BC@Laccase消減材料優(yōu)化制備及其去除水體中2-氯苯酚性能評(píng)價(jià)

陳 杰 楊 云 胡雪怡 張 勇 龔 宇

（1.上海策安能源科技有限公司，上海，201822；2.浙江理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，浙江杭州，310018；3.生態(tài)環(huán)境部核與輻射安全中心，北京，100082）

隨著我國(guó)工業(yè)經(jīng)濟(jì)的快速、穩(wěn)健發(fā)展，由此引發(fā)的環(huán)境污染問題也伴隨產(chǎn)生；其中，由工業(yè)廢水超標(biāo)排放引起的水環(huán)境污染尤為突出。制漿造紙工業(yè)是工業(yè)廢水產(chǎn)生與排放大戶，廢水排放量占我國(guó)工業(yè)廢水排放總量的20%～30%[1]。紙漿漂白是造紙廢水的主要產(chǎn)生工段，是制漿造紙工業(yè)水污染控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

含氯漂白是我國(guó)制漿造紙工業(yè)在紙漿漂白工段應(yīng)用最廣泛的工藝過程，具有低價(jià)高效、技術(shù)成熟等優(yōu)勢(shì)[2]。在傳統(tǒng)氯漂過程中，紙漿中木素被氯氣、次氯酸鹽等含氯漂劑碎解、溶出，具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的酚類木素碎片在漂白廢水中與殘余氯元素結(jié)合[3]，易生成氯酚類持久性有機(jī)污染物（Persistent Organic Pollutants，簡(jiǎn)稱POPs），具有高毒性、持久性、生物積累性、遠(yuǎn)距離遷移性[4]等特點(diǎn)，對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成危害。2-氯苯酚是其中重要的一類POPs 污染物[5]，已被我國(guó)列為POPs中優(yōu)先控制污染物。

漆酶（Laccase）是一種多組分氧化酶，能氧化酚類、氯酚類、芳香胺類及一些無機(jī)化合物[6]，其在處理水體污染物中表現(xiàn)出操作簡(jiǎn)單、催化效率高且無二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)[7]，可作為綠色催化劑用于水處理[8]、染料脫色[9]和土壤生物修復(fù)[10]等方面。但是，游離形式的漆酶存在較多局限性，如穩(wěn)定性差、重復(fù)利用率低、運(yùn)行成本高[11]等。為了克服這些缺點(diǎn)，可采用固定化技術(shù)，通過固定酶提高漆酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，降低處理成本。

細(xì)菌纖維素（BC）是由特定細(xì)菌產(chǎn)生的一種獨(dú)特形式的纖維素，具有良好的機(jī)械性能、超細(xì)微的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的吸水能力[12-13]，可考慮將其作為固定漆酶的載體。同時(shí)，介體能夠有效提高漆酶的催化效率。這類介體易得失電子，迅速被漆酶氧化成活性高且穩(wěn)定的中間體，作用于底物使其被催化氧化[14]。

為此，基于2-氯苯酚的環(huán)境危害、漆酶的催化優(yōu)勢(shì)以及BC 的載體特性，本研究以2-氯苯酚模擬水體中的POPs 污染物，以芥子酸作為漆酶介體，通過酶固定化技術(shù)將漆酶固定于BC，優(yōu)化制備經(jīng)BC 固定漆酶的BC@Laccase 消減材料，評(píng)價(jià)BC@Laccase 消減材料對(duì)水體中2-氯苯酚的降解和消除能力。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1主要試劑

醋酸桿菌CGMCC 1.1812 購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；葡萄糖（AR）、酵母浸粉（UP）、檸檬酸鈉（純度98%）、硫酸鎂（AR）、醋酸鈉（AR）、冰乙酸（AR）、戊二醛（AR）、2-氯苯酚（AR）、4-氨基安替比林（98%）、氯化銨（AR）、芥子酸（純度98%）均購自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀（AR）購自上海三鷹化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（BR）、磷酸氫二鈉（AR）、氫氧化鈉（AR）、乙酸鈉（AR）、氨水（AR）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，純度98%）、鐵氰化鉀（AR）均購自上海麥克林生化科技有限公司；漆酶（PP）購自盈芯生物科技（上海）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Nicolet 5700 傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR），美國(guó)Thermo Scientific 公司；F1-TGA 209-Libra 熱重分析儀（TGA），德國(guó)Netzsch 公司；S-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM），日本Hitachi 公司；雷磁pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3BC基材培養(yǎng)

