極小種群野生植物海南風吹楠的遺傳多樣性研究

蔡超男, 侯勤曦, 慈秀芹, 肖建華, 張燦瑜, 李捷*

極小種群野生植物海南風吹楠的遺傳多樣性研究

蔡超男1,2, 侯勤曦3, 慈秀芹1,4, 肖建華1,5, 張燦瑜1,5, 李捷1,4*

(1. 中國科學院西雙版納熱帶植物園，昆明 650223; 2. 臺州學院高等研究院, 浙江 臺州 318000；3. 四川省大熊貓科學研究院，成都 610081; 4. 中國科學院核心植物園，云南 勐臘 666303; 5. 中國科學院大學，北京 100049)

為探討海南風吹楠()的瀕危原因，利用限制性酶切位點相關的DNA測序技術(RAD-seq)開發(fā)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，評估居群的遺傳多樣性和遺傳結構。結果表明, 海南風吹楠的遺傳多樣性較低(=0.167)，其中BWL居群表現出最高的遺傳多樣性；居群間存在中等程度的遺傳分化(F=0.120)。Structure分析表明居群的最佳聚類值為2，但個別居群的遺傳結構混雜，Mantel檢測結果也表明遺傳距離和地理距離沒有相關性(=0.733，<0.075)。自身更新能力低以及過度的人為活動干擾，可能是導致其瀕危的主要原因。建議加強對遺傳多樣性高的居群(BWL和YGL)進行就地保護; 對生境破壞嚴重的居群(EXL和DLS)進行近地或遷地保護，以增加居群間的基因交流，同時構建核心種質，防止遺傳資源丟失加劇。

海南風吹楠；RAD-seq；遺傳多樣性；極小種群；遺傳結構

隨著人類社會和科學技術的進步與發(fā)展，全球氣候持續(xù)發(fā)生變化，很多物種處于瀕危狀態(tài)，生物多樣性正以前所未有的速度喪失，甚至正在推動地球歷史上的第六次大規(guī)模滅絕，因此對生物多樣性保護制定合理高效的保護計劃顯得尤為重要和迫切[1–3]。當前物種保護最突出和最具爭議的一個問題是：由于保護所有的瀕危物種非常困難，哪些物種才是最需要優(yōu)先保護的？2005年云南省林業(yè)廳首次在國內提出“極小種群野生植物(plant species with extremely small population, PSESP)”的概念，是指在特殊地區(qū)的特定環(huán)境下長期形成的、分布區(qū)域狹窄或呈不連續(xù)分布，由于物種本身的因素或長期受到外界脅迫因素的干擾，種群和個體的數量不斷減少已經低于物種穩(wěn)定存活的最小生存種群，難以維系物種的正常繁衍而隨時瀕臨滅絕的植物種類[4–5]。經過十幾年的不斷發(fā)展和完善，極小種群野生植物的概念已得到國家和科學界的認可。

海南風吹楠()隸屬于肉豆蔻科(Myristicaceae)風吹楠屬，是熱帶雨林的標志物種，且具有很高的經濟和藥用價值，主要分布在海南省[6–8]。由于島上天然林被大量砍伐，加上居民的保護意識薄弱等原因，當前被列入全國極小種群野生植物物種名錄中[9]，說明對該物種的保護工作已迫在眉睫。物種保護的核心是要盡可能地保護其遺傳變異水平，它是物種適應復雜多變環(huán)境的基礎，一個物種的種內遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，物種的進化潛力及對環(huán)境變化的適應能力就越強，因此對海南風吹楠開展保護遺傳學研究對于制定有效的保護策略至關重要[10–11]。

