林寶妹, 邱珊蓮, 張帥, 吳妙鴻, 張少平, 洪佳敏
大孔樹脂純化嘉寶果葉片多酚及其生物活性和組成分析
林寶妹, 邱珊蓮*, 張帥, 吳妙鴻, 張少平, 洪佳敏
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所,福建 漳州 363005)
為探討嘉寶果()葉片多酚的分離純化方法,對4種樹脂(NKA-2、NKA-9、HPD-826和HPD-400A)進(jìn)行了篩選,并分析了其多酚的抗氧化、體外降糖活性和組成成分。結(jié)果表明,NKA-9樹脂適于嘉寶果葉片多酚純化,最佳工藝條件為:上樣液質(zhì)量濃度2.00 mg/mL、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、上樣流速1.0 mL/min、上樣量204 mL、洗脫流速0.9 mL/min、洗脫量70 mL。嘉寶果葉多酚純度可達(dá)69.86%。嘉寶果葉片純化后的多酚抗氧化及-葡萄糖苷酶抑制活性高于純化前,但-淀粉酶抑制活性低于純化前。HPLC結(jié)果表明,嘉寶果葉片中含有楊梅苷、蘆丁、金絲桃苷和鞣花酸,其中鞣花酸含量最高[(16.15±0.49) mg/g]。因此,NKA-9樹脂適合分離純化嘉寶果葉片多酚,純化后的多酚抗氧化及-葡萄糖苷酶抑制活性增強。
多酚;樹脂;嘉寶果;抗氧化;降血糖;化學(xué)成分
嘉寶果()又名樹葡萄、珍寶果,為桃金娘科(Myrtaceae)擬愛神木屬常綠灌木, 分布于熱帶亞熱帶地區(qū),一年四季均可開花結(jié)果。研究表明,嘉寶果葉片富含多酚類化合物,如楊梅苷、鞣花酸、沒食子酸、單寧等[1–3],具有良好的抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂等功效[1,4–5]。本課題組前期研究表明,嘉寶果葉片多酚與生物活性顯著相關(guān)[1],但采用的是葉片粗提液,粗提液中的雜質(zhì)對準(zhǔn)確評價生理活性有一定影響,難以判斷其生物活性的構(gòu)效關(guān)系,因此探討合適的分離純化方式以獲得純度較高的目標(biāo)物,評價其生理活性及進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定是重要的研究方向。
大孔樹脂綜合了機械篩分與化學(xué)吸附的優(yōu)點,被廣泛用于天然產(chǎn)物活性成分的分離和純化,具有吸附容量大、選擇性高、可重復(fù)循環(huán)利用等特點, 植物提取物中的有效成分可以通過氫鍵或者范德華力等分子間作用力吸附于大孔樹脂上,又在溶劑作用下溶解于溶液中,達(dá)到分離純化的目的[6–7]。不同大孔樹脂由于化學(xué)性質(zhì)與物理結(jié)構(gòu)不同,對不同的多酚具有選擇吸附性。岑葉盛等[8]比較了AB-8、D-101、HPD-100、HPD-400和HPD-600等5種大孔樹脂對白簕()葉多酚的吸附-解吸性能,認(rèn)為HPD-100最佳,多酚純度從12.5%上升為54.5%;Ma等[9]比較了X-5、D-4020、D-101、AB-8、LS-46D、LS305、NKA-9、NKA-2等8種大孔樹脂對迷果芹()莖葉多酚的吸附-解吸性能,認(rèn)為X-5的純化效果最好; 巫永華等[10]考察了4種樹脂對黃精()多酚粗提物的吸附-解吸特性,篩選出最佳純化樹脂AB-8,多酚純度從16.65%提高到68.38%。采用大孔樹脂對嘉寶果葉片的多酚類化合物進(jìn)行分離純化的研究鮮見報道, 本研究選取NKA-2、HPD-826、NKA-9和HPD-400A等4種樹脂,探討樹脂對嘉寶果葉片粗多酚的純化效果,篩選最佳純化樹脂并優(yōu)化純化工藝,對嘉寶果葉片多酚純化前后的抗氧化能力、體外降糖活性和多酚組成進(jìn)行了比較,為嘉寶果葉片多酚生物活性的構(gòu)效分析及其在功能性食品的利用提供理論依據(jù)。
嘉寶果()‘沙巴’品種采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所國家閩臺特色作物種質(zhì)資源圃,隨機選取30株15 a生的健康植株,剪取枝條頂部的嫩葉,葉片質(zhì)地柔嫩且葉脈不清晰,顏色嫩綠或淡紅。
4種樹脂(NKA-2、NKA-9、HPD-826和HPD- 400A)、多酚標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京索萊寶科技有限公司;-葡萄糖苷酶(-glucosidase, G5003-100UN)、4-硝基苯--d-吡喃葡萄糖苷(PNPG, N1377-1G)、豬胰腺-淀粉酶(V900486-100G)、1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)、鄰二氮菲(P9375-5G)均為Sigma產(chǎn)品;阿卡波糖水合物、沒食子酸、蘆丁為日本東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品,純度>98%;抗壞血酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、無水乙醇、淀粉、雙氧水、硫酸亞鐵、碳酸鈉為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品,分析純。
