五種抗結(jié)核新藥在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)/藥效學(xué)初步研究

朱慧 付雷 張煒焱 王彬 陳曦 陸宇

藥物是治療結(jié)核病的主要手段。近年來，抗結(jié)核新藥的研發(fā)取得了一定的成果，二芳基喹啉類化合物貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)和硝基咪唑類化合物德拉馬尼(delamanid，Dlm)是近50年來抗結(jié)核新藥研發(fā)成果的代表，被多個國家批準(zhǔn)用于治療耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)[1-3]。藥代動力學(xué)/藥效學(xué)(pharmacokinetic/pharmacodynamics，PK/PD)研究在這些新藥的研發(fā)和應(yīng)用過程中不可或缺，在優(yōu)化藥物治療、預(yù)防結(jié)核分枝桿菌耐藥性的產(chǎn)生等諸多方面均有重要作用[4]。感染動物PK/PD的實驗可用于研究抗菌藥物的不同給藥方案進(jìn)入感染動物體內(nèi)的PK特點、抑菌或殺菌效果(包括細(xì)菌菌落計數(shù)降低或動物存活率/死亡率)及治療時間的長短，據(jù)此獲得動物PK/PD指數(shù)及靶值，與臨床研究結(jié)果有較好的一致性，可用于臨床療效的預(yù)測。

本研究選擇近年來有代表性的5種抗結(jié)核藥物，對其PK/PD進(jìn)行了初步研究。按照WHO對MDR-TB推薦治療藥物的分類，Bdq、氯法齊明(clofazimine，Cfz)和Dlm分屬于A、B、C類藥物[5]。硝基咪唑類化合物普托馬尼(pretomanid，PA-824)于2019年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)與Bdq和利奈唑胺聯(lián)合使用治療廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)，以及對其他療法不耐受或無響應(yīng)的MDR-TB。苯并噻嗪酮類化合物PBTZ-169尚處于臨床試驗階段[6-7]。本研究對感染了結(jié)核分枝桿菌的BALB/c小鼠給予不同劑量的上述5種抗結(jié)核藥物，觀察它們在小鼠體內(nèi)不同時間的治療效果，同時測定血漿藥物濃度、含藥培養(yǎng)板上生長菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，分析不同給藥劑量下血漿藥物濃度與治療效果，Cmax/MIC與耐藥的關(guān)系，為臨床抗結(jié)核藥物的使用提供更多的理論依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1. 藥物及試劑：Bdq(瀚香生物科技有限公司；批號20190329)；PA-824(瀚香生物科技有限公司；批號20190528)；Cfz(瀚香生物科技有限公司；批號20190328)；PBTZ-169(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所)；Dlm(上海陶術(shù)生物科技有限公司；批號T4202)；甲醇(賽默飛世爾科技公司；色譜純，批號086535)；甲酸(北京迪科馬科技有限公司；色譜純，批號7297697)；水為去離子水。

2. 動物：無特定病原體(SPF)級雌性BALB/c小鼠170只，體質(zhì)量16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(小鼠批號20200414；合格證號1100112011016474)。飼養(yǎng)在為感染動物設(shè)計的有空調(diào)的房間，每籠5只小鼠，溫度(21±2) ℃，濕度55%±15%，保持12 h燈光/12 h黑暗的循環(huán)，動物可以方便地獲取食物和過濾的水。實驗開始前使動物適應(yīng)環(huán)境一周。小鼠實驗由北京胸科醫(yī)院動物倫理委員會審批后進(jìn)行(編號2020-003)。

3. 菌株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294)為本研究室保存菌株。

4. 其他設(shè)備：美國Agilent公司1200型高效液相色譜系統(tǒng)，配備電噴霧(ESI)離子源的G6410B型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，其他設(shè)備還包括Milli Q純水機(jī)、Mettler Teledo XS 105十萬分之一分析天平等。

