蚯蚓勻漿上清液對豬場常見有害菌的抗菌效果

楊悅妍，莫奕豪，田佳敏，金翔，賈立明，蒲蕾,通信作者

蚯蚓勻漿上清液對豬場常見有害菌的抗菌效果

楊悅妍1，莫奕豪1，田佳敏1，金翔1，賈立明2，蒲蕾1,通信作者

（1.天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2.天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖有限公司，天津 301500）

隨著無抗生素飼料添加劑時代的到來，無抗飼料或替代抗生素飼料的研發(fā)成為了目前研究的熱點。蚯蚓本身即為優(yōu)質的蛋白質飼料，而且中醫(yī)認為蚯蚓具有多項治療疾病的功效。為確定蚯蚓勻漿液上清液對豬場分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及副豬嗜血桿菌這幾種常見有害菌的抗菌效果，運用紙片擴散法（K－B法）與紫外分光光度法研究蚯蚓體勻漿處理液的抗菌性能。經紙片擴散法研究發(fā)現蚯蚓勻漿液上清對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及副豬嗜血桿菌均有不同程度的抗菌效果；最濃的蚯蚓勻漿液上清（蚯蚓與水的比例為2∶1）對大腸桿菌具有抗菌效果；蚯蚓勻漿液上清液對金黃色葡萄球菌具有較為明顯和廣譜的抗菌效果；蚯蚓與水的比例為4∶5時對鏈球菌和副豬嗜血桿菌的抗菌效果明顯。液體培養(yǎng)的紫外分光光度試驗表明：兩種處理對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌有不同程度的抗菌效果；蚯蚓勻漿液2效果更為明顯； 24 h后，蚯蚓勻漿上清液的抗菌優(yōu)勢完全消失。本研究表明，蚯蚓勻漿上清液對豬場常見有害菌具有一定抗菌性，可為蚯蚓相關新型飼料原料開發(fā)提供理論依據。

蚯蚓；勻漿上清液；紙片擴散法（K－B法）；紫外分光光度計法；抗菌

隨著無抗生素飼料時代到來，在保證畜禽健康前提條件下，如何提高動物的生產性能成為了目前養(yǎng)殖行業(yè)研究的熱點。蚯蚓為一種生活在潮濕并充滿大量微生物環(huán)境中以腐敗有機物為食的腐生生活動物，其具有在感染病菌的情況下大量合成抗菌肽類物質的能力并且能阻止病原對其繼續(xù)侵染[1-2]。蚯蚓的抗菌肽被證實具有一定的抗菌、抗病毒功能，有研究稱蚯蚓具有解熱退熱、鎮(zhèn)痛、抗哮喘、促進傷口愈合等作用[3]。李曾夏子等人曾通過蚯蚓抗菌肽及兔巴氏桿菌的體外試驗，證實其對兔巴氏桿菌具有抗菌作用，并且經一定處理后對兔巴氏桿菌病的治愈率可達100%，這為醫(yī)藥獸藥行業(yè)發(fā)展提供了新思路[4-5]。蚯蚓不僅具有諸多治療、抗菌、抗病毒功能，還具有非常高的動物蛋白[6]。蚯蚓廉價易得，且與豬場常見抗生素類飼料添加劑（如土霉素、喹乙醇等）相比更為安全健康，適合用于飼料添加以替代抗生素飼料添加劑。蚯蚓的種種功效受到人們關注，但目前人們對蚯蚓體自身抗菌性能及相關應用研究還相對較少。以往的研究者利用化學試劑、電擊等方式刺激蚯蚓，使其將含有抗菌肽類物質的黃色液體分泌到體表，進行其他預處理，再進行抗菌試驗，操作起比較復雜且對蚯蚓做了過多刺激[7-9]。本試驗避免使用物理刺激或化學試劑添加，通過勻漿和離心等簡易操作，得到含有抗菌肽類物質的蚯蚓勻漿上清液，利用紙片擴散法（K-B法）和紫外分光光度計法測其OD值，確定其對幾種豬場常見有害菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等）的抗菌效果及影響因素，以便于日后在畜牧場規(guī)?；瘧?。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