L5S型紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司);FD-1冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);THZ-300C恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);iMARK酶標(biāo)儀(Bio-Rad); Ultimate 3000高效液相色譜儀(Thermo);BSZ-100自動部份收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)。
嫩葉用60℃熱風(fēng)烘至恒定質(zhì)量,粉碎過40目篩,備用。按料液比1 g粉末∶160 mL 40%乙醇,在功率120W、40℃下用超聲波輔助提取10 min, 然后離心(5 170×)取上清液,上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味,得到葉片多酚濃縮液,4℃保存,備用,其質(zhì)量濃度以1 mL粗提液中含原材料質(zhì)量計,單位為mg/mL。
采用福林酚法,以沒食子酸為對照品,標(biāo)準(zhǔn)曲線參照Tohidi等[11]的方法測定,根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線=11.7608-0.0048 (2=0.9991),計算樣品總多酚質(zhì)量濃度,單位為mg/mL。取葉片多酚粗提液與洗脫液,減壓蒸餾至無醇味,凍干,稱量,重新溶解,總多酚純度=(×/)×100%, 式中,為多酚質(zhì)量濃度(mg/mL),為液體體積(mL),為凍干粉質(zhì)量(mg)。
參照巫永華等[10]的方法并稍作修改。稱取預(yù)處理的NKA-9樹脂10.00 g于250 mL的帶塞錐形瓶中,加入100 mL 2.00 mg/mL的葉片多酚粗提液, 塞上瓶塞,于28℃、150 r/min下振蕩,每隔一段時間取上清液測定總多酚質(zhì)量濃度,至濃度無明顯變化時停止取樣。吸附飽和的樹脂抽濾除去上清液,超純水清洗2遍后加入100 mL 70%乙醇,于28℃、150 r/min下振蕩,每隔一段時間取上清液測定總多酚質(zhì)量濃度,計算吸附率與解吸率,確定最佳吸附和解吸時間。
采用最佳吸附和解吸時間,在其余條件不變的情況下,分別設(shè)置上樣液質(zhì)量濃度(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mg/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)洗脫液(50%、60%、70%、80%、90%)、上樣流速(0.50、1.00、1.50、2.00 mL/min)、洗脫流速(0.60、0.90、1.20、1.50 mL/min)等處理,研究各因素對樹脂靜態(tài)吸附和解吸效果的影響,確定最佳上樣液質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、上樣流速和洗脫流速,并根據(jù)曲線計算不同上樣流速的泄漏點(濃度比=10%),確定上樣體積。其中,濃度比=(流出液多酚質(zhì)量濃度/上樣液多酚質(zhì)量濃度)×100%。
根據(jù)NKA-9樹脂純化葉片多酚的最優(yōu)條件進(jìn)行優(yōu)化工藝驗證和放大試驗。將樹脂裝柱量擴大20倍,上樣量為4 080 mL,裝于2.6 cm×60 cm的層析柱中,按照純化工藝,測定凍干粉中的總多酚含量,計算多酚純度。
稱取適量粗提液及洗脫液凍干粉,加入純水溶解獲得質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL的樣品儲備液。參照Tang等[13]的方法測定DPPH·自由基清除能力, 并根據(jù)擬合的質(zhì)量濃度-抑制率直線方程計算樣品對自由基的半數(shù)清除濃度(EC50值)。參照林寶妹等[14]的方法,測定樣品對ABTS+和·OH自由基的清除率,并根據(jù)擬合的質(zhì)量濃度-抑制率直線方程計算EC50值。
