125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌的吡嗪酰胺耐藥及pncA基因突變分析

趙永 林淑芳 林建 戴志松 魏淑貞

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是重要的一線抗結(jié)核藥物，能夠殺滅在吞噬細(xì)胞內(nèi)處于半休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌。同時(shí)PZA能夠抑制核糖體蛋白S1的反式翻譯過(guò)程，從而阻止結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生賴以生存的其他蛋白質(zhì)?；谶@些作用，PZA與異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)聯(lián)合治療可以有效縮短數(shù)個(gè)月的療程[1]。雖然Zhang等[2]和Li等[3]的研究均顯示，PZA耐藥與rpsA和panD基因突變有一定關(guān)系,但Dillon等[4]的研究證明了這2個(gè)基因的突變與PZA耐藥無(wú)關(guān)。 結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥主要是由于吡嗪酰胺酶的編碼基因pncA發(fā)生突變，導(dǎo)致吡嗪酰胺酶的活性下降或失活，不能將PZA轉(zhuǎn)化成吡嗪酸。一些研究顯示，pncA基因突變具有多態(tài)性和地區(qū)差異性[5-9]。林淑芳等[10]和周銀發(fā)等[11]報(bào)道福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)PZA的耐藥問(wèn)題比較嚴(yán)重，特別是對(duì)鏈霉素(Sm)和乙胺丁醇(EMB)耐藥的耐多藥結(jié)核病患者對(duì)PZA耐藥率較高。為了解福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)PZA耐藥性及pncA基因的突變情況，為PZA耐藥的快速分子診斷提供依據(jù)，本研究通過(guò)隨機(jī)選取2010—2019年耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)的125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行PZA液體藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，并對(duì)PZA 耐藥相關(guān)基因pncA進(jìn)行測(cè)序。

材料和方法

一、研究對(duì)象

采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣的方法選取2010—2019年福建省9個(gè)耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)的125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌，標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比室提供。125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌分離自125例耐多藥患者，其中男性占76.0%(95例)，女性占24.0%(30例)；年齡15～80歲，平均年齡(45.66±13.30)歲；初治患者65例(52.0%)，復(fù)治患者60例(48.0%)。

二、研究方法

1.菌種初步鑒定：采用對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生長(zhǎng)試驗(yàn)法進(jìn)行菌種初步鑒定，鑒別培養(yǎng)基濃度分別為PNB 500 μg/ml，TCH 5 μg/ml。若PNB和TCH培養(yǎng)基上均有菌生長(zhǎng)，則判定為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，若PNB培養(yǎng)基上無(wú)菌生長(zhǎng)、TCH培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng)則判定為結(jié)核分枝桿菌。

2.藥敏試驗(yàn)：采用比例法固體藥敏試驗(yàn)，具體操作參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[12]。對(duì)照培養(yǎng)基為中性改良羅氏培養(yǎng)基，6種含藥培養(yǎng)基的濃度分別為：異煙肼(INH)0.2 μg/ml，利福平(RFP)40 μg/ml，鏈霉素(Sm)4 μg/ml，乙胺丁醇(EMB)2 μg/ml，卡那霉素(Km)30 μg/ml，氧氟沙星(Ofx)4 μg/ml。若耐藥百分比≥1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該藥耐藥。若耐藥百分比<1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該藥敏感。耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)×100%。鑒于PZA需要在酸性環(huán)境(pH≤5.6)中才能更好發(fā)揮抗菌活性而結(jié)核分枝桿菌在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)不良，常規(guī)的固體藥敏試驗(yàn)不適用于PZA耐藥性檢測(cè)。因此，本研究采用BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)對(duì)125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，報(bào)陽(yáng)后第1～5天內(nèi)用PZA試劑盒(美國(guó)BD公司)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，PZA的臨界濃度為100 μg/ml，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，4～21 d內(nèi)得出結(jié)果，超出此時(shí)間范圍需重做，同時(shí)每批次使用標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為質(zhì)控株。

3.DNA提?。何?00 μl菌液到1.5 ml的EP管當(dāng)中，蓋緊蓋子，85 ℃水浴1 h，12 000 r/min離心5 min，離心半徑4 cm，去掉上清，加入200 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液，95 ℃金屬浴15 min，吸取上清液到新的離心管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增： 從www.ncbi.nih.nlm.cn下載結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的pncA基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列為：正向：5′-GCGTCATGGACCCTATATC-3′；反向：5′-AACAGTTCATCCCGGTTC-3′。PCR反應(yīng)體積為50 μl，其中2×Mix液為25 μl，DNA模板5 μl，去離子水20 μl。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸8 min。