蚯蚓：糞基料中飼養(yǎng)的大平二號蚯蚓。

菌種：大腸桿菌（）；金黃色葡萄球菌（）；鏈球菌（）；副豬嗜血桿菌（）。

儀器：DSX-280B型高壓蒸汽滅菌鍋；AX224ZH型電子天平；GZX-9240 ME型鼓風干燥箱；HZQ-F100型振蕩培養(yǎng)箱；TGL-16B型高速臺式離心機；SW-CJ-2F型超凈工作臺；TP-24型Tissue Prep快速組織細胞破碎儀；熱空氣消毒箱；恒溫培養(yǎng)箱；UV-5100B紫外可見分光光度計。

1.2 蚯蚓勻漿上清液的獲得

取10 g大平二號蚯蚓用流水沖洗并排糞10 h。再用PBS緩沖液、無菌蒸餾水反復沖洗蚯蚓表面。將蚯蚓按不同比例加入蒸餾水稀釋，蚯蚓與蒸餾水的稀釋比例由濃到稀依次為：（2∶1）、（1∶1）、（4∶5）、（1∶2）、（4∶25）、（2∶25）。稀釋完畢后裝入2 mL離心管中，在離心管中放入適量磁珠后啟動快速組織細胞破碎儀使蚯蚓均勻成漿。再放入高速離心機調至4 000 r/min，20 min后，取離心后的上清液備用。

1.3 紙片擴散法（K－B法）試驗方法

將滅菌、烘干后的待用藥敏片浸泡于裝有各濃度蚯蚓勻漿上清液的離心管中。再將這些離心管放入振蕩培養(yǎng)箱中調至160 r/min，震蕩2 h使其充分浸泡。浸泡后將離心管取出放置于超凈工作臺，用鑷子將藥敏片夾出平貼于干燥培養(yǎng)皿，注意不同藥敏片之間的距離，做好標記后放入37 ℃培養(yǎng)箱內12～15 h，烘干備用[10]。

將制作好的藥敏片緊貼于待測菌種所在培養(yǎng)基上，此時也要注意不同種藥敏片間要保留一定距離，避免互相干擾。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并分別在培養(yǎng)的第6、12、24小時，使用游標卡尺測量其抑菌圈直徑大小，試驗3次，每次測量3次取平均值。

1.4 紫外分光光度計試驗方法

將10 g大平二號蚯蚓按上述方法制作勻漿上清液備用，蚯蚓勻漿液稀釋比例為1∶1和1∶4。將待用菌種放入搖床活化2 h，待其接近對數生長期菌液時，取0.5 mL加入到20.0 mL液體培養(yǎng)基中混合（下文直接稱為菌液），再分別加入已制備比例為1∶1的蚯蚓勻漿上清液（蚯蚓勻漿液1）和比例為1∶4的蚯蚓勻漿上清液（蚯蚓勻漿液2）0.82 mL。各種菌操作步驟同上并做好標記以區(qū)分，放入振蕩培養(yǎng)箱中溫度調至37 ℃培養(yǎng)24 h。將不同菌的不同處理分組并在培養(yǎng)的第0、6、12、24小時利用紫外可見分光光度計測其OD值，測量前將其搖勻，測量時吸光度調至540 nm[11]。

1.5 數據分析

1.5.1 藥敏片抑菌圈直徑大小分析方法

先測得放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱后的第6、12、24小時時，蚯蚓勻漿上清液對各菌種產生的抑菌圈直徑大小后，再將所有重復試驗的數據進行匯總整理。并計算其平均值及標準差后再對數據進行分析。

1.5.2 紫外分光光度計OD值計算抑菌率方法

將數次試驗下各組所測得數據在Excel中進行歸納整理：行標題分別為對照組和各種菌組別的不同處理，列標題為0 h、6 h、12 h、24 h四個測量時間。將不同處理所對應的OD值填入并進行整理，分別用6 h、12 h、24 h與0 h對應數據作差（盡可能排除液體本身顏色對試驗數據的影響）。再利用以下公式計算抑菌率[11]：抑菌率＝（對照組OD值－試驗組OD值）/（試驗組OD值）×100%。

