廣東省猴耳環(huán)遺傳多樣性研究

閆晶晶, 王雪鑫, 范春節(jié), 陳祖旭, 李梅, 黃世能*

廣東省猴耳環(huán)遺傳多樣性研究

閆晶晶1,2, 王雪鑫1, 范春節(jié)1, 陳祖旭1, 李梅1, 黃世能1*

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所, 廣東 廣州 510520; 2. 南京林業(yè)大學(xué), 江蘇 南京 210037)

為了解猴耳環(huán)()種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以廣東省12個(gè)野生猴耳環(huán)群體的146份種質(zhì)資源為材料，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，21對(duì)SSR引物共檢測(cè)到249個(gè)等位基因，平均每對(duì)SSR引物檢測(cè)的等位基因數(shù)()為11.857，有效等位基因數(shù)()為3.500，期望雜合度()為0.718，多態(tài)信息含量()為0.676；12個(gè)群體中博羅群體的Shannon多樣性指數(shù)(=0.528)和有效等位基因數(shù)(=0.716)均最大，是遺傳多樣性最豐富的群體；群體間的遺傳分化系數(shù)為0.071，AMOVA分析表明，猴耳環(huán)的遺傳變異主要在群體內(nèi)(97%)，群體內(nèi)的遺傳分化大于群體間。聚類分析表明，遺傳系數(shù)在0.16時(shí)，可將12個(gè)群體分為6大類，與主坐標(biāo)分析的結(jié)果大致相同。這為發(fā)掘、利用與保護(hù)猴耳環(huán)群體種質(zhì)資源，開展猴耳環(huán)優(yōu)良品種的遺傳育種提供重要的理論依據(jù)。

猴耳環(huán)；SSR；遺傳多樣性；聚類分析

猴耳環(huán)(為含羞草科(Mimosaceae)猴耳環(huán)屬植物，常綠喬木，是我國(guó)南方重要的中藥材樹種[1–2]，其根、葉、果實(shí)、嫩枝均可入藥，功用相同。具有抗菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤等作用，被現(xiàn)代醫(yī)藥界稱為“綠色抗生素”[3–5]。近年來(lái)，人類活動(dòng)的干擾對(duì)猴耳環(huán)天然資源及其生境造成了嚴(yán)重破壞，大面積的砍伐和改造天然林使得猴耳環(huán)逐漸退化成劣勢(shì)樹種，原有的一些分布區(qū)內(nèi)已不見其蹤影，再加上氣候的改變和環(huán)境的惡化，野生種群資源不斷減少，嚴(yán)重威脅野生猴耳環(huán)的生存和生長(zhǎng)[6–7]。因此，開展野生猴耳環(huán)遺傳多樣性研究對(duì)該植物的保護(hù)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

SSR (simple sequence repeats)分子標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是育種研究中重要的遺傳標(biāo)記方法之一[8],已廣泛應(yīng)用于藥用植物品種圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與鑒定、種群遺傳多樣性分析、分子輔助育種等研究。胡文舜等[9]對(duì)新育成的19個(gè)枇杷()雜交品種(系)進(jìn)行了SSR標(biāo)記鑒定分析,建立了24份枇杷品種的分子指紋圖譜; 李洪果等[10]對(duì)868份杜仲()種質(zhì)資源進(jìn)行了SSR遺傳多樣性分析，表明其群體具有較高的遺傳多樣性水平；朱巧等[11]對(duì)黃精屬()的6種植物進(jìn)行了SSR遺傳差異分析, 推測(cè)西部地區(qū)可能是我國(guó)黃精屬植物的起源中心。SSR分子標(biāo)記技術(shù)為中藥資源的種質(zhì)鑒定提供了新思路，是快速有效的藥用植物鑒定方法[12]。目前，采用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)猴耳環(huán)屬植物進(jìn)行研究較少，趙經(jīng)華[13]利用DNA條形碼技術(shù)，對(duì)不同產(chǎn)地的猴耳環(huán)、亮葉猴耳環(huán)()和薄葉猴耳環(huán)()進(jìn)行了分類。

本研究首次利用開發(fā)的SSR引物對(duì)野生猴耳環(huán)遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期全面揭示廣東省天然猴耳環(huán)群體的遺傳多樣性及其群體間的遺傳分化,了解各群體之間的親緣關(guān)系，為猴耳環(huán)種質(zhì)資源的保護(hù)及合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2019年10月開始對(duì)廣東省野生猴耳環(huán)進(jìn)行資源調(diào)查和樣品采集，共收集到12個(gè)野生猴耳環(huán)群體(表1)。每個(gè)群體采集嫩葉，采用變色硅膠迅速脫水干燥，裝入自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，–20℃低溫冰箱保存，用于DNA提取。群體內(nèi)個(gè)體間隔不少于50 m，對(duì)于數(shù)量較少的群體，采集全部個(gè)體。