-葡萄糖苷酶抑制活性 參照Sichaem等[15]的方法并稍作修改,取樣品或阿卡波糖和-葡萄糖苷酶(0.4 U/mL)各10L,混勻后于37℃溫箱中反應(yīng)10 min,加入50L PNPG (5.0 mmol/L)后再于37℃溫箱反應(yīng)20 min,最后加入100L Na2CO3(0.2 mol/L)終止反應(yīng),于酶標(biāo)儀上405 nm波長處測吸光度A1,同時測定吸光度值A(chǔ)0(樣品為超純水)、吸光度值A(chǔ)2(樣品和反應(yīng)試劑以相應(yīng)溶劑替代)和吸光度值A(chǔ)3(反應(yīng)試劑以相應(yīng)溶劑替代)。-葡萄糖苷酶活性抑制率=[0-(1-3)]/(0-2)×100%。根據(jù)擬合的質(zhì)量濃度-抑制率曲線方程計算樣品對酶的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。
豬胰-淀粉酶抑制活性 參照林寶妹等[16]的方法,測定樣品對豬胰-淀粉酶的抑制率,并根據(jù)擬合的質(zhì)量濃度-抑制率曲線方程計算IC50值。
稱取新綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異綠原酸A、楊梅苷、金絲桃苷、蘆丁、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品各10.00 mg,用甲醇溶解,配成質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,各取適量混合配成9種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)品,新綠原酸和咖啡酸的質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL,對香豆酸為0.20 mg/mL,其余物質(zhì)為0.10 mg/mL,樣品凍干粉用甲醇溶解,用0.22m濾膜過濾后用于HPLC檢測。采用Thermo Ultimate 3000系統(tǒng),紫外檢測器,檢測波長350 nm,Welch C18色譜柱(5m, 4.6 mm×250 mm);流動相A為0.4%磷酸,B相為甲醇,柱溫40℃,進(jìn)樣量5L, 流速0.8 mL/min。流動相(75% A+25% B, 10 min; 60% A+40% B, 25 min; 40% A+60% B, 55 min)依次洗脫。
采用Microsoft Excel 2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算與曲線擬合;所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
具體實現(xiàn)時,在算法模塊內(nèi)部需要另外開辟一塊RAM,稱之為暫存RAM,用于存放信號的中間運算結(jié)果。因為要對信號進(jìn)行依次檢測和迭代估計,所以需要有一塊RAM存放不斷刷新的信號值。算法模塊外部的雙口RAM用于存放原始的信號,稱之為信號RAM。暫存RAM與信號RAM具有同樣的大小,位寬為18,深度為512。
4種型號的樹脂對葉片多酚的吸附和解吸能力有所差異,NKA-2樹脂對葉片多酚的吸附率最高,達(dá)到(92.83±0.39)%,其他3種樹脂的吸附率從高到低依次為HPD-826、NKA-9和HPD-400A,其中HPD- 826和NKA-9的吸附率接近,分別為(83.83±0.74)%和(82.48±0.23)%。吸附率較高的為極性較大的樹脂,如NKA-2、NKA-9和HPD-826, 而極性較小的HPD-400A吸附率較低。采用70%乙醇解吸, 4種大孔樹脂的解吸率依次為HPD-400A [(93.78±1.34)%]> NKA-9[(84.89±0.361.34)%]>HPD-826 (77.51±0.32)%]> NKA-2 [(56.20±0.92)%]。因此,NKA-2對葉片多酚吸附率最高,但解吸率最低;HPD400A的解吸率最高,但吸附率最低;NKA-9和HPD-826的吸附率居中,而NKA-9的解吸率高于HPD-826,能夠?qū)⒋蟛糠值亩喾酉疵撓聛恚虼?,采用NKA-9樹脂對嘉寶果葉片多酚進(jìn)行純化。
吸附與解吸時間 NKA-9樹脂對葉片多酚的吸附率-時間曲線呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(圖1: A),0~20 min,樹脂對葉片多酚的吸附率迅速上升至(77.68±0.64)%,此后,吸附率緩慢上升,至4 h的吸附率達(dá)最大(83.38±0.54)%,隨后趨于平穩(wěn)。因此,4 h后樹脂對總多酚達(dá)到吸附飽和。NKA-9樹脂對葉片多酚的解吸率-時間曲線(圖1: B)與吸附率-時間曲線類似, 呈先上升后平穩(wěn)趨勢,在0~2 h內(nèi), 葉片多酚的解吸率迅速上升至(83.07±1.36)%,此后趨于平穩(wěn)。在解吸后期,解吸率出現(xiàn)輕微降低,說明2 h后總多酚的解吸達(dá)到平衡。
圖1 時間對吸附率(A)和解吸率(B)的影響