2 結果

2.1 紙片擴散法（K－B法）

2.1.1 蚯蚓勻漿上清液對大腸桿菌抗菌效果

蚯蚓與蒸餾水稀釋比例最濃（比例為2∶1）的藥敏片不論何時測量周圍均有抑菌圈形成，而其他稀釋比例（1∶1、4∶5、1∶2、4∶25、 2∶25）下的處理組并無抑菌圈。且比例為2：1的處理組在第一次測量（6 h）時就有明顯的抑菌圈10.63 mm，且之后的幾次測量均可測出明顯抑菌圈直徑。即蚯蚓抗菌肽對大腸桿菌有抗菌效果，且蚯蚓勻漿上清液的比例越大對其抗菌效果越明顯（表1，圖1）。

表1 蚯蚓勻漿上清液對大腸桿菌抑菌圈大小 mm

注：藥敏片的直徑為6 mm，下同

2.1.2 蚯蚓勻漿上清液對金黃色葡萄球菌抗菌效果

通過試驗發(fā)現，稀釋比例為2∶1的處理組在培養(yǎng)6 h就已有抑菌圈產生，第12、24小時測量時，抑菌圈消失；稀釋比例為1∶1的處理組在培養(yǎng)12 h時測量出抑菌圈，并隨著培養(yǎng)時間增加抑菌圈直徑大小也增加；比例為4∶5的處理組在培養(yǎng)12 h時觀察到有抑菌圈形成，12 h、24 h時其抑菌圈大小幾乎無變化；1∶2比例的處理組在培養(yǎng)24 h測量出明顯的抑菌圈，其直徑為15.30 mm；4∶25、2∶25比例的藥敏片在24 h內的3次測量中均無抑菌圈形成（表2，圖2）。

表2 蚯蚓勻漿上清液對金黃色葡萄球菌抑菌圈大小 mm

2.1.3 蚯蚓勻漿上清液對鏈球菌抗菌效果

蚯蚓與蒸餾水稀釋比例為4∶5的處理組在培養(yǎng)6 h時可測量到抑菌圈直徑，而12 h、24 h測量無抑菌圈；2∶25比例處理組在第6小時可觀察到明顯抑菌圈。其余處理（2∶1、1∶1、1∶2、4∶25）并無抑菌圈產生（表3，圖3）。

表3 蚯蚓勻漿上清液對鏈球菌抑菌圈大小 mm

2.1.4 蚯蚓勻漿上清液對副豬嗜血桿菌抗菌效果

從表4、圖4可以看出，蚯蚓抗菌肽對副豬嗜血桿菌有抑制作用。稀釋比例為4∶5的處理組在培養(yǎng)的第6小時可測得抑菌圈；4∶25的處理組在第三次（24 h）觀察時才能測量到抑菌圈直徑。其他比例 （2∶1、1∶1、1∶2、2∶25）并無抑菌圈形成。

表4 蚯蚓勻漿上清液對副豬嗜血桿菌抑菌圈大小 mm

2.2 紫外分光光度計測抑菌率

2.2.1 蚯蚓勻漿液1對3種菌在不同培養(yǎng)時間及處理下的抑菌率

蚯蚓勻漿液1處理組對大腸桿菌并無抗菌效果。蚯蚓勻漿液1處理組對金黃色葡萄球菌出現抗菌效果的時間大致在培養(yǎng)的第6小時到12小時之間，12 h能直接測出其抑菌率，之后抗菌效果逐漸減弱，24 h測量時無抗菌效果。蚯蚓勻漿液1處理組對鏈球菌并無抗菌效果。

表5 蚯蚓勻漿液1對3種菌在不同培養(yǎng)時間及處理下的抑菌率

2.2.2 蚯蚓勻漿液2對3種菌在不同培養(yǎng)時間及處理下的抑菌率

蚯蚓勻漿液2處理組在第一次測量時就對大腸桿菌表現出一定的抗菌效果，這種效果隨時間增長而減弱。蚯蚓勻漿液2處理組在第6小時測量時對金黃色葡萄球菌表現出抗菌效果，但在12 h 之后測量并無抗菌效果，12 h時變化較大。蚯蚓勻漿液2處理組在首次（第6小時）測量時無抗菌效果，在第12小時測量反映出其對鏈球菌具有抗菌效果，但在第24小時測量時抗菌效果消失。