近年來，有關海南風吹楠的基礎研究主要集中在種子萌發(fā)、生理特性、生物學特性以及群落區(qū)系特征等方面[12–14]，居群的遺傳多樣性研究尚處于起步階段[15]。物種的正確界定是了解、保護和利用生物資源的前提[16–17]。Cai等[18]的研究表明，海南風吹楠僅分布于海南省，而Jiang等[15]基于簡單序列重復區(qū)間(inter-simple sequence repeat, ISSR)分子標記對海南風吹楠開展的遺傳多樣性研究，將分布在廣西地區(qū)的滇南風吹楠認定為海南風吹楠，因此不能正確評估海南風吹楠的遺傳多樣性水平。此外, 采用的ISSR分子標記不能區(qū)分顯性純合和顯性雜合基因以及篩選出的核苷酸位點僅能覆蓋基因組的一小部分，導致對海南風吹楠的遺傳多樣性評估不準確[19–20]。與ISSR、簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)等傳統分子標記以DNA片段的長度變化作為檢測手段不同，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)直接以序列變異作為標記[21]。SNP標記的主要優(yōu)點是其在全基因組分布均勻且數目多能夠穩(wěn)定遺傳，檢測容易、易實現自動化[22]。新一代DNA測序技術的應用，特別是限制性酶切位點相關的DNA測序技術(restriction- site associated DNA sequencing, RAD-seq)的出現, 使得低成本、耗時短及高通量開發(fā)非模式物種的SNP分子標記更為便捷，使得越來越多的研究者利用該技術對物種進行保護遺傳學研究[23–25]。

因此，為對極小種群野生植物的保護提出合理可靠的建議，在準確把握物種界定后，利用新的測序技術手段開發(fā)SNPs標記對海南風吹楠進行保護遺傳學等相關研究是十分必要的。本研究利用RAD-seq技術對極小種群野生植物海南風吹楠進行遺傳多樣性評估和遺傳結構的探討，以闡明該物種的種質遺傳背景，進而提出具有針對性的保護策略。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于2017年5月在海南省采集海南風吹楠5個自然居群的新鮮、幼嫩葉片，用硅膠迅速干燥。每份材料距離間隔盡量大于100 m，共50份材料(表1，圖1)，標本存放于中國科學院西雙版納熱帶植物園標本館(HITBC)。

1.2 總DNA提取

野外采集經硅膠干燥后的新鮮葉片存儲于–20℃冰箱。利用4×CTAB法提取植物總DNA[26]。檢測合格的DNA樣品(總量≥1g，濃度≥20/L)送到深圳華大基因科技服務有限公司(BGI)進行測序。因該物種的DNA提取存在一定困難，最終根據測序質量要求僅獲得5個居群共20株個體(圖1, 表2)。

1.3 DNA文庫構建和測序

RAD-seq參考Davey等[27]的方法。用R I限制性內切酶(5?-GAATTC-3?)處理基因組DNA，得到具有粘性末端的酶切片段。在酶切后DNA兩端加上P1接頭并機械打斷，電泳回收目的片段；在酶切片段的另一端加上P2接頭，用P1、P2引物進行PCR擴增，回收目的片段；對檢測合格的樣品進行上機測序，采用Illumina Hiseq 2000進行雙端測序(PE=150 bp)。樣品的文庫構建和測序都在深圳華大基因科技服務有限公司完成。

表1 海南風吹楠采樣信息

圖1 海南風吹楠的采樣點

1.4 個體聚類與居群聚類

首先對原始數據進行質量過濾，統計reads數、Q值(單堿基錯誤率)、GC含量等參數，保留Q20值達到98%以上的數據。利用軟件Stacks v.2.2[28]對數據進行分析處理。首先，使用對所有樣本的1’reads進行聚類，將深度在3以上的相似序列堆列在一起，形成1個stack，允許生成stack的兩條序列至多有2個堿基的差異(即設置參數m=3和M=2)；隨后利用通過比對，生成個體間的一致性位點(consensus loci)，并將信息寫入目錄文件catalog (設置參數n=2)；然后利用將由生成的stack再重新匹配到catalog文件，以確定個體內相應位點的基因型。接著執(zhí)行程序，以便將數據從按樣本聚類轉換到按RAD位點進行聚類，得到位點比對矩陣(i.e: *.bam)。利用整合雙端序列(1’reads和2’reads)形成contig，然后將contig比對到locus上，并在群體水平call變異以及分型，找出每個個體SNPs。

1.5 遺傳多樣性分析

利用軟件Stacks v.2.2[28]中的程序進行SNPs過濾及獲取遺傳多樣性參數。為挖掘SNPs分子標記，設置參數：--write_single_snps、r=0.8、p=3。--write_single_snps表明僅輸出第一個SNPs位點作為后續(xù)遺傳多樣性分析的標記；r為0.8表明該位點在某一居群中至少有80%的個體共享; p為3表明該位點至少被3個居群共享。為了評估物種水平上的遺傳多樣性，將20個海南風吹楠樣品作為1個居群來處理，并要求位點在居群中至少為80%的個體共享(p=1, r=0.8)。利用SNPs標記評估居群的遺傳多樣性，計算以下參數：在所有位點和變異位點中的私有等位基因數(private allele number,)、期望雜合度(expected heterozygosity,)、觀測雜合度(observed heterozygosity,)及近交系數(inbreeding coefficient,F)等。