將醋酸桿菌置于種子培養(yǎng)基（30 g/L葡萄糖、6 g/L酵母浸粉、10 g/L蛋白胨、1 g/L檸檬酸鈉、2 g/L硫酸鎂）中，在28℃下，以140 r/min 轉(zhuǎn)速攪拌動(dòng)態(tài)培養(yǎng)36 h；按10%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基（30 g/L 葡萄糖、12 g/L酵母浸粉、12 g/L蛋白胨、2 g/L檸檬酸鈉、2 g/L 硫酸鎂、2.7 g/L 磷酸氫二鈉、2 g/L 磷酸二氫鉀），28℃靜態(tài)培養(yǎng)7 天。上述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中120℃滅菌20 min，經(jīng)冷卻后使用。

將發(fā)酵培養(yǎng)基表面懸浮BC 膜取出，清水緩慢沖洗，去除膜表面菌體及殘留培養(yǎng)基成分；置于0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中，70℃水浴至BC 膜呈白色半透明狀取出；去離子水沖洗后置于1%乙酸中浸泡10 min，用去離子水反復(fù)沖洗至中性；將其置于超低溫冰箱中預(yù)冷凍4 h，放入冷凍干燥機(jī)中冷凍48 h，得到BC 干膜，即固定漆酶用BC基材。

1.4BC@Laccase消減材料優(yōu)化制備

將10 mg BC 基材浸入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中，攪拌1 h 使其充分反應(yīng)；將其置于10 mL 漆酶溶液（0.5 mg/mL）中，一定溫度下溫育20 min；于4℃靜置吸附一段時(shí)間。研究固定時(shí)間、固定溫度及環(huán)境pH 對(duì)制備的BC@ Laccase 消減材料酶活的影響。

1.5BC@Laccase消減材料分析表征

1.5.1表觀形貌分析

將BC基材和BC@Laccase 消減材料置于導(dǎo)電膠上鍍金，工作電壓3 kV，通過FESEM 觀察BC 基材及BC@Laccase消減材料的表觀形貌。

1.5.2紅外光譜分析

采用FT-IR 分析BC 基材和BC@Laccase 消減材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)，掃描范圍500～4000 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.5.3熱穩(wěn)定性分析

采用TG 分析游離漆酶及BC@Laccase 消減材料的熱穩(wěn)定性，在N2氣氛保護(hù)下以10℃/min 升溫速率從常溫升至600℃。

1.6BC@Laccase消減材料降解性能評(píng)價(jià)

將BC@Laccase消減材料置于2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L）中，在200 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌降解一段時(shí)間，通過改變介體用量、降解溫度、pH 值及降解時(shí)間確定最優(yōu)的降解工藝及效果。采用4-氨基安替比林法，于最大吸收波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定2-氯苯酚的吸光度，經(jīng)換算計(jì)算其降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1BC@Laccase消減材料優(yōu)化制備

2.1.1固定時(shí)間

固定時(shí)間對(duì)制備的BC@Laccase 消減材料酶活的影響，結(jié)果如圖1(a)所示。由圖1(a)可知，12 h 內(nèi)，游離Laccase 相對(duì)酶活保持穩(wěn)定。BC@Laccase 消減材料的相對(duì)酶活隨著固定時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，固定時(shí)間在6 h 內(nèi)，相對(duì)酶活較高，在82%以上；當(dāng)固定時(shí)間超過6 h，相對(duì)酶活開始持續(xù)下降；可能是因?yàn)殡S著固定時(shí)間的延長(zhǎng)，BC 基材上的吸附位點(diǎn)逐漸被占據(jù)，相關(guān)位阻和擴(kuò)散限制導(dǎo)致其相對(duì)酶活降低。