表6 蚯蚓勻漿液2對3種菌在不同培養(yǎng)時間及處理下的抑菌率

3 討論

在紙片擴散試驗中測得大平二號蚯蚓勻漿上清液中的抗菌成分對豬場常見金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌的生長均有抑制作用。但劉艷琴等試驗表明，用5 V電壓電刺激蚯蚓后收集到的分泌液對大腸桿菌并無抑制作用，與本試驗所得結果相悖[8]。這種差異可能是由所選的蚯蚓環(huán)境來源不同，在惡劣環(huán)境脅迫下抗菌性能也不同造成的[12]。或是蚯蚓體內抗菌成分提取方式的差異，導致其對同種菌的抑制作用不同，且勻漿液中的抗菌物質對不同菌種的抗菌作用也具有選擇性[13-14]。此外，在菌種號的選取上有所差異也會導致試驗結果略有不同。劉兵等在蚯蚓對大腸桿菌的抗菌效果研究中發(fā)現，經大腸桿菌菌液誘導（抑菌圈直徑最大為18 mm）及電刺激（抑菌圈直徑最大為20 mm）后所得的抗菌物質對大腸桿菌的抗菌效果要優(yōu)于本試驗所得結果（抑菌圈最大直徑為10.63 mm）[9]。但本試驗中所用的含抗菌物質的蚯蚓勻漿上清液較上述研究中的處理更為方便，無需電擊、化學試劑添加等步驟，達到的抗菌效果也可觀，可試用于獸藥中來防治一些常見細菌類疾病，或增強畜禽自身的抗菌能力。

本試驗大多數處理組在培養(yǎng)24 h后所測得的抑菌圈直徑縮小或消失。出現這一現象的原因可能是，抗菌類藥物的半衰期長短不同，如青霉素類藥物T1/2（半衰期）為0.5～1.0 h；頭孢菌素類多數T1/2為1.0～2.0 h、氨基糖苷類藥物T1/2約為2.0～4.0 h，在臨床應用時會嚴格按照標準的給藥間隔來維持藥物在體內的濃度以達到抗菌效 果[15-18]。王升蘭等曾測過一種抗菌肽的半衰期，用ELISA法測得為1.5 h，同位素示蹤法測得為6 h[19]。本試驗中所用的蚯蚓勻漿上清液為多肽物質，成分多種且復雜，其抗菌性能會在短期內失效造成抑菌圈變?。ㄔ囼炛袀€別濃度下在12 h時就已失效），推斷為半衰期較短所致。

在紙片擴散試驗中抗菌效果出現了兩種情況：蚯蚓勻漿上清液多種濃度均對金黃色葡萄球菌及鏈球菌產生了抗菌效果，但抑菌圈直徑大小與其他菌相比差別較?。淮竽c桿菌及副豬嗜血桿菌對濃度的選擇性更高，只有幾種濃度能對其產生抗菌作用，但其所得的抑菌圈直徑較其他三種菌更大。單安山等介紹了抗菌肽抗菌機制之一，即為細菌的細胞膜或細胞壁，抗菌肽會通過對細菌的細胞壁進行破壞從而達到抗菌的效果[20]。故推測此現象可能是由于構成革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌的細胞壁成分差異所致。

利用紫外分光光度計法確定蚯蚓勻漿液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌的抗菌效果與紙片擴散法所測得的結果相匹配，前者相對后者所得的結果更精準。潘衛(wèi)東等曾利用分光光度計法測培養(yǎng)24 h后加有蚯蚓抗菌成分物質及金黃色葡萄球菌液液體培養(yǎng)基的分光光度值，得出了對金黃色葡萄球菌有明顯抗菌效果的結果（＜0.01）[21]。但在本試驗中，24 h時測量出的結果為并無抗菌效果。通常在培養(yǎng)24 h時多數細菌生長處在平臺期或衰退期，例如何嵐等對大腸桿菌的生長曲線進行測量，在20 h左右其進入衰退期[22]。因為上述提及的蚯蚓抗菌肽的半衰期較短，對此時的抗菌效果造成了影響，所以測量后并無抗菌效果。所選用的蚯蚓品種有所差異，其體內的抗菌肽成分的不同也會造成此結果的差異。另外，通過紙片擴散法的結果也可看出，多數處理在第24小時時已經逐漸失效，與分光光度計測得的結果相匹配。

