GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合線性探針檢測技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

李靜 郁晨蕾 張陽奕 王莉莉 沈旭輝 陳煒 江淵

《中國結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020年版)》中對于肺結(jié)核患者耐藥篩查要求為，對具備分子生物學(xué)核酸耐藥檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室，優(yōu)先采用分子生物學(xué)耐藥檢測；對初治患者首次分子生物學(xué)檢測為利福平耐藥，需取另一份痰標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，若仍為利福平耐藥，則判定為利福平耐藥，否則按利福平敏感處理。對肺結(jié)核的治療方式要求根據(jù)肺結(jié)核病情及利福平耐藥與否制定不同的治療方案，由此可見，應(yīng)用分子生物學(xué)檢測利福平的耐藥性對于臨床診斷和后續(xù)化療方案的制定可以起到關(guān)鍵性的作用。

上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室在2016年根據(jù)國家結(jié)核病分級診療和綜合防治服務(wù)模式試點(diǎn)工作的要求逐步配備了GeneXpert MTB/RIF(簡稱GeneXpert)設(shè)備，并開展臨床檢測。本研究收集2017年12月至2018年12月上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床診斷為肺結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性菌株，在上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室采用線性探針檢測技術(shù)(LPA)進(jìn)行利福平耐藥性檢測，評估從患者痰樣本中采用GeneXpert檢測利福平耐藥性與從患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得的陽性菌株采用LPA檢測利福平耐藥結(jié)果的一致性，探討分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)在臨床工作中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、標(biāo)本來源和研究內(nèi)容

選擇上海市19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院作為研究現(xiàn)場，納入2017年12月至2018年12月初診的可疑肺結(jié)核患者。肺結(jié)核可疑癥狀者的標(biāo)準(zhǔn)為咳嗽、咯痰時(shí)間超過2周，因呼吸道癥狀接受檢查。19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室對初診肺結(jié)核可疑癥狀者的同一份合格痰樣本開展痰涂片、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“液體培養(yǎng)”)、GeneXpert共3種方法檢測，合格的痰樣本為黏液樣或干酪樣性狀的痰液，避免使用口水痰，痰量1～3 ml為宜。

上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對收集到的4827例患者的檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，去除858份重復(fù)樣本、26份培養(yǎng)污染樣本、40份GeneXpert檢測失敗樣本，最終對3903份有效樣本進(jìn)行GeneXpert檢測。

上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對2017年12月至2018年12月19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床診斷的772例(包含于在4827例患者中)肺結(jié)核患者的培養(yǎng)陽性菌株，采用16S rRNA測序方法進(jìn)行菌種鑒定，65例(8.42%)為非結(jié)核分枝桿菌，707例(91.58%)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，對707株結(jié)核分枝桿菌臨床菌株采用LPA進(jìn)行利福平耐藥性檢測，對于LPA法得到的利福平耐藥性檢測結(jié)果，與使用患者痰樣本進(jìn)行GeneXpert檢測結(jié)果不一致者，采用其培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行GeneXpert復(fù)測，并同時(shí)采用最低抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration，MIC)進(jìn)行復(fù)核，評估LPA和GeneXpert兩種分子生物學(xué)檢測技術(shù)檢測利福平耐藥性的情況。

二、檢測方法

1. 痰涂片檢查：按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[1]中的操作程序執(zhí)行。

2. 分離培養(yǎng)和鑒定：分離培養(yǎng)采用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法進(jìn)行標(biāo)本處理，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]進(jìn)行操作。 對于培養(yǎng)陽性菌株，19家結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室采用免疫色譜法(膠體金法)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌鑒定。上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室采用16S rRNA測序[T-100 PCR儀(Bio-Rad公司)、GelDocTMXR+紫外凝膠成像儀(Bio-Rad公司)]方法進(jìn)行菌種鑒定。

3. 藥物敏感性(簡稱“藥敏”)試驗(yàn)：采用結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度法，使用TREK Sensititre MYCOTBI藥敏板(美國賽默飛世爾科技公司)按照說明書進(jìn)行操作。參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI M24-A2標(biāo)準(zhǔn)，利福平臨界濃度為1.0 μg/ml，耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)：菌株的MIC值>臨界濃度值，則為耐藥；MIC值≤臨界濃度值，則為敏感。

