含分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)診斷流程在肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用情況

馬建軍 張鐵娟 侯偉 潘艷 劉昕

目前，分子生物學(xué)檢測(cè)是診斷結(jié)核病快速、有效的新診斷技術(shù)，具有特異度強(qiáng)、敏感度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)高效等諸多優(yōu)勢(shì)。但一直以來(lái)，吉林省患者發(fā)現(xiàn)主要依靠痰涂片、痰培養(yǎng)和傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)等傳統(tǒng)診斷技術(shù)。直至“中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)-比爾及梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)結(jié)核病防治合作項(xiàng)目”第三期(簡(jiǎn)稱(chēng)“中蓋項(xiàng)目三期”)在吉林省實(shí)施后，分子生物學(xué)檢測(cè)作為新診斷技術(shù)得以在全省范圍內(nèi)廣泛推廣，患者發(fā)現(xiàn)成效顯著。本研究通過(guò)分析吉林省全面應(yīng)用分子生物學(xué)診斷流程對(duì)患者發(fā)現(xiàn)的實(shí)施效果，為進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)核病防控措施提供參考依據(jù)。

資料和方法

一、 研究對(duì)象

由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的調(diào)查員收集吉林省所有結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)2019年登記的疑似和確診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，進(jìn)行回顧性調(diào)查。其中，疑似肺結(jié)核患者被納入分子生物學(xué)診斷流程，確診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者登記為當(dāng)年新發(fā)患者。

二、 研究方法

1.調(diào)查方法：在調(diào)查前由省級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)培訓(xùn)各地調(diào)查員，一家定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)至少2名調(diào)查員。調(diào)查資料來(lái)源于定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的門(mén)診日志、病案和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)等，并在完成調(diào)查后進(jìn)行二次復(fù)核，以確保資料數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，繼而由省級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)匯總并分析。

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[1]標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所有疑似肺結(jié)核患者的臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果等作出綜合判斷。

3.項(xiàng)目實(shí)施前后分子生物學(xué)檢測(cè)能力情況：2006年，借助中國(guó)全球基金結(jié)核病項(xiàng)目，吉林省僅4家地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室(共計(jì)9家)和29家(48.3%)縣(區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室(共計(jì)60家)具備開(kāi)展分子生物學(xué)檢測(cè)的能力，配備了GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱(chēng)“Xpert”)檢測(cè)設(shè)備。但由于Xpert檢測(cè)試劑價(jià)格較昂貴，各地區(qū)在中蓋項(xiàng)目三期實(shí)施前并沒(méi)有充足的經(jīng)費(fèi)來(lái)支持采購(gòu)試劑，不能惠及更多患者[2]。項(xiàng)目實(shí)施后，吉林省于2017年投入了810萬(wàn)元采購(gòu)分子生物學(xué)設(shè)備和試劑，截至當(dāng)年年底，全省所有地市及所轄縣(區(qū))實(shí)驗(yàn)室全部配備分子生物學(xué)診斷設(shè)備和試劑，包括交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(cross priming amplification，CPA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、Xpert、熒光PCR熔解曲線(xiàn)檢測(cè)技術(shù)(fluorescence PCR melting curve)、線(xiàn)性探針技術(shù)(Hain)等。

4.含分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的診斷流程：按照中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心制定的診斷流程方案，吉林省應(yīng)用兩套分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)及診斷流程。(1)CPA/LAMP診斷流程：縣(區(qū))級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)采用CPA或LAMP設(shè)備檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，地市級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)采用熒光PCR熔解曲線(xiàn)檢測(cè)技術(shù)或線(xiàn)性探針技術(shù)(Hain)檢測(cè)耐藥基因。(2)Xpert診斷流程：縣(區(qū))級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)采用Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和耐藥基因。兩套診斷技術(shù)的適用地區(qū)無(wú)重復(fù)。同時(shí)，按照診斷流程要求，初治患者行耐藥分子生物學(xué)檢測(cè)時(shí)，利福平耐藥者需全部進(jìn)行重復(fù)耐藥分子生物學(xué)檢測(cè)。隨著設(shè)備、試劑及人員、培訓(xùn)的陸續(xù)到位，各地按照診斷流程逐步落實(shí)檢測(cè)工作，全省實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力及水平逐漸提高，2019年病原學(xué)陽(yáng)性患者比例及耐藥患者發(fā)現(xiàn)達(dá)到最高水平[2]，故本研究以該年度數(shù)據(jù)為例進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2010軟件整理2019年吉林省分子生物學(xué)檢測(cè)設(shè)備配備及肺結(jié)核患者發(fā)現(xiàn)情況，并進(jìn)行描述性分析。其中，病原學(xué)陽(yáng)性包括涂陽(yáng)、僅分子生物學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性，以及僅培養(yǎng)陽(yáng)性。

