 試驗設(shè)計分組方案

三角瓶用紗布封口，在生化培養(yǎng)箱中于25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)1天后，在三角瓶中加入相應(yīng)藥品，配制成濃度為20 μg/L和200 μg/L的底泥樣品。低濃度設(shè)定值參考趙晨等[14]在底泥環(huán)境中的檢測結(jié)果（平均濃度21.8 μg/L），高濃度值依據(jù)環(huán)境檢出濃度的10倍設(shè)定。培養(yǎng)過程中定期補充蒸餾水（補水量=前次采樣后樣品瓶總重-當(dāng)次采樣前樣品總重）。分別在加藥培養(yǎng)的第0、7、14、21、28天采取15 g左右底泥于50 mL離心管中，用于監(jiān)測樣品瓶中添加FV及其異構(gòu)體的濃度變化和異構(gòu)體轉(zhuǎn)化情況。試驗所用FV（混標(biāo)）的4種手性異構(gòu)體占比情況根據(jù)張敬衛(wèi)等[15]手性異構(gòu)體的分離方法測定。

1.3 氰戊菊酯檢測

1.3.1 樣品前處理 稱取5 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入2 g銅粉后震蕩0.5 min，再加入20 mL正己烷/丙酮(1:1，V/V)混合液。在2000 r/min條件下震蕩渦旋5 min，超聲10 min。將樣品放入冷凍離心機(jī)中，在8000 r/min條件下離心5 min。離心結(jié)束后，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相至氮吹管中，并在40℃水浴條件下用氮氣吹干。用1 mL正己烷/丙酮(6:1，V/V)混合液復(fù)溶，使?jié)饪s液通過已活化的GCB+Florisil固相萃取柱（用10 mL正己烷活化），再用6 mL正己烷/丙酮(6:1，V/V)混合溶液分3次潤洗氮吹管，并作為洗脫液洗脫萃取柱。用氮吹管收集濾過液及洗脫液，在40℃水浴條件下用氮氣吹干，用1 mL正己烷定容。經(jīng)0.22 μm的有機(jī)相濾器過濾，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)測定。

1.3.2 樣品檢測 Agilent-7890A氣相色譜儀；色譜柱：DB-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；檢測條件：載氣為高純氮氣；線速度30 cm/s；進(jìn)樣方式我脈沖不分流，脈沖壓力40 psi，截止時間0.5 min；進(jìn)樣口溫度 260℃；進(jìn)樣量 1 μL；ECD 檢測器；檢測器溫度310℃；尾氣為氮氣；尾吹30 mL/min；升溫程序：100℃，保持1 min，以30℃/min升至250℃，再以20℃/min，升至290℃，保持8 min。

1.3.3 樣品定量 在10～500 μg/L范圍內(nèi)配制梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用外標(biāo)法色譜結(jié)果進(jìn)行定量計算，在對不同色譜峰對應(yīng)的響應(yīng)面積分別進(jìn)行定量計算不同異構(gòu)體濃度。以10倍信噪比作為定量限，該方法定量限為1 μg/L，加標(biāo)回收率范圍在80.70%～94.65%，平均值為87.17%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)氣相色譜定量得出水中藥物濃度后，通過一級反應(yīng)動力學(xué)方程進(jìn)行擬合，方程如(1)所示[16]。

其中，Ct表示藥物在時間t的濃度，C0為藥物初始濃度，t為持續(xù)時間，k為消除速率常數(shù)，并通過式(2)計算半衰期。

所有數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行處理，樣本間FV降解半衰期差異通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行ANOVA分析(P<0.05)，在95%置信水平下(α=0.05)進(jìn)行差異檢驗。小寫和大寫字母分別表示高和低濃度組FV及其手性異構(gòu)體間的多重比較結(jié)果，如果兩組間有相同字母，則表示不顯著，反之顯著。

2 結(jié)果與分析

利用液相手性分離方法，發(fā)現(xiàn)試驗所用FV中的4種手性異構(gòu)體FV1、FV2、FV3和FV4的所占比例分別為25.13%、28.27%、21.92%和24.69%。順式對映體部分所占比例低于反式對映體比例（表4）。