利用PGDSpider v 2.1.1.5[29]軟件對文件格式進行轉換。采用Arelequin v 3.5[30]軟件進行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)，計算遺傳變異在居群間和居群內的分布及居群間的遺傳分化系數(F)以及物種水平上的基因流()= (1–F)/4F[31]。使用軟件Stacks v.2.2[28]中的程序計算居群間的F值，居群間的地理距離通過居群的地理坐標信息進行計算。在R環(huán)境中使用vegan包的“Mantel”函數[32]檢驗居群的遺傳距離與地理距離的相關性。

1.6 群體的遺傳結構分析

利用軟件Structure v. 2.3.4[33]進行群體的遺傳結構分析。數據分析時選擇混合模型(admixture model)和等位基因頻率相關模型(allele frequencies corre- lated)，程序的參數“l(fā)ength of burn-in-period”設定為1 000 000, “number of MCMC replications after burnin”設定為2 000 000，K值設定為1～5，迭代次數設定為10次。運行結果壓縮后上傳至軟件Structure Har- vester v. 0.6.94[34]進行分析，然后利用軟件CLUMPP v. 1.1.2[35]和DISTRUCT v. 1.1[36]將最佳K值的10次重復運行的結果整合起來，生成群體遺傳結構圖。

2 結果和分析

2.1 測序數據與RAD位點數

從表2可見，海南風吹楠序列的原始reads數(clean reads)為6 894 604～40 535 670，個體平均為17 855 431。測序平均Q20為98.6%，平均GC含量為40.8%。為確保某1位點至少被3個居群的80%個體共享，評估居群遺傳多樣性時共保留142 140個RAD位點，得到11 225個SNPs用于后續(xù)的遺傳多樣性和群體結構分析。

表2 海南風吹楠的RAD測序數據

2.2 遺傳多樣性

從表3可見，物種水平上，極小種群野生植物海南風吹楠的觀測雜合度()為0.151，期望雜合度()為0.167，核苷酸多樣性()為0.172，近交系數(F)為0.081。居群水平上，海南風吹楠的為0.147～0.184,為0.075～0.175，為0.151～0.192，F為–0.014～0.045。同時，BWL居群表現出最高的遺傳多樣性。

2.3 居群遺傳分化與遺傳結構

從表4可見，海南風吹楠物種水平的F為0.081,群體間的F為0.070～0.230。尖峰嶺(JFL)與吊羅山(DLS)居群的遺傳分化系數最大，Mantel分析結果表明地理距離和遺傳距離具有正相關性，但不顯著(=0.733,<0.075, 圖2)。AMOVA分析結果表明遺傳變異主要分布在居群間(大約75.47%)，只有24.53%的遺傳變異源自居群內(表5)。居群遺傳結構分析結果表明，當K=2時，ΔK散點曲線出現最大值，表明海南風吹楠群體的最佳聚類值為2，然而根據其地理分布，居群遺傳結構分析無法明顯地劃分為2個組(圖3)，這可能是居群及個體數太少或者居群間距離太近導致的。

表3 海南風吹楠物種和居群水平的遺傳多樣性

YGL、EXL、DLS、BWL、JFL見表1。以下圖表同。

YGL, EXL, DLS, BWL, JFL see Table 1. The same is followed Tables and Figures.

表4 海南風吹楠居群的遺傳距離(Fst, 右上)與地理距離(km, 左下)

圖2 海南風吹楠居群間的遺傳距離(Fst)和地理距離(km)的Mantel檢驗

3 結論和討論

3.1 海南風吹楠的遺傳多樣性

本研究利用RAD-seq技術分析了極小種群野生植物海南風吹楠5個居群共20個個體的遺傳多樣性，結果表明，遺傳多樣性()在物種水平(0.167) 和居群水平(0.136)上都較低。與瀕危植物云南藍果樹(, 0.321)[38]相比，海南風吹楠有更低的遺傳多樣性。目前利用其他分子標記的研究也表明瀕危和極小種群植物的遺傳多樣性低，用RAPD標記版納青梅()的 0.169[39]、ISSR標記伯樂樹() 的0.141[40]，用AFLP標記琴葉風吹楠()的0.152[41]等。