上樣液質(zhì)量濃度 由圖2可見,隨上樣液質(zhì)量濃度增加,樹脂的吸附率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)濃度低于2.00 mg/mL時,吸附率呈緩慢上升,最高可達(dá)(82.07±0.76)%;當(dāng)高于2.00 mg/mL時,吸附率呈明顯下降趨勢,最低至(78.27±0.18)%。因此,嘉寶果葉片總多酚上樣液質(zhì)量濃度選擇2.00 mg/mL較為適宜。
乙醇體積分?jǐn)?shù) 從圖3可見,乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%~70%時,多酚解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加迅速上升,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時,解吸率達(dá)到最大值(81.61±1.46)%;乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加, 解吸率略有降低。乙醇體積分?jǐn)?shù)過小會造成洗脫不完全而浪費原材料,乙醇體積分?jǐn)?shù)過大也會造成雜質(zhì)過多,故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%作為后續(xù)試驗洗脫液濃度。
上樣流速 當(dāng)流出液中的多酚質(zhì)量濃度為初始上樣液多酚質(zhì)量濃度的10%時,為樹脂的泄漏點。泄漏點越早出現(xiàn)表明上樣液流經(jīng)大孔樹脂出現(xiàn)吸附不充分的現(xiàn)象越早。由圖4可見,隨著流出液體積的增加,流出液中的多酚質(zhì)量濃度在不斷上升,樹脂的吸附率在不斷下降;當(dāng)洗脫流速為1.0、1.5、2.0 mL/min時,大孔樹脂出現(xiàn)泄漏點時累積上樣體積分別為204、134、108 mL,說明當(dāng)上樣液流速為1.0~2.0 mL/min時,隨著洗脫流速降低,多酚與樹脂間的接觸更充分并能有效吸附,泄漏點推遲出現(xiàn),繼續(xù)降低流速至0.5 mL/min,泄漏點處累積上樣體積開始降低,為196 mL,說明繼續(xù)降低流速已不能進(jìn)一步推遲泄漏點的出現(xiàn)。故選擇1.0 mL/min為上樣液流速,此流速下最佳上樣體積為204 mL。
圖2 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響
圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響
洗脫流速 從圖5可見,以1.2、1.5 mL/min流速進(jìn)行洗脫,得到的峰形較寬,且有較明顯的拖尾現(xiàn)象,說明流速過快導(dǎo)致洗脫不完全,洗脫效果差; 以0.6、0.9 mL/min流速進(jìn)行洗脫,得到的峰無明顯拖尾現(xiàn)象,洗脫效果較好,但洗脫流速過慢,所需洗脫時間增加,延長生產(chǎn)周期使生產(chǎn)成本增加, 且0.6 mL/min流速下的峰寬略大于0.9 mL/min。故選擇0.9 mL/min作為洗脫流速,洗脫液體積為70 mL。
圖4 上樣流速對吸附效果的影響
圖5 洗脫流速對解吸效果的影響
驗證和放大試驗 嘉寶果葉片多酚提取物純化驗證試驗表明,純化前葉片粗提物的總多酚純度為(30.81±0.36)%,經(jīng)NKA-9樹脂純化后的總多酚純度為(69.86±0.35)%。工藝放大試驗表明,純化前葉片粗提物的總多酚純度為(28.68±0.74)%,經(jīng)NKA-9樹脂純化后的純度為(64.44±0.30)%,說明NKA-9樹脂對嘉寶果葉片多酚提取物總多酚的純化效果在工藝放大20倍后仍保持穩(wěn)定。
從表2可見,經(jīng)NKA-9樹脂純化后葉片的總多酚純度由(30.81±0.36)%提高到(69.86±0.35)%, 提高了近1.3倍,說明葉片粗提液中的雜質(zhì)得到有效去除,實現(xiàn)葉片多酚的富集和純化。純化后的葉片多酚對DPPH·、ABTS+和·OH等3種自由基的半數(shù)清除濃度(EC50)均極顯著低于純化前(<0.01),純化前后的葉片多酚對這3種自由基的清除能力均極顯著高于Vc,說明葉片多酚具有良好的抗氧化能力,且純化后抗氧化能力進(jìn)一步提高。
表2 嘉寶果葉片多酚抗氧化(EC50值)與體外降糖活性(IC50值)
同列數(shù)據(jù)后不同大寫和小寫字母分別表示差異極顯著(<0.01)和差異顯著(<0.05)。
Data followed different capital and small letters within column indicate significant different at 0.01 and 0.05 levels, respectively.