表1 野生猴耳環(huán)群體信息

1.2 DNA提取和PCR的擴(kuò)增

采用改良的CTAB法[14]提取猴耳環(huán)葉片的DNA,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè), 選取條帶清晰明亮的DNA樣品置于–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用課題組前期開發(fā)的21個(gè)標(biāo)記(待發(fā)表，引物信息見表2)對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。SSR引物由北京擎科生物科技有限公司廣州分公司合成。

PCR反應(yīng)體系為10.0L，包含模板DNA 0.5L,正反向引物各0.5L，2×PCR Mix聚合酶5L，ddH2O 3.5L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司通過(guò)3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(ABI Co., Foster, CA, USA)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用GeneMarker V.2.2.0軟件[15]判讀電泳結(jié)果并統(tǒng)計(jì)，用CERVUS 3.0.7軟件[16]計(jì)算各SSR位點(diǎn)的觀測(cè)等位變異數(shù)()、觀測(cè)雜合度()、期望雜合度()、多態(tài)信息含量()，用GenALEx 6.5.1[17]計(jì)算位點(diǎn)有效等位變異數(shù)()、Shannon多樣性指數(shù)()和群體的、、、、、固定指數(shù)()等，同時(shí)進(jìn)行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)、計(jì)算各群體遺傳距離與地理距離，并進(jìn)行mantel相關(guān)性檢驗(yàn)。采用NTSYS-PC 2.0軟件[18]基于Nei氏遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建樹狀聚類，基于遺傳距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)，構(gòu)建二維平面、三維空間分布圖。

表2 21對(duì)SSR引物信息和遺傳多樣性參數(shù)

: 等位基因數(shù)目;: 有效等位基因數(shù)目;: 觀測(cè)雜合度;: 期望雜合度;: Shannon多樣性指數(shù);: 多態(tài)信息含量。下表同。

: Number of alleles;: Effective number of alleles;: Observed heterozygosity;: Expected heterozygosity;: Shannon information index;: Polymorphic information content. The same is following Tables.

2 結(jié)果和分析

2.1 SSR引物的多態(tài)性和群體遺傳多樣性分析

采用SSR標(biāo)記對(duì)146份猴耳環(huán)種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，21對(duì)SSR引物共檢測(cè)到249個(gè)等位基因(表2)，引物的等位基因數(shù)()為5～23個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出11.86個(gè)等位基因，有效等位基因數(shù)()為1.857～5.147，Shannon多樣性指數(shù)()為0.714～2.106，觀測(cè)雜合度()為0.287～0.857, 期望雜合度()為0.478～0.920，多態(tài)信息含量()為0.401～0.911。

從表3可見，猴耳環(huán)群體的、、、、、分別為3.762～7.571、3.047～4.167、1.160～ 1.528、0.598～0.769、0.625～0.716和-0.210～0.110。

和能較好地度量群體的變異程度與遺傳多樣性。12個(gè)猴耳環(huán)群體的為BL>DH>LM>QX> ZC>LH>XF>TS>DYS≥HD>FK>CA；值為BL> DH>ZC>LM>QX>LH>HD>XF>FK>DYS>CA>TS?？傮w來(lái)看，博羅群體的遺傳多樣性最高，潮安群體相對(duì)較低。不同猴耳環(huán)群體間的遺傳多樣性存在較大差異，鼎湖群體的猴耳環(huán)資源份數(shù)最多，但遺傳多樣性水平并不是最高，遺傳多樣性水平與樣本數(shù)量無(wú)關(guān)[19]。有效等位基因數(shù)()能夠反映群體的遺傳變異，當(dāng)值越接近等位基因數(shù)()值時(shí), 等位基因在群體中的分布就越均勻[20]。臺(tái)山群體的有效等位基因數(shù)與等位基因數(shù)接近，說(shuō)明等位基因在群體中分布較均勻，其余群體的差異較大，等位基因存在極端值。固定系數(shù)是隨機(jī)交配下群體內(nèi)觀測(cè)雜合度和期望雜合度的偏離值，當(dāng)>0時(shí)，表示該群體在該位點(diǎn)雜合子不足；<0時(shí)，表示雜合子過(guò)剩[10]。潮安、清新、臺(tái)山、龍門、封開5個(gè)群體的<0，表明雜合子過(guò)剩，大瑤山、新豐、博羅、惠東、鼎湖、增城群體的>0，表明雜合子不足。

表3 12個(gè)猴耳環(huán)群體的遺傳多樣性參數(shù)