表5 海南風吹楠居群間和居群內遺傳變異的AMOVA分析

圖3 基于Structure分析的海南風吹楠聚類的后驗概率圖(K=2)。A: 每個K值對應的delta K; B: K=2。

植物的遺傳多樣性受到多種因素的影響，是其進化歷史、地理分布范圍、繁殖方式等多種因素綜合作用的結果[42]。本研究表明，海南風吹楠居群間的基因流有限(=0.081)，且存在近交現象(F> 0)，這可能是因為該物種主要生長在河谷或狹谷石縫的陰濕環(huán)境中，居群個體數少、林下幼苗及幼樹少，在新的環(huán)境很難拓殖并擴大居群的規(guī)模，導致居群內近交衰退現象，物種表現出較低的遺傳變異[42]。海南風吹楠的種子呈橢圓形，長約4.5 cm，直徑約2.5～ 3 cm，主要靠重力傳播，結合其種子較大導致其傳播距離短，種子雨覆蓋在母樹周圍，限制了群體的擴張。此外，熱帶雨林潮濕的環(huán)境容易致使種子腐爛，加上種子富含豐富的油脂容易引起蟲蟻對種子的啃食等原因限制了它的萌發(fā)，導致在天然居群內其林下幼苗數量較少[12]。這些在很大程度上決定了海南風吹楠長期以來可能都是以小種群的形式存在，種群更新困難甚至停滯，從而限制了居群的擴張，導致遺傳多樣性下降。

另外，環(huán)境因素(生物因素、非生物因素和微環(huán)境等)的變化也會影響物種的遺傳多樣性水平[43]。日本占領海南島期間，大肆掠奪木材，破壞原始森林；解放后，當地居民為了生活，砍伐木材，種植橡膠，全島的森林覆蓋率從解放初的35%，下降到20世紀80年代初的9.7%[44]。海南風吹楠可能本身就是個小種群植物，再加人為濫砍濫伐，導致海南風吹楠居群的規(guī)模變得更小，大多數地區(qū)只包含幾棵植株, 促使居群內近交現象越發(fā)明顯，可能因此導致物種的遺傳多樣性處于較低水平。綜上，在本研究中, 海南風吹楠的遺傳多樣性低可能與其自身更新能力低以及人類對其生境的嚴重破壞以及濫砍濫伐有關，最終可能導致物種的局部消失與滅絕。

3.2 海南風吹楠的遺傳分化與居群遺傳結構

海南風吹楠居群間的平均遺傳分化系數為0.120, 說明居群間存在中等程度的遺傳分化[45]。AMOVA分析揭示了遺傳變異主要存在于居群間, 遺傳分化通常是長期遺傳隔離的結果，受交配系統、生活史特征、傳粉生物學、種子傳播、生活型、氣候的反應和基因流等生物學特性的影響[46]。在熱帶，對于混交的、蟲媒傳粉的非木本物種，F通常較高。海南風吹楠分布于熱帶地區(qū)，其雄花呈亮黃色，這是植物在吸引蜂類傳粉者功能中呈現的主要色彩[47]，所以我們推測海南風吹楠是靠蜂類傳粉的。而蜂類傳粉可能會導致海南風吹楠花粉流傳播距離不長，居群間基因流交流困難，這可能導致居群間容易形成長期的隔離和分化[46]。

在野外科考時發(fā)現多數海南風吹楠居群間有山體隔離，未發(fā)現傳播種子的鳥類，種子主要靠重力傳播，傳播距離有限，幼苗大部分聚集在母株下方區(qū)域。此外，人類頻繁的活動使物種的生境遭到嚴重破壞(如霸王嶺和吊羅山國家級自然保護區(qū)內海南風吹楠的一些分布點位于公路和棧道的兩邊)，居群數量迅速減少，從而加劇了物種居群間的遺傳分化[15,46,48]。