抗生素飼料添加劑濫用，造成環(huán)境污染，導致多種細菌產生耐藥性以及產生食品安全方面的問題。在抵制抗生素飼料添加劑階段，探索抗生素飼料添加劑的替代品成為目前的一個新目標。蚯蚓及其衍生產品均蘊藏著豐富的應用價值，其應用價值不僅局限在環(huán)境污染治理、生物催化、保健品等方面，在養(yǎng)殖和醫(yī)療方面也極具潛力、前景較好[23-24]。在諸多研究中曾證實蚯蚓抗菌肽應用到實際畜禽生產中，提高了畜禽的日增重、降低了畜禽的患病率、減少了養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)成本[25-26]。蚯蚓勻漿液具有較為廣譜的抗菌作用，但紙片擴散法和紫外分光光度計法都反映出抗菌效果與菌量和蚯蚓勻上清液中抗菌肽半衰期長短有關。若將蚯蚓勻漿上清液應用到畜禽生產中，則要考慮飼養(yǎng)環(huán)境中的雜菌數遠大于實驗室環(huán)境中菌量的情況，其抗菌效果會有所影響，可在保證濃度的前提下加大蚯蚓勻漿上清液使用量。另外，可采取給動物多次喂食蚯蚓勻漿上清液的方式，保持其在動物體內的濃度處于穩(wěn)定狀態(tài)以達效果。本試驗所用的蚯蚓勻漿上清液為一種廉價易得、制備簡單、具有效抗菌性且無毒害的物質，其替代抗生素飼料添加劑的可能性及發(fā)揮的作用和實際達到的效果都有很大的研究價值。

4 結論

蚯蚓勻漿上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及副豬嗜血桿菌均具有抗菌作用，不同菌種對蚯蚓勻漿上清液濃度的選擇性不同，而且對其抗菌作用的程度不同。蚯蚓勻漿上清液的抗菌效果具有半衰期短、抗菌較廣譜的特點。根據蚯蚓勻漿上清液的這些特點，可在畜禽飼養(yǎng)及醫(yī)療等方面加以利用。

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Antibacterial activity of Earthworm homogenate supernatant on common harmful bacteria in pig farm

Yang Yueyan1, Mo Yihao1, Tian Jiamin1, Jin Xiang1, Jia Liming2, Pu Lei1,CorrespondingAuthor

（1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University ,Tianjin 300392, China 2.Tianjin Jia Liming Earthworm Breeding Co.Ltd., Tianjin 301500, China）

With the advent of the era of feed without antibiotics, the research and development of feed without antibiotics or alternative antibiotics has become a hot spot of current research.Earthworms are high－quality protein feed, and Chinese medicine believes that earthworms have a number of therapeutic effects.The aim of this study was to determine the antibacterial activity of earthworm homogenate on,,andfrom pig farm, with the antibacterial activity of earthworm homogenate treatment solution studied by Kirby-Bauer test（K-B）and ultraviolet spectrophotometry.The study showed that the supernatant of the earthworm homogenate had antibacterial effects on,,and.The highest concentration of earthworm homogenate supernatant with a ratio of earthworm to water of 2∶1 has antibacterial activity on.The supernatant of earthworm homogenate had obvious and broad－spectrum antibacterial activity effect on.The ratio of earthworm to water 4∶5 had obvious antibacterial activity onand.The spectrophotometric test showed that two different concentrations of supernatant of earthworm homogenate had different degrees of bacteriostatic effect oni,and.Earthworm homogenate 2 was more effective.24 hours later, the antibacterial advantage of earthworm homogenate supernatant disappeared completely.This study showed that the supernatant of earthworm homogenate has certain bacteriostasis to common harmful bacteria in pig farm, which can provide theoretical basis for the development of new feedstuffs related to earthworms.

Earthworm; homogenate supernatant; Kirby－Bauer test（K-B）; ultraviolet spectrophotometry; antibacterial

1008-5394（2021）03-0075-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.016

Q93

A

2020-01-17

青海省重點研發(fā)與轉化計劃—科技援青合作專項（2021-QY-204）；天津農學院大創(chuàng)項目（201810061234）；天津生豬產業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊（ITTPRS2021006）；天津市種業(yè)專項（15ZXZYNC00100）

楊悅妍（1998—），女，本科在讀，主要從事豬遺傳育種方面的研究。E-mail:854296484@qq.com。

蒲蕾（1987—），女，講師，博士，主要從事豬遺傳育種方面的研究。E-mail：pulei87@126.com。

責任編輯：張愛婷