4. GeneXpert檢測：按照GeneXpert MTB/RIF(美國Cepheid公司)操作說明書上的步驟進(jìn)行，結(jié)果通過專用軟件判讀。

5. LPA檢測：采用GenoType MTBDRplus耐藥檢測試劑盒(德國Hain MTBDRplus公司)，按操作說明書進(jìn)行操作。

三、質(zhì)量控制

室內(nèi)質(zhì)控：MIC法采用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)作為質(zhì)控菌株；LPA采用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和耐藥基因位點(diǎn)的質(zhì)控菌株，無菌蒸餾水為空白對照；室間質(zhì)控：上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室通過國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的藥敏熟練度測試；上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室及各結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院均通過國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的分子生物學(xué)質(zhì)控，結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)污染率均小于8%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。三種不同檢測方法陽性檢出率的比較采用配對χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)顯著性水平定為0.05；以液體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算痰涂片和GeneXpert檢測結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率和一致性(Kappa檢驗(yàn))，符合率95%CI值的計(jì)算采用Wilson估計(jì)法；LPA和GeneXpert兩種分子檢測技術(shù)檢測利福平耐藥性的一致性采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa≥0.75說明一致性較好，Kappa<0.4說明一致性較差，0.75>Kappa≥0.4說明一致性一般。

結(jié) 果

一、GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌的效能

3903例痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行痰涂片、液體培養(yǎng)(培養(yǎng)陽性菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌)和GeneXpert檢測，陽性檢出率分別為19.63%(766/3903)、25.93%(1012/3903)、25.16%(982/3903)。GeneXpert陽性檢出率高于痰涂片，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.390，P<0.001)；略低于液體培養(yǎng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.610，P=0.436)。以液體培養(yǎng)(培養(yǎng)陽性鑒定為結(jié)核分枝桿菌)為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為81.23%(822/1012)、94.47%(2731/2891)、83.71%(822/982)、93.50%(2731/2921)，兩種方法檢測結(jié)果符合率為91.03%，Kappa值為0.764，兩者一致性較好；痰涂片檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為64.92%、96.23%、85.77%、88.68%，兩種方法檢測結(jié)果符合率為88.11%，Kappa值為0.664，兩者一致性一般。見表1。

表1 以液體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)比較痰涂片和GeneXpert檢測痰樣本的效能(3903份)

二、LPA和GeneXpert檢測利福平耐藥性的效能分析

(一)兩種方法檢測利福平耐藥情況和一致性分析

707株結(jié)核分枝桿菌中，采用LPA檢測利福平耐藥有39例(5.52%)，采用GeneXpert檢測痰樣本的利福平耐藥有41例(5.80%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.050，P=0.818)。兩種方法從同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平結(jié)果符合率為98.30%(695/707)，95%CI值為97.06%～99.03%；Kappa(95%CI)值為0.841(0.753～0.929)，說明兩種方法檢測利福平耐藥性的一致性很好。

(二)檢測結(jié)果不一致復(fù)核情況

兩種方法檢測不一致共計(jì)12例。其中，5例LPA檢測為利福平耐藥但GeneXpert檢測為利福平敏感，7例LPA檢測為利福平敏感但GeneXpert檢測為利福平耐藥。見表2。

表2 12株LPA和GeneXpert檢測利福平耐藥性不一致結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果及復(fù)核結(jié)果

1. GeneXpert復(fù)測情況：12例采用菌株復(fù)測，5例利福平前后結(jié)果一致，均為耐藥(41.67%)；7例利福平耐藥性前后結(jié)果不一致。

2. 復(fù)核情況：1例患者的菌株為混合生長無法進(jìn)行藥敏檢測，11例患者的菌株采用MIC法進(jìn)行利福平耐藥性復(fù)核。LPA、MIC和GeneXpert 3種方法檢測利福平的耐藥性，7例結(jié)果均一致(63.64%)，4例結(jié)果不一致。不一致結(jié)果中，2例 LPA和MIC法檢測為利福平敏感而GeneXpert檢測為利福平耐藥，2例LPA檢測為利福平敏感而GeneXpert和MIC法檢測為利福平耐藥。

討 論

WHO于2010年推薦GeneXpert檢測技術(shù)用于肺結(jié)核的診斷[3]，該項(xiàng)技術(shù)已在多個國家和地區(qū)進(jìn)行了驗(yàn)證評估，顯示其高敏感度和高特異度[4-7]。本研究結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測的敏感度和一致性均高于痰涂片，特異度低于痰涂片，與國內(nèi)報(bào)道略有不同[7-8]。同時(shí)比較從患者痰樣本中采用GeneXpert與從患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)獲得的陽性菌株，采用LPA檢測利福平的耐藥性，結(jié)果顯示兩種檢測技術(shù)對同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平結(jié)果符合率達(dá)98.30%。對12例兩種方法檢測結(jié)果不一致者使用陽性菌株分別采用GeneXpert 和MIC法檢測，結(jié)果顯示3種方法檢測利福平耐藥性7例結(jié)果(63.64%)一致；GeneXpert復(fù)測5例(41.67%)前后結(jié)果一致。