5.PCR-DNA測(cè)序及分析：取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增條帶為目的條帶后，PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化、測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比較。

6.質(zhì)量控制：福建省結(jié)核病參比室每年均參加并通過(guò)國(guó)家結(jié)核病參比室組織的藥敏熟練度測(cè)試和分子檢測(cè)能力驗(yàn)證。每批次藥敏試驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv作為對(duì)照。每次PCR擴(kuò)增以H37Rv作為陽(yáng)性對(duì)照，以去離子水作為陰性對(duì)照。對(duì)于PZA表型耐藥和pncA基因突變不一致的菌株，重復(fù)進(jìn)行PZA液體藥敏測(cè)定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò)Excel 2007軟件錄入研究數(shù)據(jù)，采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以“百分率(%)或構(gòu)成比(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PZA的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)PZA耐藥的有50株， PZA耐藥率為40.0%(50/125)。男性患者PZA耐藥率為39.0%(37/95)，女性患者PZA耐藥率為43.3%(13/30)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；15～25歲組患者PZA耐藥率為58.3%(7/12)，26～45歲組患者PZA耐藥率為32.7%(16/49)，46～60歲組患者PZA耐藥率為39.5%(17/43)，61～80歲組患者PZA耐藥率為47.6%(10/21)，年齡組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；初治患者PZA耐藥率為41.5%(21/65)，復(fù)治患者PZA耐藥率為38.3%(23/60)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 125例患者的基本特征與吡嗪酰胺耐藥性分析 [例(構(gòu)成比，%)]

二、PZA耐藥株的pncA基因突變情況

50株P(guān)ZA耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌中有30株檢出pncA基因突變，突變檢出率為60.0%(30/50)。PZA耐藥株的pncA基因突變檢出率高于PZA敏感株的pncA基因突變檢出率[5.3%(4/75)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.276，P=0.000)。30株P(guān)ZA耐藥菌株的pncA基因突變類型有22種，突變形式有點(diǎn)突變和移碼突變，其中以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎?1.8%(18/22),突變頻率相對(duì)高的位點(diǎn)是311(G→T)，其次是202(T→C)，PZA耐藥株的pncA基因突變位點(diǎn)分散，堿基突變相對(duì)集中的區(qū)域在132～152(5株)、202～246(6株)、311～331(5株)、403～490(8株)。見(jiàn)表2。

表2 吡嗪酰胺耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌pncA基因突變情況

三、pncA基因測(cè)序檢測(cè)菌株耐藥性的效能

若以PZA表型液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，pncA基因測(cè)序檢測(cè)PZA耐藥的敏感度為60.0%(30/50)，特異度為94.7%(71/75)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為85.7%(30/35)，陰性預(yù)測(cè)值為78.9%(71/90)。

討 論

PZA只在體外酸性環(huán)境或巨噬細(xì)胞里才能發(fā)揮其抗結(jié)核的作用，對(duì)體外培養(yǎng)基酸堿度的特殊要求限制了PZA藥敏試驗(yàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)開(kāi)展。應(yīng)用BACTEC MGIT 960 進(jìn)行PZA液體藥敏檢測(cè)是目前檢測(cè)PZA 耐藥性較為可靠的方法之一。 由于PZA藥敏試驗(yàn)的操作相對(duì)復(fù)雜、成本高，以及結(jié)果準(zhǔn)確性等問(wèn)題，WHO未將其納入常規(guī)藥敏檢測(cè)的要求當(dāng)中。因此，臨床上往往未行PZA耐藥性檢測(cè)就將PZA用于結(jié)核病治療。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用，簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確可靠的快速分子診斷技術(shù)成了研究的熱點(diǎn)。通過(guò)檢測(cè)PZA耐藥相關(guān)基因的突變進(jìn)行判斷PZA耐藥的分子藥敏也受到廣大學(xué)者的格外青睞。