居群遺傳結構分析結果表明，海南風吹楠居群的最佳聚類值是K=2 (圖3)，個別居群的遺傳結構混雜，地理區(qū)域性特征不明顯，Mantel檢驗結果表明遺傳距離和地理距離雖呈正相關但不顯著，兩者的結果是一致的。Wang等[49]對分布在中國海南島的瀕危植物坡壘()的研究有相同的結果，坡壘居群的遺傳結構混雜，地理距離和遺傳距離間沒有相關性，推斷花粉的長距離基因流動、種子遷移以及地理距離等可能是導致該物種遺傳結構不清晰的原因。此外，評價居群的遺傳結構需要結合物種的繁育系統和傳粉方式等因素進行綜合分析[41]，目前還沒有針對海南風吹楠相關的報道，后續(xù)應加強對這方面的研究來進一步闡明其遺傳結構的形成原因。

3.3 海南風吹楠的瀕危機制及保護措施

居群結實率低、土壤種子庫中種子儲量小、幼苗死亡率高和過度的人為活動干擾等原因可能是海南風吹楠瀕危的主要原因[12,50]。因此，我們提出對國家級極小種群野生植物海南風吹楠的科學保護措施，第一，掌握海南風吹楠的生存現狀，針對性地開展繁育系統、傳粉方式等研究，這些基礎信息能為采取有效保護措施提供重要的科學依據；第二，加強對海南風吹楠天然居群的就地與遷地保護相結合的保護措施。散生于保護區(qū)外的海南風吹楠(如昌江王下鄉(xiāng)農田邊有1棵)，其生境破壞嚴重, 急需進行遷地保護；位于保護區(qū)內的居群，對生境破壞的居群(如BWL和DLS居群)加強就地或近地保護，使其在原生或相似的生境區(qū)域逐漸擴大個體數量和居群規(guī)模；第三，加強對海南風吹楠的人工繁殖和回歸引種措施。從遺傳多樣性水平高的居群(如BWL和YGL居群)中采集種子或幼苗，進行人工育苗后，選擇適宜其生長的環(huán)境，以此擴大和更新現有居群的數量及規(guī)模，保護物種的基因庫，防止物種的遺傳資源發(fā)生丟失。此外，應該在當地加強宣傳教育，最大限度的避免人為破壞導致野外居群數量的減少和生存環(huán)境的破壞。

[1] ISBEL F, GONZALEZ A, LOREAU M, et al. Linking the influence and dependence of people on biodiversity across scales [J]. Nature, 2017, 546(7656): 65–72. doi: 10.1038/nature22899.

[2] JOHNSON C N, BALMFORD A, BROOK B W, et al. Biodiversity losses and conservation responses in the Anthropocene [J]. Science, 2017, 356(6335): 270–275. doi: 10.1126/science.aam9317.

[3] LAWTON J H, MAY R M. Extinction Rates [M]. Oxford: Oxford University Press, 1995.

[4] REN H, ZHANG Q M, LU H F, et al. Wild plant species with extremely small populations require conservation and reintroduction in China [J]. AMBIO, 2012, 41(8): 913–917. doi: 10.1007/s13280-012-0284-3.

[5] MA Y P, CHEN G, GRUMBINE R E, et al. Conserving plant species with extremely small populations (PSESP) in China [J]. Biodiv Conserv, 2013, 22(3): 803–809. doi: 10.1007/s10531-013-0434-3.

[6] MERRILL E D. A fourth supplementary list of Hainan plants [J]. Lingnan Sci J, 1932, 111: 37–61.

[7] Institute of Medicinal Plant Development Hainan Branch. Species List of South China Medicinal Plant Garden [M]. Beijing: China Agriculture Press, 2007: 26.

中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所. 南藥園植物名錄[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社, 2007: 26.

[8] LIU S B, MEI W L, ZENG Y B, et al. Study on liposoluble extract of[J]. Chin J Ethnomed Ethnopharm, 2010, 19 (20): 147,149. doi: 10.3969/j.issn.1007-8517.2010.20.145.

劉壽柏, 梅文莉, 曾艷波, 等. 黎藥海南風吹楠脂溶性成分研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥, 2010, 19(20): 147,149. doi: 10.3969/j.issn.1007- 8517.2010.20.145.

[9] State Forestry Administration of China. The Implementation Plan of Rescuing and Conserving China’s PSESP (2011–2015) [M]. Beijing: State Forestry Administration of China, 2012.

國家林業(yè)局. 全國極小種群野生植物拯救保護工程規(guī)劃(2011種群野生植物) [M]. 北京: 國家林業(yè)局, 2012.