2.1.2固定溫度

固定溫度對(duì)制備的BC@Laccase 消減材料酶活的影響如圖1(b)所示。由圖1(b)可知，隨著固定溫度不斷上升，游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料的相對(duì)酶活均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)；在25℃達(dá)到最大值98.3%，表現(xiàn)出最佳固定效果。當(dāng)固定溫度低于25℃，游離Laccase 活性受到抑制，相對(duì)酶活較低；當(dāng)固定溫度高于25℃，由于Laccase 氨基酸可能發(fā)生特異性突變，導(dǎo)致游離Laccase 失活量增加，相對(duì)酶活降低[15]。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)由于游離Laccase 被固定后其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，溫度對(duì)BC@Laccase 活性的影響小于游離Laccase。

圖1 固定工藝條件對(duì)BC@Laccase消減材料酶活的影響Fig.1 Influence of immobilizing conditions on enzyme activity of BC@Laccase

2.1.3環(huán)境pH值

圖1(c)為環(huán)境pH 值對(duì)BC@Laccase 消減材料酶活的影響。由圖1(c)可知，在pH 值3.5時(shí)，BC@Laccase消減材料相對(duì)酶活達(dá)到最大值98.5%，表現(xiàn)出最佳固定效果。隨著環(huán)境pH 值繼續(xù)增大，相對(duì)酶活快速下降，這可能與Laccase 周圍支撐微環(huán)境和載體表面產(chǎn)生的質(zhì)子有關(guān)[16]。而由于BC 基材孔道內(nèi)部的微環(huán)境與外界環(huán)境存在的一定差異，固定化可對(duì)孔道內(nèi)pH起到一定的緩沖作用，因此BC@Laccase 比游離Laccase的pH穩(wěn)定性更強(qiáng)。

綜上所述，BC@Laccase 消減材料最佳制備工藝條件為：固定時(shí)間4 h，固定溫度25℃，環(huán)境pH值3.5。

2.2BC@Laccase消減材料分析表征

2.2.1表觀形貌觀察

通過FESEM 對(duì)BC 基材和BC@Laccase 消減材料的表觀形貌進(jìn)行觀察，見圖2。由圖2(a)可以看出，BC 基材表面纖維相互纏結(jié)形成精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維絲層層交織形成三維網(wǎng)絡(luò)，纖維之間存在大量空隙，允許納米物質(zhì)進(jìn)入。這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具有較高的比表面積和良好的透氣、透濕性，適宜作為L(zhǎng)accase 固定載體。在圖2(b)中，由于Laccase 尺寸較小，BC@Laccase 消減材料的大部分Laccase 粒子可以吸附在BC表面或貫穿于基材網(wǎng)絡(luò)中。由于BC基材的納米結(jié)構(gòu)具有非常精細(xì)和相互連通的纖維網(wǎng)絡(luò)，Laccase能在其上均勻分布，較適宜作為L(zhǎng)accase 的固定基材。

圖2 BC基材和BC@Laccase消減材料的FESEM圖Fig.2 FESEM images of BC substrate and BC@Laccase

2.2.2FT-IR分析

BC 基材和BC@Laccase 消減材料的FT-IR 如圖3所示。從圖3 可以看出，對(duì)于BC 基材，3403 cm-1和2899 cm-1處存在O—H 和C—H 拉伸振動(dòng)，1651 cm-1處出現(xiàn)特征峰，代表纖維素的葡萄糖羰基(C—O)[17]。對(duì)于BC@Laccase 消減材料，在1420 cm-1和1363 cm-1處出現(xiàn)了2 個(gè)重要的特征峰，分別代表C—H 的對(duì)稱變形和彎曲振動(dòng)[18]；1057 cm-1處是葡萄糖環(huán)中的骨架—C—O—C—特征峰，897 cm-1處是纖維素骨架中的β-1,4-糖苷鍵；1668 cm-1處出現(xiàn)的酰胺鍵是蛋白質(zhì)的特征結(jié)構(gòu)，表明Laccase已被成功固定在BC基材上。