表4 氰戊菊酯在液相色譜中的手性分離結(jié)果

當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)行3周后，轉(zhuǎn)化速率變慢，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物變化開始不斷減少。對FV的濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的各個方程均有較高的相關(guān)性系數(shù)（表5）。擬合結(jié)果表明，F(xiàn)V的降解過程符合一級降解動力學(xué)，初始濃度并不影響FV的降解趨勢。FV及其手性異構(gòu)體在底泥環(huán)境中的半衰期如圖1所示。高濃度組，F(xiàn)V、FV1、FV2、FV3、FV4的半衰期分別為(26.77±1.67)、(36.15±3.34)、(19.45±0.50)、(31.05±0.65)、(23.19±2.80)天。低濃度組，F(xiàn)V、FV1、FV2、FV3、FV4的半衰期分別為(28.97±1.63)、(38.73±2.88)、(19.47±0.91)、(32.05±1.35)、(24.51±1.06)天。高、低濃度組間FV及其手性異構(gòu)體的半衰期沒有顯著差別，表現(xiàn)基本一致，從大到小依次是FV1＞FV3＞FV＞FV4＞FV2。根據(jù)統(tǒng)計性檢驗分析，高、低濃度組，F(xiàn)V1的降解半衰期顯著高于其他異構(gòu)體，F(xiàn)V3顯著高于FV2和FV4。

圖1 底泥樣本中氰戊菊酯及其手性異構(gòu)體的半衰期

表5 氰戊菊酯的降解動力學(xué)方程

FV存在4種不同的手性異構(gòu)體，但在氣相色譜儀器中常以順式和反式對映體2種形式出峰。不同手性異構(gòu)體在環(huán)境中的轉(zhuǎn)化形式如圖2所示[17-18]，F(xiàn)V2與FV3之間會發(fā)生互相轉(zhuǎn)化，F(xiàn)V1與FV4之間會發(fā)生互相轉(zhuǎn)化，均在α-C位置發(fā)生異構(gòu)。所以當(dāng)單個手性異構(gòu)體在環(huán)境中進(jìn)行異構(gòu)體轉(zhuǎn)化時，在色譜峰圖上其相對應(yīng)的對映體峰位置會有新的峰出現(xiàn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度組和低濃度組均存在不同程度的異構(gòu)體轉(zhuǎn)化，圖3和圖4中每條曲線為該FV手性異構(gòu)體對應(yīng)的在α-C位置異構(gòu)的手性異構(gòu)體的干重濃度變化。低濃度和高濃度處理組中的4種手性異構(gòu)體呈現(xiàn)一致的轉(zhuǎn)化趨勢，在培養(yǎng)的第1周之后手性異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化速率開始加快，第3周達(dá)到轉(zhuǎn)化的峰值，之后轉(zhuǎn)化速率便開始顯著下降。

圖2 氰戊菊酯氣相色譜圖及其異構(gòu)體轉(zhuǎn)化規(guī)律

圖3 低濃度組氰戊菊酯各手性異構(gòu)體的轉(zhuǎn)換情況

圖4 高濃度組氰戊菊酯各手性異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化情況

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)V在底泥環(huán)境中的降解過程符合一級降解動力學(xué)方程。不同暴露濃度條件下，F(xiàn)V及其手性異構(gòu)體的降解半衰期無顯著性差異。FV在底泥環(huán)境中有較長的降解周期，其降解半衰期范圍是19.47～38.73天。FV的不同手性異構(gòu)體在底泥環(huán)境中的降解半衰期存在一定差異，在漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測時需要分開進(jìn)行。FV在底泥環(huán)境中存在α-C位置異構(gòu)現(xiàn)象，當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)行一定時間后，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物開始不斷減少。

4 討論

本研究利用FV的液相手性分離方法發(fā)現(xiàn)FV中的4種手性異構(gòu)體的含量所占比例較為相近，按大小順序依次是FV2＞FV1＞FV4＞FV3。整體來看，順式對映體部分所占比例低于反式對映體比例。FV的降解過程為一級反應(yīng)，即FV在底泥環(huán)境中有著固定的降解趨勢，但高濃度FV的降解速率會顯著高于低濃度FV。其原因或許與底泥中微生物群落的反饋作用有關(guān)，高濃度FV對微生物群落造成了較顯著的影響，使得環(huán)境中產(chǎn)生可利用FV的優(yōu)勢種群。Birolli等[19]曾在土壤中分離得到可以加速FV在土壤中降解的菌株。本課題在水體FV降解規(guī)律的研究中同樣發(fā)現(xiàn)微生物對FV降解所起到的重要作用。