[10] GE S, HONG D Y. Genetic diversity and its detection method [M]// QIAN Y Q, MA K P. Principles and Methods of Biodiversity Research. Beijing: China Science and Technology Press, 1994: 122–140.

葛頌, 洪德元. 遺傳多樣性及其檢測方法[M]// 錢迎倩, 馬克平. 生物多樣性研究的原理與方法. 北京: 中國科學技術出版社, 1994: 122–140.

[11] AVISE J C, HAMRICK J L. Conservation Genetics: Case Histories from Nature [M]. New York: Chapman & Hall, 1996.

[12] JIANG Y H. Ecological characteristics and endangered reason analysis ofMerr. as an extremely small population [D]. Changsha: Central South University of Forestry and Technology, 2018.

蔣迎紅. 極小種群海南風吹楠生態(tài)學特性及瀕危成因分析[D]. 長沙: 中南林業(yè)科技大學, 2018.

[13] YANG Y, LIU Q, CHEN Y K, et al. The complete chloroplast genome of, an endangered species with extremely small populations [J]. Mitochondrial DNA B, 2019, 4(2): 2654–2655. doi: 10.1080/23802359.2019.1644556.

[14] HUANG J, WANG H Y, ZHONG Y D, et al. Growth and physiological response of an endangered tree,Merr., to simulated sulfuric and nitric acid rain in southern China [J]. Plant Physiol Biochem, 2019, 144: 118–126. doi: 10.1016/j.plaphy.2019.09.029.

[15] JIANG Y H, LIU X S, XIANG W H, et al. Genetic diversity and structure analysis of the endangered plant speciesMerr. in China [J]. Biotechnol Biotechnol Equip, 2018, 32(1): 95–101. doi: 10.1080/13102818.2017.1391122

[16] DESALLE R, AMATO G. The expansion of conservation genetics [J]. Nat Rev Genet, 2004, 5(9): 702–712. doi: 10.1038/nrg1425.

[17] HONG D Y. Biodiversity pursuits need a scientific and operative species concept [J]. Biodiv Sci, 2016, 24(9): 979–999. doi: 10.17520/ biods.2016203.

洪德元. 生物多樣性事業(yè)需要科學、可操作的物種概念 [J]. 生物多樣性, 2016, 24(9): 979–999. doi: 10.17520/biods.2016203.

[18] CAI C N, MA H, CI X Q, et al. Comparative phylogenetic analyses of Chinese(Myristicaceae) using complete chloroplast genome sequences [J/OL]. J Syst Evol, (2019-12-12) doi: 10.1111/jse. 12556.

[19] KADU C A C, MUCHUGI A, KINDT R, et al. Molecular markers for tropical trees: A practical guide to principles and procedures [M]// DAWSON I, JAMNADAS R. ICRAF Technical Manual Vol. 9. Nai- robi: World Agroforestry Centre, 2008.

[20] ANGELONI F, WAGEMAKER N, VERGEER P, et al. Genomic toolboxes for conservation biologists [J]. Evol Appl, 2012, 5(2): 130– 143. doi: 10.1111/j.1752-4571.2011.00217.x.

[21] SEMAGN K, BJ?RNSTAD ?, NDJIONDJOP M N. An overview of molecular marker methods for plants [J]. Afr J Biotechnol, 2006, 525 (25): 2540–2568. doi: 10.5897/AJB2006.000-5110

[22] BRUMFIELD R T, BEERLI P, NICKERSON D A, et al. The utility of single nucleotide polymorphisms in inferences of population history [J]. Trends Ecol Evol, 2003, 18(5): 249–256. doi: 10.1016/S0169-5347 (03)00018-1.

[23] MILLER M R, DUNHAM J P, AMORES A, et al. Rapid and cost- effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA (RAD) markers [J]. Genome Res, 2007, 17(2): 240–248. doi: 10.1101/gr.5681207.

[24] PEGADARAJU V, NIPPER R, HULKE B, et al.sequencing of sunflower genome for SNP discovery using RAD (restriction site associated DNA) approach [J]. BMC Genom, 2013, 14(1): 556. doi: 10. 1186/1471-2164-14-556.

[25] MAO C L, ZHANG F L, LI X Q, et al. Genetic diversity ofbased on AFLP markers [J]. J Trop Subtrop Bot, 2020, 28(3): 271–276. doi: 10.11926/jtsb.4162.