結(jié) 果

一、 吉林省各縣(區(qū))分子生物學(xué)檢測(cè)設(shè)備配備情況

中蓋項(xiàng)目三期實(shí)施后，吉林省5個(gè)地市的26個(gè)縣(市、區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室分別配備24臺(tái)CPA檢測(cè)儀和2臺(tái)LAMP檢測(cè)儀，5個(gè)地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室配備了4臺(tái)熔解曲線(xiàn)檢測(cè)儀和1臺(tái)Hain檢測(cè)儀，4個(gè)地市的34個(gè)縣(市、區(qū))和4個(gè)地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室共計(jì)配備38臺(tái)Xpert檢測(cè)儀，見(jiàn)表1。

表1 吉林省不同地區(qū)結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)設(shè)備配備情況

二、 吉林省采用分子生物學(xué)診斷流程地區(qū)結(jié)核病病原學(xué)檢測(cè)情況

55 983例可疑肺結(jié)核癥狀者經(jīng)分子生物學(xué)檢測(cè)流程，共計(jì)檢出疑似活動(dòng)性肺結(jié)核患者10 278例(18.36%)，其中，涂陽(yáng)3895例、涂陰6383例；兩套流程地區(qū)接受分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)的比例為98.35%(8885/9034)，結(jié)核分枝桿菌檢出率為54.25%(4820/8885)；其中，涂陰患者檢測(cè)比例和結(jié)核分枝桿菌檢出率分別為97.67%(6234/6383)和35.15%(2191/6234)；培養(yǎng)陽(yáng)性13例。共計(jì)檢出病原學(xué)陽(yáng)性患者6099例，陽(yáng)性率為59.34%(6099/10 278)。

1.CPA/LAMP診斷流程地區(qū)：收集到18 044例縣級(jí)地區(qū)肺結(jié)核可疑癥狀者，其中，行抗酸桿菌痰涂片鏡檢和胸部X線(xiàn)攝片檢查者18 042例(99.99%，18 042/18 044)，檢出疑似活動(dòng)性肺結(jié)核患者4073例。將其中的1244例(6.90%，1244/18 042)涂陽(yáng)患者痰標(biāo)本送至地市級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)行分子生物學(xué)快速耐藥檢測(cè)；而2829例(15.68%，2829/18 042)涂陰患者中，有2680例(94.73%，2680/2829)行結(jié)核分枝桿菌CPA/LAMP檢測(cè)，陽(yáng)性率為36.42%(976/2680)。行痰培養(yǎng)的149例患者中，13例(8.72%，13/149)為陽(yáng)性。見(jiàn)圖1。

圖1 2019年吉林省行CPA/LAMP診斷流程地區(qū)肺結(jié)核檢測(cè)情況

2.Xpert診斷流程地區(qū)：收集到縣級(jí)地區(qū)肺結(jié)核可疑癥狀者37 939例，其中，行抗酸桿菌痰涂片鏡檢和胸部X線(xiàn)攝片檢查者37 919例(99.95%)，檢出疑似活動(dòng)性肺結(jié)核患者6205例。對(duì)其中的2651例(69.91%)涂陽(yáng)患者和3554例(9.37%)涂陰患者均開(kāi)展Xpert檢測(cè)，結(jié)核分枝桿菌檢出率分別為99.17%(2629/2651)和34.19%(1215/3554)。見(jiàn)圖2。

圖2 2019年吉林省Xpert診斷流程地區(qū)肺結(jié)核檢測(cè)情況

三、利福平耐藥及耐多藥結(jié)核病患者發(fā)現(xiàn)情況

2019年，吉林省6099例病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者全部接受分子生物學(xué)快速耐藥檢測(cè)，檢出利福平耐藥患者1038例，檢出率為17.02%；其中，初、復(fù)治利福平耐藥患者分別占57.23%(594/1038)和42.77%(444/1038)，檢出率分別為11.37%(594/5222)和50.63%(444/877)。初治利福平耐藥陽(yáng)性結(jié)果一致率為68.51%(594/867)，其中行CPA/LAMP診斷流程地區(qū)的初治患者中，利福平耐藥496例，經(jīng)重復(fù)耐藥分子生物學(xué)檢測(cè)，最后判定利福平耐藥311例，重復(fù)結(jié)果的一致率為62.70%(311/496)；行Xpert診斷流程地區(qū)的初治患者中，利福平耐藥371例，重復(fù)耐藥檢測(cè)后檢出利福平耐藥283例，重復(fù)結(jié)果的一致率為76.28%(283/371)。檢出耐多藥患者395例，檢出率為6.48%；其中，初、復(fù)治耐多藥患者分別占52.91%(209/395)和47.09%(186/395)，耐多藥檢出率分別為4.00%(209/5222)和21.21%(186/877)。具體見(jiàn)表2。