圖3 BC基材、游離Laccase和BC@Laccase消減材料的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectra of BC substrate,free Laccase and BC@Laccase

2.2.3熱穩(wěn)定性分析

圖4 為游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料的TGA 圖。由圖4 可以看出，在100℃之前，游離Laccase 最先開始分解，主要是其本身含有的水分先流失。游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料主要在250～400℃范圍內(nèi)進(jìn)行熱分解；游離Laccase 的開始分解溫度為250℃，BC@Laccase 消減材料開始分解溫度為300℃；游離Laccase 的最大熱降解溫度在330℃，BC@Laccase 消減材料的最大熱降解溫度在380℃。這是因?yàn)榉纸鉁囟鹊陀?50℃時(shí)，主要是纖維素分子內(nèi)的結(jié)晶區(qū)受到破環(huán)，使其先分解；分解溫度高于250℃時(shí)，主要是酰胺鍵在一定程度上增加其穩(wěn)定性，使其分解溫度增高，表明BC@Laccase 消減材料熱穩(wěn)定性明顯高于游離Laccase。

圖4 游離Laccase和BC@Laccase消減材料的TGA圖Fig.4 TGA curves of free Laccase and BC@Laccase

2.3酶學(xué)特性分析

米氏常數(shù)（Km）是酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，等于酶促反應(yīng)最大反應(yīng)速度1/2 時(shí)的酶濃度。Km值可反映酶與底物的親和力大小，Km值越小，酶與底物的親和力越大。在底物濃度0.2～1 mmol/L ABTS 溶液中，將適量游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料分別與ABTS 溶液反應(yīng)5 min，420 nm 處測(cè)定吸光度變化值，計(jì)算酶促反應(yīng)的初速度V，由Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)處理，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 得出，游離LaccaseKm值為1.018 mmol/L，BC@Laccase 消 減 材 料Km值 為1.086 mmol/L。Laccase 被固定后Km值增大，Laccase 與BC基材間的親和力降低，這主要是由于Laccase 被固定后空間位阻增大，BC 基材與Laccase 活性中心的接觸機(jī)率變小所致。

圖5 游離Laccase和BC@Laccase消減材料的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.5 Lineweaver-Burk double reciprocal graph of free Laccase and BC@Laccase

2.4降解2-氯苯酚性能評(píng)價(jià)

2.4.1介體用量

選定芥子酸作為BC@Laccase 消減材料的催化介體，在降解溫度30℃、pH值6、降解時(shí)間4 h條件下，研究芥子酸用量對(duì)BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解性能的影響，如圖6(a)所示。由圖6(a)可知，BC@Laccase 消減材料催化降解2-氯苯酚性能隨芥子酸用量的增加呈先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)芥子酸用量在4 mmol/L時(shí)達(dá)到最佳降解效果，2-氯苯酚降解率達(dá)66.3%。

2.4.2降解溫度

在芥子酸用量4 mmol/L、pH 值6、降解時(shí)間4 h的條件下，研究降解溫度對(duì)BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解的影響，結(jié)果如圖6(b)所示。當(dāng)降解溫度為25～30℃時(shí)，BC@Laccase 消減材料對(duì)2-氯苯酚的降解率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)降解溫度為30～45℃時(shí)，降解率開始逐漸下降；降解溫度為30℃時(shí)，2-氯苯酚降解率最高達(dá)到76.4%。此外，BC@Laccase 消減材料在25～45℃的較寬溫度范圍內(nèi)對(duì)2-氯苯酚的降解率均在73.0%以上，主要是由于Laccase 被固定后其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降解溫度對(duì)固定Laccase催化性能的影響變?nèi)酢?/p>