2.2 猴耳環(huán)群體的遺傳分化

基于21對(duì)SSR引物對(duì)猴耳環(huán)群體的分化系數(shù)和基因流()進(jìn)行分析。結(jié)果表明，基因流在不同引物位點(diǎn)間差異較大，為1.654～8.019，平均為3.536，表明猴耳環(huán)群體間存在適度的基因交流，基因交流能夠促進(jìn)居群發(fā)生基因分化。猴耳環(huán)群體間的平均遺傳分化系數(shù)(F)為0.071，平均近交系數(shù)(F)為0.069，表明群體間既存在一定程度的變異, 群體內(nèi)還存在一定程度的近交。AMOVA分析表明(表4),猴耳環(huán)群體內(nèi)的遺傳變異達(dá)97%，群體間的遺傳變異僅3%，說(shuō)明猴耳環(huán)群體內(nèi)遺傳分化大于群體間的分化。

表4 基于SSR的猴耳環(huán)群體分子變異分析(AMOVA)

2.3 聚類分析和主坐標(biāo)分析

群體間的遺傳一致度和遺傳距離可以判斷群體間的親緣關(guān)系，遺傳一致度數(shù)值越大，表明親緣關(guān)系越近，而遺傳距離越小，其親緣關(guān)系越近。從表5可知，遺傳一致度最大是TS群體和CA群體，為0.380，其遺傳距離也最小，為0.684，表明TS群體與CA群體的親緣關(guān)系較近。遺傳一致度最小的是DH群體與BL群體，僅0.065，其遺傳距離也最大，為0.937，表明DH群體與BL群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

對(duì)12個(gè)猴耳環(huán)群體間的遺傳距離與地理距離矩陣進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)，結(jié)果表明遺傳距離與地理距離的相關(guān)關(guān)系不顯著(=0.013,=0.330)。

表5 猴耳環(huán)群體間的遺傳一致度和遺傳距離

左上角為遺傳一致度，右下角為遺傳距離；HD、DYS、CA、QX、TS、LM、XF、FK、BL、LH、DH和ZC見表1。以下圖表同。

Above diagonal is genetic identity, below diagonal is genetic distance; HD, DYS, CA, QX, TS, LM, XF, FK, BL, LH, DH和ZC see Table 1. The same is followed Figures and Tables.

使用NTSYS-PC 2.1基于Nei氏遺傳距離對(duì)猴耳環(huán)12個(gè)群體進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖1)，結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.16時(shí)，可將猴耳環(huán)12個(gè)群體分為6個(gè)類群。第1類群包括花都、博羅、鼎湖、增城、惠東、清新、龍門7個(gè)群體，在遺傳系數(shù)為0.13時(shí)可將第1類群分為2個(gè)亞類，花都、博羅、鼎湖、增城、惠東聚為第1亞類，且博羅與鼎湖群體的遺傳關(guān)系較近，在系數(shù)為0.07時(shí)聚在一起，清新、龍門聚為第2亞類。新豐、大瑤山、封開、潮安、臺(tái)山分別聚為第2、3、4、5、6類群。臺(tái)山群體在遺傳系數(shù)為0.25時(shí)就最先與其他群體區(qū)分，單獨(dú)聚為一類，說(shuō)明臺(tái)山群體與其他群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

使用NTSYS-PC 2.1對(duì)猴耳環(huán)群體遺傳距離矩陣進(jìn)行了中心化處理，形成群體分布的三維、二維圖(圖2)。主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，12個(gè)群體被明顯的分為4個(gè)類群，臺(tái)山群體為第1類，潮安群體為第2類，惠東、花都、增城、鼎湖、博羅聚為第3類，龍門、大瑤山、封開、清新、新豐聚為第4類。主坐標(biāo)分析的分組趨勢(shì)與UPGMA聚類大致相同,鼎湖、博羅群體位于圖形相對(duì)中心的區(qū)域，表明其與各群體之間的遺傳關(guān)系都不太遠(yuǎn)。

3 結(jié)論和討論

本研究對(duì)廣東省12個(gè)猴耳環(huán)群體146株個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明猴耳環(huán)群體的遺傳多樣性水平較高，12個(gè)群體的平均期望雜合度為0.662，與其他多年生植物的平均期望雜合度(0.68)相當(dāng)，且高于Nybom[21]基于微衛(wèi)星分析的期望雜合度平均值(0.61±0.22)，表明野生猴耳環(huán)群體有著豐富的遺傳多樣性，含有較高的遺傳多樣性水平。