本研究結(jié)果顯示，125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌的PZA耐藥率為40.0%(50/125)，這與之前福建省周銀發(fā)等[11]報(bào)道的研究結(jié)果相仿，低于廣東地區(qū)的結(jié)果(58.5%)[7]和重慶地區(qū)的結(jié)果(62.4%)[8]。可見(jiàn)，不同地區(qū)PZA耐藥率的差異可能與研究對(duì)象的來(lái)源有關(guān)。本研究的研究對(duì)象均來(lái)自耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)，廣東、重慶地區(qū)的研究對(duì)象來(lái)自?？漆t(yī)院，一般?？漆t(yī)院的結(jié)核病患者病情及用藥史會(huì)更復(fù)雜。另外，本研究結(jié)果顯示，PZA耐藥率在性別、年齡組的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明患者的性別、年齡可能與PZA耐藥性無(wú)關(guān)。

Ramirez-Busby和Valafar[13]及Miotto等[14]的研究表明，結(jié)核分枝桿菌pncA基因突變導(dǎo)致吡嗪酰胺酶活性喪失或降低，不能將PZA轉(zhuǎn)變成吡嗪酸進(jìn)而產(chǎn)生耐藥。結(jié)核分枝桿菌pncA基因突變大多數(shù)為點(diǎn)突變，少數(shù)為插入或缺失突變。本研究結(jié)果顯示，PZA耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌pncA基因突變率為60.0%，低于關(guān)平[7]報(bào)道的65.7%和羅振華等[5]報(bào)道的96%，進(jìn)一步反映了pncA基因突變率因地而異的特點(diǎn)。另外，本研究結(jié)果顯示，PZA耐藥的pncA基因突變檢出率明顯高于PZA敏感株的pncA基因突變檢出率，說(shuō)明pncA基因突變與PZA耐藥存在一定的關(guān)系。PZA耐藥的pncA基因突變類型有22種，突變形式主要以點(diǎn)突變?yōu)橹?占81.8%)，突變頻率比較高的位點(diǎn)是311G→T，其次是202T→C。Sheen等[6]研究報(bào)道，pncA基因突變分布于整個(gè)基因，且發(fā)生在相對(duì)集中的區(qū)域。經(jīng)比對(duì)分析，本研究PZA耐藥株的pncA基因突變位點(diǎn)分散，堿基突變相對(duì)集中的區(qū)域在132～152(5株)、202～246(6株)、311～331(5株)、403～490(8株)。pncA基因堿基突變位點(diǎn)區(qū)域202～246、311～331、403～490與Zhang等[2]及朱大冕等[8]報(bào)道的PZA耐藥株突變集中區(qū)域?yàn)?85～226、203～289、309～396、392～408和413～467的結(jié)果類似又有所不同，一方面體現(xiàn)了該基因突變因地區(qū)而異的多樣性，另一方面可能與各地區(qū)耐藥患者的用藥情況及依從性有關(guān)。本研究中pncA突變類型有29A→C、403A→C、490T→C，據(jù)Sheen 等[6]報(bào)道這三個(gè)突變與PZA耐藥高度相關(guān)。本研究pncA基因預(yù)測(cè)PZA耐藥性的效能特別是敏感度相對(duì)低一些，特異度較高，可能與PZA耐藥還存在其他耐藥機(jī)制有關(guān)。

總之，本研究中125株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)PZA的耐藥率為40.0%，pncA突變檢出率為60.0%，通過(guò)檢測(cè)pncA基因及其啟動(dòng)子區(qū)的序列突變來(lái)診斷結(jié)核分枝桿菌對(duì)PZA耐藥的真實(shí)價(jià)值有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及進(jìn)行多中心的驗(yàn)證評(píng)估。因此，有條件的地區(qū)應(yīng)進(jìn)行PZA藥敏試驗(yàn)。40%對(duì)PZA耐藥的耐多藥菌株未檢測(cè)出pncA基因突變，說(shuō)明PZA耐藥可能還存在其他耐藥機(jī)制，需要在今后的工作中進(jìn)一步探究。

本研究存在一定的不足，首先是對(duì)患者信息尤其是臨床特征方面的資料收集不夠全面，因此對(duì)PZA耐藥的分析不夠全面，今后需收集更加齊全的資料進(jìn)行詳述；其次是樣本量不夠大。另外，對(duì)PZA耐藥基因的選取存在一定的局限性，未對(duì)PZA其他耐藥相關(guān)基因如rpsA及panD基因的序列進(jìn)行比對(duì)分析，未來(lái)將進(jìn)一步采取基因組學(xué)方法等尋找更多的耐藥相關(guān)基因或位點(diǎn)。