毛常麗, 張鳳良, 李小琴, 等. 琴葉風吹楠資源遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學報, 2020, 28(3): 271–276. doi: 10. 11926/jtsb.4162.

[26] DOYLE J J T, DOYLE J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue [J]. Focus, 1990, 12(1): 13–15.

[27] DAVEY J W, BLAXTER M L. RADSeq: next-generation population genetics [J]. Brief Funct Genom, 2010, 9(5/6): 416–423. doi: 10.1093/ bfgp/elq031.

[28] ROCHETTE N C, RIVERA-COLóN A G, CATCHEN J M. Stacks 2: Analytical methods for paired-end sequencing improve RADseq-based population genomics [J]. Mol Ecol, 2019, 28(21): 4737–4754. doi: 10.1111/mec.15253.

[29] LISCHER H E L, EXCOFFIER L. PGDSpider: An automated data conversion tool for connecting population genetics and genomics programs [J]. Bioinformatics, 2012, 28(2): 298–299. doi: 10.1093/bio informatics/btr642.

[30] EXCOFFIER L, LISCHER H E L. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows [J]. Mol Ecol Resour, 2010, 10(3): 564–567.

[31] NEI M. Analysis of gene diversity in subdivided populations [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1973, 70(12): 3321–3323.

[32] OKSANEN J, BLANCHET F G, KINDT R, et al. Vegan: Community ecology package [CP/OL]. 2019. https://github.com/vegandevs/.

[33] PRITCHARD J K, STEPHENS M, DONNELLY P. Inference of population structure using multilocus genotype data [J]. Genetics, 2000, 155(2): 945–959.

[34] EARL D A, VONHOLDT B M. STRUCTURE HARVESTER: A website and program for visualizing STRUCTURE output and imple- menting the Evanno method [J]. Conserv Genet Resour, 2012, 4(2): 359–361. doi: 10.1007/s12686-011-9548-7.

[35] JAKOBSSON M, ROSENBERG N A. CLUMPP: A cluster matching and permutation program for dealing with label switching and multi- modality in analysis of population structure [J]. Bioinformatics, 2007, 23(14): 1801–1806. doi: 10.1093/bioinformatics/btm233.

[36] ROSENBERG N A. Distruct: A program for the graphical display of population structure [J]. Mol Ecol Notes, 2004, 4(1): 137–138. doi: 10. 1046/j.1471-8286.2003.00566.x.

[37] EVANNO G S, REGNAUT S J, GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: A simulation study [J]. Mol Ecol, 2005, 14(8): 2611–2620. doi: 10.1111/j.1365-294X. 2005.02553.x.

[38] ZHANG S S, KANG H M, YANG W Z. Population genetic analysis ofby reduced-representation sequencing technique [J]. Bull Bot Res, 2019, 39(6): 899–907. doi: 10.7525/j.issn.1673-5102. 2019.06.013.

張珊珊, 康洪梅, 楊文忠. 基于簡化基因組技術的云南藍果樹群體遺傳分析[J]. 植物研究, 2019, 39(6): 899–907. doi: 10.7525/j.issn. 1673-5102.2019.06.013.

[39] LI Q M, XU Z F, HE T H. A preliminary study on conservation genetics of endangered(Dipterocarpaceae) [J]. Acta Bot Sin, 2002, 44(2): 246–249. doi: 10.3321/j.issn:1672-9072. 2002.02.022.

李巧明, 許再富, 何田華. 瀕危植物版納青梅保護遺傳學研究初報[J]. 植物學報, 2002, 44(2): 246–249. doi: 10.3321/j.issn:1672-9072. 2002.02.022.

[40] XU G B, LIANG Y, JIANG Y, et al. Genetic diversity and population structure of, an endangered species [J]. Biodiv Sci, 2013, 21(6): 723–731. doi: 10.3724/SP.J.1003.2013.09117.

徐剛標, 梁艷, 蔣燚, 等. 伯樂樹種群遺傳多樣性及遺傳結構[J]. 生物多樣性, 2013, 21(6): 723–731. doi: 10.3724/SP.J.1003.2013. 09117.

[41] YAN S Y, ZHU P, GONG W, et al. Studies on genetic diversity ofcultivar germplasms in Sichuan based on RAD-SNPs analysis [J]. J Trop Subtrop Bot, 2019, 27(1): 19–28. doi: 10.11926/jtsb.3906.