圖1 猴耳環(huán)12個(gè)群體的UPGMA樹

圖2 猴耳環(huán)12個(gè)群體的主坐標(biāo)二維、三維分析

有研究表明，自交和混合育種的分類群多樣性顯著低于異交分類群，異交、廣布的植物通常具有較高的遺傳多樣性[22]。猴耳環(huán)作為喬木速生樹種, 雖可進(jìn)行實(shí)生苗繁殖且種子的萌發(fā)力強(qiáng)，但萌發(fā)的幼苗會(huì)在1～2 a內(nèi)相繼死亡，林內(nèi)極少發(fā)現(xiàn)幼樹[23], 使得其遺傳關(guān)系并未發(fā)生改變，仍然保存了其較高的遺傳多樣性。博羅群體與鼎湖群體的遺傳多樣性高,臺(tái)山群體與潮安群體的遺傳多樣性低，這可能與臺(tái)山群體與潮安群體林內(nèi)有采伐現(xiàn)象有關(guān)，而鼎湖群體與博羅群體因位于國(guó)家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，植被生境完好,無(wú)采伐現(xiàn)象，保存了較高的遺傳多樣性，可見人為干擾也可對(duì)種質(zhì)資源的遺傳多樣性產(chǎn)生影響[24]。

本研究中野生猴耳環(huán)群體的F為0.070，表明群體間的遺傳分化趨于穩(wěn)定，物種的群體間存在中等程度的遺傳分化[25]。這與AMOVA分析結(jié)果一致，猴耳環(huán)97%的遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)，群體間幾乎沒有遺傳分化。猴耳環(huán)主要依靠水媒、蟲媒傳播，流動(dòng)的水源可以將其種子帶到水源流經(jīng)的任何地方，猴耳環(huán)的種子是黑葉猴和白頭葉猴的主要覓食食物之一, 當(dāng)動(dòng)物覓食行為發(fā)生，就會(huì)產(chǎn)生傳播，促進(jìn)了群體之間的基因交流[26–28]，使群體間的遺傳分化水平不顯著。這種隨機(jī)因素可能也是野生猴耳環(huán)群體的遺傳距離和地理距離沒有顯著相關(guān)性的主要原因。

本研究基于SSR分子標(biāo)記分析表明，猴耳環(huán)群體的遺傳多樣性較高；群體間的基因流動(dòng)性較大, 遺傳交流水平高；群體間的遺傳分化程度低，遺傳變異小，短期內(nèi)不會(huì)發(fā)生新的遺傳分化；遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)，群體間僅占3%，在對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行保護(hù)時(shí)，可以保存其較大種群。但隨著生境破壞和人為大量的砍伐，保護(hù)野生猴耳環(huán)種質(zhì)資源刻不容緩，對(duì)猴耳環(huán)資源進(jìn)行人工栽植和擴(kuò)大繁殖，將有利于保持野生猴耳環(huán)的遺傳多樣性和防止種群衰退，為野生猴耳環(huán)種質(zhì)資源的保存與利用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Genetic Diversity ofin Guangdong Province

YAN Jingjing1,2, WANG Xuexin1, FAN Chunjie1, CHEN Zuxu1, LI Mei1, HUANG Shineng1*

(1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry,Guangzhou 510520, China; 2.Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

In order to understand the genetic diversity ofgermplasms resources, the genetic diversity and relatedness of 146 individuals from 12wild populations in Guangdong Province were studied by using SSR molecular marker technology. The results showed that a total of 249 alleles were detected by 21 pairs of SSR primers with an average alleles () of 11.857, the effective number of alleles () of 3.500, as well as expected heterozygosity () of 0.718, and polymorphism information content () of 0.676. The Shannon diversity index (=0.528) and effective number of alleles (=0.716) of Boluo population were the highest among 12 populations, which is the most genetically diverse population. The coefficient of genetic differentiation among populations was 0.071, and the genetic variation ofwas mainly within populations (97%), and the genetic differentiation within populations was greater than that among populations.Meanwhile, the cluster analysis showed that the 12 populations could be divided into 6 types according to genetic coefficient of 0.16, which was similar to that of principal coordinate analysis.So, these would provide an important theoretical basis for the exploitation, utilization, and protection ofgermplasm resources, and genetic breeding of fine variety.

; SSR; Genetic diversity; Cluster analysis

10.11926/jtsb.4337

2020-11-16

2021-01-08

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2017KJCX004); 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFYBB2018SY019)資助

This work was supported by the Project for Forestry Science and Technology Innovation in Guangdong (Grant No. 2017KJCX004); and the Special Project for Basic Scientific Research of Chinese Academy of Forestry (Grant No. CAFYBB2018SY019).

閆晶晶, 研究方向?yàn)榉悄举|(zhì)林產(chǎn)品。E-mail: 770149131@qq.com

. E-mail: snhuang@126.com