同時,純化后的葉片多酚抑制-葡萄糖苷酶活性極顯著高于純化前(<0.01),對酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)低于純化前,說明純化后對-葡萄糖苷酶有抑制活性的物質(zhì)得到富集;純化后的葉片多酚對豬胰-淀粉酶的抑制活性極顯著低于純化前,說明NKA-9樹脂純化后可能丟失了部分對豬胰-淀粉酶有較強抑制作用的物質(zhì);純化前后的葉片多酚對-葡萄糖苷酶的抑制活性高于阿卡波糖,IC50僅分別為阿卡波糖的10.22%和7.05%,表現(xiàn)出較強的-葡萄糖苷酶抑制活性,但純化前后的葉片多酚對豬胰-淀粉酶的抑制活性均低于阿卡波糖,IC50分別為阿卡波糖的3.93和5.64倍,說明葉片多酚對豬胰-淀粉酶的抑制活性較弱。
圖6為葉片多酚純化前后的HPLC色譜圖,純化前后的葉片多酚在350 nm處的液相譜圖接近,色譜峰數(shù)量一致,但純化后的峰信號增強,峰面積增大。采用單一標(biāo)準(zhǔn)品確定出峰時間,并以9種單體多酚為混合標(biāo)樣,通過與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰保留時間對比,初步確定嘉寶果葉片中有4種多酚單體成分,分別為楊梅苷、金絲桃苷、蘆丁和鞣花酸。純化前后的葉片多酚提取物均以鞣花酸為主,其次為楊梅苷、金絲桃苷和蘆丁(表3)。
不同的大孔樹脂吸附-解吸性能不同,需根據(jù)目標(biāo)分離物進(jìn)行篩選。根據(jù)前期研究結(jié)果,嘉寶果葉片含有較多中極性~極性的酚類物質(zhì)[17],因此本研究選擇NKA-2、HPD-826、NKA-9和HPD-400A等4種中級性~極性大孔樹脂,結(jié)果表明,極性樹脂NKA-9對嘉寶果葉片多酚的吸附和解吸能力均較好,能夠有效吸附葉片多酚,同時葉片多酚也能較好地被洗脫下來,經(jīng)過純化,嘉寶果葉片多酚提取物中多酚純度從30.81%提高至69.86%。許多研究表明NKA-9樹脂適用于多種植物多酚的分離純化,如苦菜多酚經(jīng)過NKA-9樹脂純化后純度從14.72%上升為72.38%[18]。NKA-9樹脂對沙棗多酚表現(xiàn)出較好的吸附性能與解吸效果,能很好地富集純化沙棗多酚,純化后,純度從17.14%上升至82.67%[19]。朱潔等[20]采用5種大孔吸附樹脂分離純化梨幼果多酚,認(rèn)為NKA-9大孔樹脂性能較好,最適合用來純化梨幼果多酚,純化后梨幼果多酚的純度從6.23%提高到30.68%。朱怡霖等[21]比較了8種大孔樹脂對橫山老黑豆酚類化合物的靜態(tài)吸附和解吸特性,篩選出NKA-9樹脂,其吸附和解吸效果最好,且分離純化前后的橫山老黑豆酚類物質(zhì)種類沒有變化,含量降低很少。本研究也表明NKA-9大孔樹脂適用于嘉寶果葉片多酚的分離純化。
大孔樹脂的動態(tài)吸附-解吸試驗參數(shù),如上樣液質(zhì)量濃度、上樣流速、洗脫液體積分?jǐn)?shù)、洗脫速度等,均可影響大孔樹脂的吸附-解吸效果。邵佩等[22]研究了獼猴桃多酚的純化工藝,結(jié)果表明多酚質(zhì)量濃度2 mg/mL、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、上樣量350 mL、洗脫液體積200 mL時,樹脂對多酚的吸附-解吸效果最好。Park等[23]研究表明,昆布多酚的最佳純化參數(shù)為上樣流速2.46 mL/min、洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)50%和洗脫流速1.64 mL/min。本研究中,在相同流速下,NKA-9樹脂對葉片多酚的吸附率隨上樣液質(zhì)量濃度的增加呈先上升后下降趨勢,可能是由于大孔樹脂表面吸附隨上樣液質(zhì)量濃度的增加而趨于飽和,達(dá)最大吸附量后,繼續(xù)提高上樣液質(zhì)量濃度, 反而因為傳質(zhì)速率低、雜質(zhì)量增多導(dǎo)致吸附率降低[24], 因此選擇2 mg/mL為上樣液質(zhì)量濃度。上樣流速是影響NKA-9樹脂吸附嘉寶果葉片多酚的重要因素之一,上樣速度過快,多酚類成分與大孔樹脂接觸時間過短,未充分吸附便隨流出液流出;上樣速度過慢,吸附耗時長,生產(chǎn)效率低[25],因此選擇1.0 mL/min為上樣流速。乙醇體積分?jǐn)?shù)過低無法將多酚與樹脂間形成的氫鍵打斷,洗脫率低;乙醇體積分?jǐn)?shù)過高,水含量少,致使水溶性多酚難以被洗脫下來,同時可能導(dǎo)致其他雜質(zhì)洗脫增加[25–26]。當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)為70%時,嘉寶果葉片多酚的解吸率最高,可能是由于嘉寶果葉片多酚與70%乙醇極性相近,易將多酚從大孔樹脂中洗脫下來[25]。洗脫速度也是多酚解吸的重要因素,采用過快或者過慢流速進(jìn)行洗脫,得到的洗脫峰形較寬,呈前沿或拖尾,洗脫效果差。洗脫速率過快,洗脫劑未與樹脂充分接觸,洗脫不完全;洗脫速率過慢,洗脫下來的多酚可能出現(xiàn)復(fù)吸、雜質(zhì)增多并且生產(chǎn)周期延長[26]。因此,根據(jù)洗脫曲線選擇0.9 mL/min為洗脫流速。