表2 2019年吉林省病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者利福平耐藥和耐多藥檢出情況

討 論

一、應(yīng)用分子生物學(xué)診斷技術(shù)的背景

我國(guó)2015—2017年肺結(jié)核患者病原學(xué)陽(yáng)性率約為30%[3-5]，明顯低于同期全球平均水平(分別為57%、57%和56%)[6]。影響肺結(jié)核病原學(xué)陽(yáng)性率的因素較多，包括分子生物學(xué)診斷技術(shù)的應(yīng)用、痰標(biāo)本的質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)室操作水平等[7]。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)日益成熟，世界衛(wèi)生組織和我國(guó)分別在2013年和2017年將分子生物學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性作為新的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[1，8]?；诖?，國(guó)家建議各地區(qū)因地制宜地推廣分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，推薦縣級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)選擇CPA、LAMP和Xpert等方法中的1種或多種，地市級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)至少應(yīng)用1種耐藥分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)[9]。

中蓋項(xiàng)目三期是中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)與比爾及梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)聯(lián)合開(kāi)展的結(jié)核病防治合作項(xiàng)目，推廣適宜的新診斷技術(shù)是其目標(biāo)之一。中蓋項(xiàng)目三期實(shí)施后，吉林省出臺(tái)了籌資與支付改革、分級(jí)診療等政策文件，各部門(mén)按照職責(zé)分工合作，統(tǒng)一招標(biāo)采購(gòu)，加強(qiáng)技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)，簡(jiǎn)化工作流程，全省所有地市及所轄縣(區(qū))全部配備了分子生物學(xué)檢測(cè)設(shè)備和試劑。

二、新診斷技術(shù)診斷流程及推廣應(yīng)用措施

近些年，全國(guó)各地結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室配備了多種耐藥檢測(cè)設(shè)備，考慮到同時(shí)使用會(huì)造成資源浪費(fèi)和檢測(cè)結(jié)果不一致，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心根據(jù)耐藥檢測(cè)技術(shù)制定了耐藥診斷流程[10]。按照國(guó)家方案的要求，吉林省選擇了CPA/LAMP和Xpert兩種新診斷技術(shù)流程。其中，5個(gè)地市26個(gè)縣(市、區(qū))采用CPA/LAMP診斷流程，4個(gè)地市34個(gè)縣(市、區(qū))采用Xpert診斷流程。

CPA診斷技術(shù)是實(shí)現(xiàn)恒溫下一次性完成結(jié)核分枝桿菌DNA的擴(kuò)增和雜交過(guò)程，并利用免疫層析乳膠標(biāo)記試紙條檢測(cè)技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測(cè)。LAMP診斷技術(shù)是針對(duì)靶序列的不同區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[11]。Xpert診斷技術(shù)是針對(duì)rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)是否發(fā)生突變[11]。中蓋項(xiàng)目三期實(shí)施后，吉林省采用CPA/LAMP診斷流程的縣(市、區(qū))結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室對(duì)所有涂陰患者的痰標(biāo)本行CPA或LAMP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，地市級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)，如PCR熔解曲線(xiàn)或Hain技術(shù)。而采用Xpert診斷流程的縣(市、區(qū))結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室則使用Xpert技術(shù)對(duì)疑似活動(dòng)性肺結(jié)核患者直接進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和耐藥檢測(cè)。兩種檢測(cè)流程均對(duì)第一次檢測(cè)為利福平耐藥的初治患者，再次進(jìn)行分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)，當(dāng)兩次檢測(cè)結(jié)果均為利福平耐藥時(shí)才進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)，而復(fù)治患者可直接進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)。

中蓋項(xiàng)目三期實(shí)施后，全省所有地區(qū)全面推廣分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。2019年，兩套診斷流程地區(qū)的涂陰患者結(jié)核分枝桿菌檢出率均較高，分別為36.42%和34.19%；發(fā)現(xiàn)利福平耐藥患者1038例，利福平耐藥檢出率為17.02%；耐多藥患者395例，耐多藥檢出率為6.48%，高于2017年和2018年利福平耐藥檢出率(分別為9.52%和13.77%)[2]。筆者認(rèn)為主要原因有二，一是多部門(mén)的有效合作和統(tǒng)一招標(biāo)在短時(shí)間內(nèi)迅速落實(shí)了經(jīng)費(fèi)和分子生物學(xué)設(shè)備和試劑的到位；二是多方位提高痰標(biāo)本采集質(zhì)量和檢測(cè)人員檢測(cè)能力，如專(zhuān)家現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)和培訓(xùn)、組織召開(kāi)了多輪實(shí)驗(yàn)室工作推進(jìn)及診斷技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)培訓(xùn)會(huì)、全省發(fā)放留取痰樣本方法掛圖，以及加強(qiáng)臨床醫(yī)生相關(guān)培訓(xùn)。