二、研究方法

(一)小鼠感染結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株模型的建立

按照氣溶膠感染裝置(099C A4224 Inhalation Exposure System)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv感染小鼠，感染劑量為5×106CFU/ml。170只小鼠感染后，隨機(jī)抓取分籠，5只/籠。感染14 d后處死5只小鼠，以菌落形成單位(CFU)計數(shù)基線值；感染后第28天開始治療，治療當(dāng)天處死5只小鼠進(jìn)行CFU計數(shù)。治療分為4周和8周治療組。

(二)給藥及處理

感染后14 d、28 d分別處死5只小鼠，做肺、脾組織活菌計數(shù)。感染第28天開始給予藥物治療，藥物均用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，4 ℃保存，給藥前藥物經(jīng)溫水浴，口服灌胃給藥，給藥量0.2 ml/只，1次/d，每周給藥5次(表1)。對照組小鼠不給藥治療，灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉0.2 ml/只。給藥后的4周和8周，在最后一次給藥3 h后，于小鼠眼眶采血，由高效液相色譜質(zhì)譜法測量藥物在血漿中的濃度。之后，分別處死各組小鼠，在無菌操作下解剖，使用Bdq和Cfz治療的小鼠組活菌計數(shù)使用含0.4%活性炭的7H10培養(yǎng)基。

表1 五種藥物實驗分組

(三)含藥培養(yǎng)基的制備及接種

在7H10培養(yǎng)基中加入4×MIC濃度的藥物溶液，終濃度為Dlm 0.02 μg/ml，PA-824 0.25 μg/ml，PBTZ-169 2 ng/ml，Bdq 0.2 μg/ml，Cfz 1 μg/ml。在4周和8周解剖小鼠后，各給藥組小鼠的肺、脾勻漿液原液(3 ml/臟器)取0.1 ml接種于含4倍MIC濃度藥物的培養(yǎng)板上，在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。

(四)高效液相色譜質(zhì)譜檢測中對照品溶液的配制

精密稱取5種藥物，溶于甲醇中配制成2 mg/ml儲備液，-80 ℃冰箱保存，使用時稀釋至所需濃度。

(五)液相色譜質(zhì)譜檢測血藥濃度

1. 樣品處理方法及質(zhì)控樣制備：小鼠空白血漿室溫解凍后，精密量取45 μl，加入已知濃度的各藥物5 μl，再加入乙腈溶液100 μl沉淀蛋白，旋渦振蕩混勻后，4 ℃，11 000×g離心10 min，取上清液置于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣檢測。

2. 色譜條件：分析柱為Agilent ZORBAX SB-C18(直徑×長度為2.1 mm×100 mm，填料粒徑3.5 μm)；流動相：水(含0.1%甲酸，5 mmol/L甲酸胺)、甲醇、乙腈；各藥物流動相比例：Bdq(水∶甲醇=15∶85)，Dlm(水∶甲醇=25∶75)，Cfz(水∶乙腈=20∶80)，PBTZ-169(水∶甲醇=20∶80)，PA-824(水∶甲醇=25∶75)；流速：0.3 ml/min，進(jìn)樣量為2 μl。

3. 質(zhì)譜條件：離子化方式：ESI；離子極性：正離子；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測，母離子和子離子m/z分別為555. 2/58.2(Bdq)、535.2/352.0(Dlm)、473.1/431.0(Cfz)、457.2/344.1(PBTZ-169)、360.2/175.1(PA-824)；毛細(xì)管電噴霧電壓：4 kV，去溶劑氣體溫度：350 ℃，去溶劑氣體流速：10 L/min。

(六)結(jié)核分枝桿菌MIC值測定

從有菌落生長的含藥培養(yǎng)板中挑取單菌落后研磨，加入7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再進(jìn)行MIC測定(每株菌測定最少2次)。MIC測定采用Alamar Blue法，具體方法參見文獻(xiàn)[8]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、小鼠給藥4周和8周時體質(zhì)量變化情況