表3 嘉寶果葉片多酚提取物成分及含量(mg/g)
圖6 多酚標(biāo)準(zhǔn)品及嘉寶果葉片多酚的HPLC圖。A: 粗提液; B: 純化液; C: 標(biāo)準(zhǔn)品; 1: 新綠原酸; 2: 咖啡酸; 3: 對香豆酸; 4: 阿魏酸; 5: 異綠原酸A; 6: 楊梅苷; 7: 金絲桃苷; 8: 蘆丁; 9: 鞣花酸。
嘉寶果葉片多酚經(jīng)NKA-9樹脂純化后,純化物的自由基(DPPH·、ABTS+、·OH)清除能力高于粗提物。油茶葉多酚經(jīng)HPD-600樹脂純化后,對油脂的抗氧化能力提高[27];山楂葉多酚經(jīng)AB-8樹脂純化后,對DPPH·、·OH自由基的清除能力,總還原力及Fe2+螯合能力均提高[25],這與本研究結(jié)果一致,可能是因為大孔樹脂對多酚類物質(zhì)起到純化和富集作用,而抗氧化能力與總酚含量正相關(guān)[1,27]。純化后的嘉寶果葉片多酚對-葡萄糖苷酶的抑制作用增強,該結(jié)果與黑豆皮多酚純化前后的-葡萄糖苷酶抑制活性變化一致,不同的是,嘉寶果葉片多酚對-淀粉酶的抑制活性相比純化前下降,而黑豆皮多酚的則隨多酚純度升高而增強[28]。這可能是因為-淀粉酶和-葡萄糖苷酶為結(jié)構(gòu)不同的兩種消化酶,活性抑制成分不同,嘉寶果葉片多酚經(jīng)極性樹脂純化后,弱極性多酚丟失導(dǎo)致對-淀粉酶的抑制活性降低,且除多酚外,可能還有其他非酚類成分也有-淀粉酶抑制作用,在純化過程中被除去也可導(dǎo)致嘉寶果葉片多酚對-淀粉酶的抑制活性減弱。但從結(jié)果上看,嘉寶果葉片多酚純化前后對-淀粉酶IC50值仍較為接近,說明僅有少部分酶抑制活性成分丟失。
從嘉寶果葉片提取物中檢測出楊梅苷、金絲桃苷、蘆丁和鞣花酸等4種單酚物質(zhì),其中含量最高的是鞣花酸。據(jù)報道,嘉寶果葉片含有楊梅苷、鞣花酸、沒食子酸和鄰香豆酸等酚類化合物[2]。檢測方法、儀器和成分的提取方法不同都可能導(dǎo)致檢測到的成分存在一定差異[29–30]。本研究采用與標(biāo)準(zhǔn)品比對保留時間的方法,僅檢出提取物中含有楊梅苷、金絲桃苷、蘆丁和鞣花酸,未檢測到?jīng)]食子酸和鄰香豆酸。本研究通過9種標(biāo)準(zhǔn)品來鑒定嘉寶果葉片的酚類物質(zhì)組成,但對成分的進(jìn)一步確認(rèn)需要更進(jìn)一步的純化以制備出單體組分,并通過HPLC- MS、核磁共振等手段進(jìn)行鑒定。
因此,NKA-9大孔樹脂分離純化嘉寶果葉片多酚的最佳工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度2.00 mg/mL、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、上樣流速1.0 mL/min、上樣量204 mL、洗脫流速0.9 mL/min、洗脫量70 mL,此條件下嘉寶果葉片多酚純度為69.86%。純化后的嘉寶果葉片多酚抗氧化活性及對-葡萄糖苷酶的抑制活性提高,對-淀粉酶的抑制作用略降低。嘉寶果葉片多酚提取物主要組成成分為鞣花酸,此外還含有楊梅苷、金絲桃苷和蘆丁。試驗結(jié)果對嘉寶果葉片多酚的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。在后續(xù)的研究中,將進(jìn)一步分離純化嘉寶果葉片多酚,獲得多酚單體,進(jìn)一步確認(rèn)組成成分。
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Biological Activities and Composition Analysis of Polyphenols in Jaboticaba Leaves Purified with Macroporous Resin