根據(jù)FV中手性異構(gòu)體組成比例的不同和其不同手性異構(gòu)體在底泥環(huán)境中的降解半衰期結(jié)果，可以計算得出FV在底泥環(huán)境的降解半衰期范圍在19.47～38.73天之間。相比于Zhang等[20]在水環(huán)境中的研究結(jié)果（FV降解半衰期范圍在4.75～11.95天），本研究中FV在底泥中的降解速率較為緩慢。本研究試驗條件為25℃，高于一般底泥環(huán)境的溫度，可見FV在實際較低溫度環(huán)境中會更難以降解。Cotham等[21]發(fā)現(xiàn)在pH 7.3～7.7的海水/沉積物系統(tǒng)中，F(xiàn)V半衰期為12天，且存在由海水向沉積物中轉(zhuǎn)化的情況。有研究發(fā)現(xiàn)，pH增大會提高FV在沉積物中的溶解度[22]。因此，F(xiàn)V在進(jìn)入水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境后更易在底泥中長時間蓄積，且對底泥環(huán)境存在較大的威脅。所以，在對水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘清塘?xí)r應(yīng)盡量避免使用FV清除野雜魚和甲殼類水生生物，以免造成FV的殘留。

另一方面，F(xiàn)V不同異構(gòu)體在底泥環(huán)境中的降解差異需要引起重視。不同異構(gòu)體間，F(xiàn)V2在底泥環(huán)境中降解最快，其次是FV4、FV3和FV1。Corcellas等[23]發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯的環(huán)境殘留中順式異構(gòu)體比例比反式異構(gòu)體更高。趙晨等[14]發(fā)現(xiàn)太湖和巢湖的底泥沉積物中存在較高濃度的高效FV殘留。本研究并沒有發(fā)現(xiàn)順式對映體和反式對映體在半衰期上的顯著性差異，環(huán)境中順式對映體富集較高與高效氰戊菊酯的大量使用存在一定的關(guān)系[11]。由于順式異構(gòu)體在環(huán)境中有較高的生態(tài)毒性[24]，順式FV在環(huán)境中的生態(tài)危害大于反式FV。目前對于FV的生態(tài)監(jiān)測多是檢測FV的殘留，所以對FV不同異構(gòu)體分開進(jìn)行監(jiān)測和風(fēng)險評估尤為重要。

不同異構(gòu)體除了在降解上的差異之外，還會存在不同手性異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果與Liu等[17]的研究一致，F(xiàn)V同樣在α-C位置發(fā)生異構(gòu)，進(jìn)行順式和反式異構(gòu)體之間的相互轉(zhuǎn)化。Li等[12]發(fā)現(xiàn)，αS,2SFV在向αR,2S-FV轉(zhuǎn)化時，當(dāng)αR,2S-FV增加到一定濃度時便開始減少。本研究4種異構(gòu)體均有著相同的趨勢，當(dāng)FV在第3周轉(zhuǎn)化到最高值時也開始減少。這一結(jié)果說明FV不同異構(gòu)體在降解的同時存在著手性異構(gòu)的相互轉(zhuǎn)化，當(dāng)轉(zhuǎn)化到一定程度時，轉(zhuǎn)化速率開始減慢，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物同樣開始降解。隨著FV暴露時間的增長，F(xiàn)V在環(huán)境中主要存在的消除行為是化學(xué)降解，而不再進(jìn)行手性異構(gòu)體之間的相互轉(zhuǎn)化。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，手性菊酯類農(nóng)藥在極性溶劑和堿性條件下易存在α-C位置的手性異構(gòu)[25-27]。所以，在進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測時，F(xiàn)V樣品應(yīng)在酸性條件下保存非極性溶劑中，確保結(jié)果的穩(wěn)定性。在順式對映體殘留較高的環(huán)境中，可以通過提高環(huán)境pH的方式促進(jìn)順式對映體的轉(zhuǎn)化，以降低FV的生態(tài)毒性。李邵彤[28]發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥不同異構(gòu)體的降解快慢不僅源于環(huán)境理化因素，還與微生物的活動密不可分。所以在促進(jìn)高毒性和殘留濃度較高的異構(gòu)體轉(zhuǎn)化時，可以考慮微生物的作用。