170只小鼠分為對照組及5個給藥組，小鼠體質(zhì)量變化情況見表2。經(jīng)統(tǒng)計分析，4周時各給藥組小鼠體質(zhì)量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，8周時Dlm-M、Bdq-M、PBTZ-169-M、PBTZ-169-H組體質(zhì)量與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

表2 各組小鼠給藥4周和8周時體質(zhì)量變化情況

二、藥物劑量與血藥濃度

在給藥4周和8周時，各組藥物在小鼠血漿中的濃度測定結(jié)果見表3。5種藥物在多劑量給藥后，測得的血藥濃度均高于其對H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的MIC值。Cfz在10 mg/kg劑量時血藥濃度達(dá)到穩(wěn)值，此后不隨劑量增加而繼續(xù)增長；Bdq、PBTZ-169、PA-824 的血藥濃度隨給藥劑量遞增，其中PBTZ-169和PA-824的血藥濃度增長并不完全隨劑量的比例而等比例增加；Dlm 在5 mg/kg和2.5 mg/kg劑量時血藥濃度相當(dāng)，10 mg/kg時血藥濃度約為低、中劑量組的2倍。

表3 各組小鼠給藥4周和8周時藥物在血漿中的濃度

三、CFU計數(shù)結(jié)果(藥效學(xué)指標(biāo))

在給藥8周后，各給藥組小鼠脾、肺臟器勻漿液計數(shù)結(jié)果見表4和圖1。比較各給藥組與對照組CFU計數(shù)結(jié)果，PA-824與Dlm在3個劑量下，脾臟菌落培養(yǎng)均為陰性，肺臟菌落計數(shù)隨著給藥劑量的增加而下降，PA-824高劑量組下降2.66 log10值(低劑量組P>0.05，中、高劑量組P<0.01)；Cfz組3個劑量下，脾、肺臟CFU計數(shù)與對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，低劑量組與中劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Bdq組肺臟菌落計數(shù)隨著給藥劑量的增加而下降，高劑量組下降2.99 log10值(低劑量組P<0.05，高劑量組P<0.001)；PBTZ-169在低劑量組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，中劑量組脾臟菌落培養(yǎng)陰性，高劑量組肺臟菌落計數(shù)下降1.54 log10值(P<0.001)。以肺CFU計數(shù)與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義為判斷標(biāo)準(zhǔn)，各藥物最低有效劑量分別為PA-824 30 mg/kg，Dlm 5 mg/kg，Cfz 5 mg/kg，Bdq 6.25 mg/kg，PBTZ-169 20 mg/kg。在有效劑量下，Bdq顯示出明顯的殺菌活性，其次是PA-824。

表4 各組小鼠給藥8周后菌落形成單位計數(shù)結(jié)果

續(xù)表4

注 Bdq：貝達(dá)喹啉；Dlm：德拉馬尼；Cfz：氯法齊明；PA-824：普托馬尼；L、M、H分別表示低、中、高劑量組圖1 給藥8周時各給藥組小鼠肺臟log10CFU

四、含藥培養(yǎng)基中單菌落MIC值的測定

對給藥8周的BALB/c小鼠肺、脾勻漿液接種后CFU，包括在含藥/不含藥培養(yǎng)板上的CFU結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，具體見表5～9。給藥8周后，PA-824、Dlm及PBTZ-169組小鼠肺脾CFU計數(shù)極少，為排除藥物殘留引起的抗生素后效應(yīng)，對此三組藥物，再次制備含0.4%活性炭的固體7H10培養(yǎng)板，第2次接種肺、脾勻漿液，對含藥培養(yǎng)板上生長的菌落進(jìn)行MIC測定。

表5 給藥普托馬尼8周BALB/c小鼠肺、脾勻漿液接種后菌落數(shù)

與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株相比，Bdq組4周時中、高劑量組有菌落MIC值約為其2倍，8周時Bdq高劑量組有1株菌MIC值約為其10倍，低、中劑量組有菌落MIC值約為其2倍；Cfz組4周時低劑量組有菌落MIC值約為其2～5倍，8周時高劑量組有3株菌MIC值約為其5～6倍，低、中劑量組MIC值約為其2倍；PA-824組4周時低劑量組有菌落MIC值約為其2倍，8周時低劑量組有1株菌MIC值約為其4倍；8周時PBTZ-169低劑量組有1株菌MIC值約為其10倍；Dlm低、中、高劑量組MIC值約為其2倍。