LIN Baomei, QIU Shanlian*, ZHANG Shuai, WU Miaohong, ZHANG Shaoping, HONG Jiamin
(Fujian Academy of Agricultural Sciences, Institute of Subtropical Agriculture, Zhangzhou 363005, Fujian, China)
To study the separation and purification of polyphenols fromleaves, four resins, such as NKA-2, NKA-9, HPD-826 and HPD-400A, were screened, and the antioxidant,hypoglycemic activities and components of polyphenols were analyzed. The results showed that NKA-9 resin was suitable for the purification of polyphenols from the leaves. The optimum conditions were as follows: sample concentration of 2.00 mg/mL, flow rate at 1.0 mg/mL and sample loading of 204 mL, 70 mL 70% (/) ethanol as elution with velocity at 0.9 mL/min. Under the conditions, the purity of polyphenols from the leaves could reach 69.86%. The antioxidant and-glucosidase inhibitory activities of purified polyphenols from leaves ofwere stronger than those of crude polyphenols, but the inhibitory activities on-amylase were lower. According to HPLC, the monophenols in leaves ofcontained myricetin, rutin, hyperoside and ellagic acid, and ellagic acid content was highest with (16.15±0.49) mg/g. Therefore, NKA-9 resin was suitable for separation and purification of polyphenols from leaves of, the antioxidant and-glucosidase inhibitory activities of purified polyphenols increased.
Polyphenol; Resin; Jaboticaba; Antioxidation; Hypoglycemic; Chemical composition
10.11926/jtsb.4352
2020-12-07
2021-02-03
福建省科技計劃公益類專項(2019R1030-4); 福建省自然科學(xué)基金項目(2020J011369); 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新團隊項目(STIT2017-3-4)資助
This work was supported by the Special Project for Public Welfare for Research Institute in Fujian (Grant No. 2019R1030-4); the Project for Natural Science in Fujian (Grant No. 2020J011369); and the Project for Youth Innovation Team of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. STIT2017-3-4).
林寶妹(1988~ ),女,助理研究員,研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail: yogobm@qq.com
. E-mail: slqiu79@163.com