閆思宇, 朱鵬, 龔偉, 等. 基于RAD-SNPs分析的四川核桃良種資源的遺傳多樣性研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學報, 2019, 27(1): 19–28. doi: 10.11926/jtsb.3906.

[42] HAMRICK J L, GODT M J W, SHERMAN-BROYLES S L. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species [J]. New For, 1992, 6(1): 95–124. doi: 10.1007/BF00120641.

[43] GE S. Review and prospect of genetic structure of plant population [M]// LI C S. Advances in Plant Science, Vol. 1. Beijing: Higher Education Press, 1977: 1–15.

葛頌. 植物群體遺傳結構研究的回顧和展望[M]// 李承森. 植物科學進展, 第1卷. 北京: 高等教育出版社, 1977: 1–15.

[44] CHENG S L. Historical lessons from development of Hainan Island [J]. Mar Dev, 1987(1): 62–65.

成松林. 開發(fā)海南島的歷史教訓[J]. 海洋開發(fā)與管理, 1987(1): 62–65.

[45] WRIGHT S. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating [J]. Evolution, 1965, 19(3): 395–420. doi: 10.1111/j.1558-5646.1965.tb01731.x.

[46] GAMBA D, MUCHHALA N. Global patterns of population genetic differentiation in seed plants [J]. Mol Ecol, 2020, 29(18): 3413–3428. doi: 10.1111/mec.15575.

[47] FAEGRI K, VAN DER PIJL L. The Principles of Pollination Ecology [M]. 3rd ed. Oxford: Pergamon Press, 1979.

[48] NYBOM H. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants [J]. Mol Ecol, 2004, 13(5): 1143–1155. doi: 10.1111/j.1365-294X.2004.02141.x.

[49] WANG C, MA X, REN M X, et al. Genetic diversity and population structure in the endangered tree(Dipterocarpaceae) on Hainan Island, China [J]. PLoS One, 2020, 15(11): e0241452. doi: 10.1371/journal.pone.0241452.

[50] YANG J, CAI L, LIU D T, et al. China’s conservation program on plant species with extremely small populations (PSESP): Progress and perspectives [J]. Biol Conserv, 2020, 244: 108535. doi: 10.1016/j.biocon. 2020.108535.

Genetic Diversity of: An Endangered Species with Extremely Small Populations

Cai Chaonan1,2, Hou Qinxi3, CI Xiuqin1,4, Xiao Jianhua1,5, Zhang Canyu1,5, LI Jie1,4*

(1.Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Kunming 650223, China; 2. School of Advanced Study, Taizhou University, Taizhou 318000, Zhejiang, China; 3. Sichuan Academy of Giant Panda, Chengdu 610081, China; 4. Core Botanical Gardens, Chinese Academy of Sciences,Mengla 666303, Yunnan, China; 5. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049, China)

In order to explore the causes of the endangered species, the genetic diversity and population structure were analyzed by using restriction-site associated DNA sequencing (RAD-seq) for developing single nucleotide polymorphisms (SNPs). The results showed that the genetic diversity ofwas low (=0.167) and the genetic differentiation between populations was significant (F=0.120). Structure analysis showed that the optimal clustering value of the population was 2, but the genetic structure of some populations was mixed, which was consistent with the results of Mantel correlation test showing no correlation between genetic distance and geographic distance (=0.733,<0.075). Therefore, low regeneration ability and excessive disturbance of human activities might be the main reason for endangered status of. It was recommended to strengthenconservation of populations with high genetic diversity, such as BWL and YGL, and strengthenorconservation of populations with severe habitat damage, such as EXL and DLS, to increase gene exchange among populations. At the same time construct the core germplasm of this species to prevent the aggravation of genetic resource loss.

; RAD-seq; Genetic diversity; Extremely small population; Genetic structure

10.11926/jtsb.4364

2020-12-21

2021-02-24

科技部科技基礎資源調查專項(2017FY100100)資助

This work was supported bythe Program for Science and Technology Basic Resources Investigation of Ministry of Science and Technology (Grant No. 2017FY100100).

蔡超男(1992～ )，女，博士，講師，研究方向為植物系統發(fā)育與瀕危物種的保護遺傳學。E-mail: caichaonan@xtbg.ac.cn

. E-mail: jieli@xtbg.ac.cn