2.4.3環(huán)境pH值

在芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、降解時(shí)間4 h 條件下，研究環(huán)境pH 值對(duì)BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解率的影響，如圖6(c)所示。由圖6(c)可知，當(dāng)pH 值＜3時(shí)，BC@Laccase 消減材料的降解性能逐漸增強(qiáng)；當(dāng)pH 值＞3 時(shí)，降解能力迅速降低；當(dāng)pH 值=3 時(shí)，BC@Laccase 消減材料對(duì)催化降解2-氯苯酚效果最佳，降解率達(dá)到63.3%。

圖6 降解條件對(duì)BC@Laccase消減材料催化降解水體中2-氯苯酚性能的影響Fig.6 Effect of degradation conditions on the catalytic degradation of 2-chlorophenol in water by BC@Laccase materials

2.4.4降解時(shí)間

在芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、pH 值3的條件下，研究降解時(shí)間對(duì)BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解率的影響，如圖6(d)所示。由圖6(d)可知，當(dāng)降解時(shí)間為1～5 h 時(shí)，BC@Laccase 消減材料對(duì)2-氯苯酚的降解能力逐漸增強(qiáng)；當(dāng)降解時(shí)間為5～6 h 時(shí)，降解性能出現(xiàn)急劇下降，這可能是由于固定Laccase 在對(duì)2-氯苯酚降解過程中底物濃度的減少導(dǎo)致，降解產(chǎn)物的累積也會(huì)抑制2-氯苯酚的催化降解。當(dāng)降解時(shí)間為5 h 時(shí)，BC@Laccase 消減材料對(duì)2-氯苯酚降解性能最佳，降解率為76.9%。

2.5循環(huán)使用性能

取10 mg BC@Laccase 消減材料在芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、pH 值3、降解時(shí)間5 h 的條件下，催化降解2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L），測(cè)定其溶液吸光度。使用BC@Laccase 消減材料后，通過緩沖溶液多次沖洗，重復(fù)上述操作，BC@Laccase消減材料循環(huán)使用對(duì)2-氯苯酚溶液降解率的影響如圖7 所示。由圖7 可知，經(jīng)過7 次循環(huán)操作，BC@Laccase 消減材料對(duì)2-氯苯酚的催化降解能力仍可保持在最初的84.8%以上，降解率仍保持在65.0%以上，表現(xiàn)出較好的循環(huán)使用性能。

圖7 BC@Laccase消減材料催化降解2-氯苯酚的循環(huán)使用性能Fig.7 Recycling performance of BC@Laccase on catalytic degradation of 2-chlorophenol

3 結(jié)論

以超細(xì)微三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)細(xì)菌纖維素（BC）作為固定漆酶（Laccase）支架，通過戊二醛交聯(lián)將漆酶固定于BC 基材上，制備環(huán)境友好、安全高效的BC@Laccase 消減材料，應(yīng)用于水體中2-氯苯酚的催化降解。

3.1經(jīng)過單因素優(yōu)化得到BC@Laccase 消減材料的最佳制備工藝條件為：固定時(shí)間4 h、固定溫度25℃、環(huán)境pH 值3.5；與游離漆酶相比，BC@Laccase 消減材料在較寬的溫度和pH 值范圍內(nèi)可保持較高酶活，具有良好的穩(wěn)定性。

3.2場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡表明，漆酶吸附于BC基材表面并貫穿于其內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)，BC@Laccase 消減材料的FT-IR 譜圖出現(xiàn)新酰胺鍵特征峰，表明漆酶與BC基材主要通過酰胺鍵結(jié)合并固定。

3.3游離漆酶的米氏常數(shù)（Km）值為1.018 mmol/L，BC@Laccase 消減材料Km值為1.086 mmol/L，較游離漆酶有所增大，漆酶與BC基材間的親和力降低。

3.4當(dāng)芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、環(huán)境pH值3、降解時(shí)間5 h時(shí)，BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到76.9%。

3.5經(jīng)過7 次循環(huán)使用后，BC@Laccase 消減材料對(duì)2-氯苯酚的催化降解能力仍可保持在最初的84.8%以上，表明BC@Laccase 消減材料具有較好循環(huán)使用性能。