五、Cmax/MIC與肺菌落計數(shù)及耐藥

給藥8周時對Cmax/MIC與小鼠肺log10CFU進(jìn)行相關(guān)性分析，圖2中可以看到二者呈負(fù)相關(guān)，R2值均在0.9以上，相關(guān)性較好。5種藥物給藥后的小鼠肺、脾臟器勻漿液均在含藥培養(yǎng)板上發(fā)現(xiàn)有菌落生長，大部分菌落MIC值與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv一致，少數(shù)菌株MIC值有所增高，這些MIC值增高的菌株對藥物表現(xiàn)出耐受性/表型抗性。以Cmax/MIC的數(shù)值來分析，在本實驗中，PA-824 100 mg/kg時，Cmax/MIC>147；Dlm 10 mg/kg時，Cmax/MIC>100；Cfz 20 mg/kg時，Cmax/MIC>2；Bdq 25 mg/kg時，Cmax/MIC>13.6；PBTZ-169 20 mg/kg時，Cmax/MIC>150，則不易產(chǎn)生藥物耐受性/表型抗性。

表6 給藥德拉馬尼后8周BALB/c小鼠肺、脾勻漿液接種后菌落數(shù)

表7 給藥PBTZ-169后8周BALB/c小鼠肺、脾勻漿液接種后菌落數(shù)

表8 給藥氯法齊明后8周BALB/c小鼠肺、脾勻漿液接種活性炭含藥培養(yǎng)板后菌落數(shù)

表9 給藥貝達(dá)喹啉后8周BALB/c小鼠肺、脾勻漿液接種活性炭含藥培養(yǎng)板后菌落數(shù)

圖2 給藥8周時Cmax/MIC與小鼠肺log10CFU關(guān)系圖

討 論

近10年來，抗結(jié)核新藥的研發(fā)取得了明顯進(jìn)展，PK/PD研究在其中的重要性也進(jìn)一步凸顯[9-10]。筆者對近些年上市和處于臨床研究階段的5種抗結(jié)核藥物的PK/PD進(jìn)行了初步研究。5種藥物劑量設(shè)定，參考已報道的多項小鼠實驗中最低有效劑量[11-15]，分為高中低劑量組，除PA-824外，高、中、低劑量組給藥量依次倍比遞減，以小鼠肺脾CFU計數(shù)評估療效。

CFU計數(shù)結(jié)果顯示，除Cfz外，其余藥物組的脾組織治療效果均優(yōu)于肺組織，可能與實驗采用了氣溶膠感染，小鼠肺部荷菌量高于脾臟有關(guān)。早期有其他研究提到，Dlm以2.5 mg/kg的劑量給藥4周，可使尾靜脈感染M.tuberculosisKurono菌株的美國癌癥研究所(ICR)小鼠肺組織荷菌數(shù)下降4.1 log10值[11]，PA-824以100 mg/kg劑量連續(xù)給藥8周，可使氣溶膠感染H37Rv菌株的BALB/c小鼠肺組織荷菌數(shù)下降4 log10值[12]，本實驗未觀察到如此明顯的下降，推測與不同小鼠品系、不同感染方式，以及開始治療時肺組織荷菌量不同(文獻(xiàn)[11]和[12]中初始肺臟荷菌量均高于7 log10CFU)有關(guān)。