本研究采用不同方法檢測結(jié)核分枝桿菌，GeneXpert陽性檢出率(25.16%)高于痰涂片法(19.63%)，略低于液體培養(yǎng)法(25.93%)。相比液體培養(yǎng)，GeneXpert除標(biāo)本前處理外檢測均在封閉的反應(yīng)盒內(nèi)自動完成，具有操作簡單、快速、交叉污染低、安全等特點(diǎn)。GeneXpert從檢測到報(bào)告僅需2.5 h，比液體培養(yǎng)(陽性時(shí)間11～22 d)[9]大大縮短了檢測時(shí)間。GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌的效能顯示其檢測敏感度、陰性預(yù)測值為81.23%和93.50%，高于痰涂片法(64.92%和88.68%)，其特異度和陽性預(yù)測值(94.47%和83.71%)略低于痰涂片法(96.23%和85.77%)。此結(jié)果與陳蕾和吳桂輝[8]研究得出的GeneXpert檢測特異度和敏感度結(jié)果略有不同，分析一種原因可能是由于不同的檢測方法使用前處理方法各不相同，因此雖然使用同一份痰樣本，但是由于痰樣本性狀黏稠，不能保證樣本能平均分配，特別是對于低陽性級別的痰樣本；還有一種原因可能是不同檢測方法檢出限的不同而影響其檢測效能。多項(xiàng)研究顯示，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌含量達(dá)到5×103～5×104CFU/ml時(shí)痰涂片法才能得到陽性結(jié)果，液體培養(yǎng)法檢測限為10～100 CFU/ml，而GeneXpert技術(shù)最低檢出限為131 CFU/ml[8, 10-12]。本研究也顯示，GeneXpert與液體培養(yǎng)法兩種方法檢測結(jié)果符合率高，一致性較好。

本研究采用LPA檢測707株結(jié)核分枝桿菌菌株，利福平耐藥有39株(5.52%)。采用GeneXpert檢測痰樣本結(jié)果顯示，利福平耐藥有41株(5.80%)。LPA和GeneXpert兩種方法從同一例患者初診痰樣本與初診痰培養(yǎng)陽性菌株中檢測利福平耐藥性結(jié)果符合率為98.30%，Kappa值為0.841，說明兩種方法檢測利福平耐藥一致性較好。對于12例 LPA檢測利福平與GeneXpert檢測痰樣本不一致的結(jié)果，本研究對其培養(yǎng)陽性菌株采用GeneXpert進(jìn)行復(fù)測，除1株為混合生長，其余11株進(jìn)行MIC法藥敏檢測。結(jié)果顯示，利福平檢測結(jié)果3種方法一致7株，4株不一致結(jié)果中，LPA檢測結(jié)果利福平均為敏感；GeneXpert檢測結(jié)果為利福平耐藥，均表現(xiàn)為probe E(529～533)探針突變；MIC法2例表現(xiàn)為利福平敏感，1例為低水平耐藥，1例為高水平耐藥。2例LPA和MIC檢測為利福平敏感而GeneXpert結(jié)果為耐藥，可能是在rpoB基因上發(fā)生了沉默突變而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。有研究報(bào)道，在rpoB基因上發(fā)生沉默基因突變，這類基因不表達(dá)或低表達(dá)[13]，與利福平耐藥無關(guān)。2例LPA檢測利福平敏感而GeneXpert和MIC結(jié)果為耐藥，是否為LPA檢測利福平耐藥性敏感度不高，將在今后的工作中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。對于復(fù)測的12例GeneXpert出現(xiàn)7例前后結(jié)果不一致的結(jié)果，筆者認(rèn)為有可能是由于兩類樣本的優(yōu)勢菌群不同而產(chǎn)生利福平耐藥性檢測結(jié)果的差異。趙冰等[14]研究表明，標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌含量會影響GeneXpert檢測利福平耐藥的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示，5例GeneXpert檢測痰標(biāo)本中利福平敏感者菌株復(fù)測5例均為耐藥，這5例患者中3例患者痰涂片結(jié)果僅為1～2條。本研究未對全部入選的患者菌株進(jìn)行復(fù)測，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)還不足以證明以上結(jié)論，我們將在今后的工作中進(jìn)行進(jìn)一步探討。

綜上所述，GeneXpert和LPA兩種分子檢測方法檢測利福平耐藥性總體符合率較高，但也可能存在漏檢或過診情況。因此，有條件的實(shí)驗(yàn)室可考慮引入其他分子檢測方法以彌補(bǔ)上述方法的不足，為臨床精準(zhǔn)診斷和治療提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

志謝感謝上海市疾病預(yù)防控制中心郭俊濤副主任醫(yī)師對本文統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和結(jié)果的指導(dǎo)和審核。