三、全面應(yīng)用含分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)診斷流程的成效

全面應(yīng)用含分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的診斷流程后，吉林省病原學(xué)陽(yáng)性率為59.34%，提前完成了《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》和中蓋項(xiàng)目三期病原學(xué)陽(yáng)性率達(dá)到50%的目標(biāo)。另外，吉林省涂陰患者在疑似活動(dòng)性肺結(jié)核患者中的占比較高(62.10%，6383/10 278)，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)涂陰患者結(jié)核分枝桿菌的檢出率為35.15%，與既往研究結(jié)果(28.57%～40.8%)[12-14]接近，表明分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)作用顯著，且僅分子生物學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性者在病原學(xué)陽(yáng)性患者中的占比為35.92%(2191/6099)，進(jìn)一步證明分子生物學(xué)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的重要性。

本調(diào)查顯示，病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者接受分子生物學(xué)快速耐藥檢測(cè)比例為100.00%，提示對(duì)病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者全面開(kāi)展耐藥快速檢測(cè)是可行的。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，吉林省2019年病原學(xué)陽(yáng)性患者中的利福平耐藥率為17.02%，耐多藥率為6.48%。其中，初、復(fù)治患者耐多藥率(分別為4.00%和21.21%)均低于我國(guó)同年初、復(fù)治患者耐多藥率(7.1%和23.0%)[15]；初治患者利福平耐藥率(11.37%)高于云南(3.3%)[16]，低于重慶市(25.4%)[17]；復(fù)治患者利福平耐藥率(50.63%)高于云南(13.6%)[16]、重慶(32.3%)[17]，以及國(guó)內(nèi)6個(gè)省份的調(diào)查結(jié)果(36.6%)[18]。這提示，盡管吉林省初、復(fù)治肺結(jié)核患者利福平耐藥水平低于全國(guó)水平，但復(fù)治患者利福平耐藥率較高，且是初治患者利福平耐藥率的4.4倍，提示吉林省利福平耐藥防治形勢(shì)嚴(yán)峻。既往研究認(rèn)為，復(fù)發(fā)和復(fù)治失敗的復(fù)治患者多為不規(guī)則和不合理用藥致藥物不良反應(yīng)增加，患者服藥依從性降低，利于耐藥結(jié)核分枝桿菌繁殖[18]，因此，這類(lèi)患者應(yīng)作為重點(diǎn)干預(yù)人群，同時(shí)也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)初治患者的治療管理，避免其轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)治患者[16]。

吉林省利福平耐藥患者中初治患者占57.23%，盡管可能存在抗結(jié)核治療史不明的初治獲得性耐藥患者，但認(rèn)為直接感染耐藥結(jié)核分枝桿菌的原發(fā)性初始耐藥仍可能是其比例較高的主要原因[19]，提示吉林省在結(jié)核病防控策略上應(yīng)高度重視傳染源的控制，特別是耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播。此外，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用也明顯縮短了耐藥結(jié)核病的診斷時(shí)間，從以往傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的2個(gè)月左右縮短至現(xiàn)在的1 d內(nèi)[2]，進(jìn)一步降低了耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播。另外，按照CPA/LAMP診斷流程的要求，分子生物學(xué)核酸檢測(cè)陰性者應(yīng)不再進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)[2]，但為提高病原學(xué)陽(yáng)性患者的比例，本研究在分子生物學(xué)試劑供應(yīng)間隙期，對(duì)分子生物學(xué)檢測(cè)陰性的149例患者進(jìn)行了痰培養(yǎng)，共檢出13例陽(yáng)性患者。這提示可對(duì)分子生物學(xué)檢測(cè)陰性患者進(jìn)一步行痰培養(yǎng)，以進(jìn)一步提高病原學(xué)陽(yáng)性率。對(duì)于經(jīng)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)未檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌的31例涂陽(yáng)患者，認(rèn)為可能與檢測(cè)標(biāo)本不一致或是該涂陽(yáng)患者檢測(cè)前已開(kāi)始治療有關(guān)。

綜上所述，吉林省全面應(yīng)用含分子生物學(xué)技術(shù)的診斷流程成果顯著，明顯提高了肺結(jié)核患者病原學(xué)陽(yáng)性率，大幅縮短了耐藥診斷時(shí)間，基本發(fā)現(xiàn)并掌握了全省的利福平耐藥水平。這些成效均與中蓋項(xiàng)目三期的政策支持、經(jīng)費(fèi)保障、設(shè)備配置、技術(shù)培訓(xùn)和專(zhuān)家指導(dǎo)等軟硬件的建設(shè)措施密不可分。