結(jié)合Cmax分析CFU結(jié)果可以看到，各組從最低有效劑量起，隨給藥劑量增加，血藥濃度增加，肺CFU計數(shù)下降增加，即在本實驗最低有效劑量和最高劑量范圍區(qū)間，藥物療效與劑量和血藥濃度呈正相關(guān)。Cmax/MIC、AUC/MIC、血藥濃度高于MIC的時間(%TMIC)是主要的PK/PD參數(shù)，我們觀察到Cmax/MIC與小鼠肺log10CFU具有明顯的相關(guān)性。有報道顯示，AUC0～24/MIC是與Dlm治療效果相關(guān)的PK參數(shù)，Cmax、AUC0～24與給藥劑量呈正比[9]。在本實驗中，Dlm 2.5 mg/kg組與5 mg/kg組Cmax相近，CFU計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，隨著劑量增加至10 mg/kg，Cmax增長近2倍，高劑量組治療效果優(yōu)于中劑量組。PA-824相關(guān)的PK/PD參數(shù)為游離血藥濃度高于MIC的持續(xù)時間(fT)>MIC[16]，本實驗中高劑量組CFU計數(shù)下降比中劑量組更明顯，因為高劑量組血藥濃度高于中劑量組，在消除速率相同的前提下，fT>MIC的時間更長。Swanson等[14]報道Cfz在6.25、12.5、25 mg/kg時，血漿與組織濃度隨劑量增加，2周后對結(jié)核感染小鼠有劑量依賴性的殺菌活性，本實驗中Cfz 20 mg/kg 組血藥濃度高于中劑量和低劑量組，治療效果更好。Bdq尚無明確的與療效相關(guān)的PK/PD參數(shù)報道，但有研究表明，Bdq的暴露量與療效相關(guān)[17]，與本實驗中觀察到Cmax與療效的正相關(guān)一致。而PBTZ-169在人體內(nèi)，有報道單次和多次給藥后，在640 mg劑量范圍內(nèi)PK呈線性關(guān)系[18]，本實驗中PBTZ-169療效高劑量組優(yōu)于中劑量組。

本研究還對含藥培養(yǎng)基上分離的菌落進(jìn)行了MIC值的測定。結(jié)果可以看到，在低劑量時，含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)更多，MIC升高，高劑量時含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)減少，但是能分離到MIC值更高的菌株，筆者認(rèn)為這與高劑量藥物大量殺死小鼠體內(nèi)敏感菌，使得存活的結(jié)核分枝桿菌更耐受藥物有關(guān)。Ismail等[19]報道Bdq在0.24 μg/ml時，敏感株突變率為5×10-8，0.12 μg/ml時，敏感株突變率為5×10-7，即外部藥物壓力較低時，突變率更高，與本實驗中低劑量組含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)更多的現(xiàn)象一致。結(jié)合Cmax/MIC參數(shù)，在結(jié)核病治療過程中，若結(jié)核分枝桿菌MIC增高，就需要增加給藥劑量以獲得更高的Cmax，從而保證治療效果。

本研究存在不足之處：(1)小鼠的PK僅測定了3 h血漿藥物濃度用于估算Cmax，并不一定是真實的Cmax；(2)沒有測定結(jié)核感染小鼠靶器官——肺臟的藥物濃度；(3)測定MIC時，僅挑選了培養(yǎng)板上的部分菌落，不一定能代表全部生長菌落的MIC值范圍；(4)僅考察了Cmax/MIC參數(shù)，未進(jìn)行其他PK/PD參數(shù)的研究。這些不足需要在后續(xù)實驗中進(jìn)一步研究。

綜上，本文對5種抗結(jié)核藥物在小鼠體內(nèi)PK/PD 進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)Cmax/MIC作為主要PK/PD參數(shù)之一，與療效有較好的相關(guān)性。Cmax/MIC 大于臨界值時，結(jié)核分枝桿菌不易產(chǎn)生藥物耐受性/表型抗性。根據(jù)每種藥物的PK/PD特性，在臨床用藥過程中對治療藥物進(jìn)行監(jiān)測，獲得相應(yīng)的PK參數(shù)，結(jié)合PD可以判斷藥物是否達(dá)到有效暴露量，并及時調(diào)整給藥劑量、給藥間隔等，從而優(yōu)化抗結(jié)核藥物的使用。