依賴SRP對大腸桿菌膜蛋白定位的研究

崔博顯，趙留群，趙勝，楊建德,通信作者，劉燕霏，張大偉,通信作者

依賴SRP對大腸桿菌膜蛋白定位的研究

崔博顯1，趙留群2，趙勝1，楊建德1,通信作者，劉燕霏1，張大偉2,通信作者

（1.天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300392；2.中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300380）

大腸桿菌中，信號肽識別顆粒（signal recognition particle，SRP）識別并綁定核糖體正在翻譯的信號肽，引導新生肽鏈到細胞膜上。根據靶向膜蛋白生物素?；?，本研究利用Western blot方法，對構建的HDB51菌株及野生型菌株MG1655進行大腸桿菌膜蛋白定位研究。對比不同菌株中是否含有SRP，結果發(fā)現，在缺失SRP的HDB51菌株中檢測到依賴SRP的底物蛋白FtsQ 的定位，缺失SRP 明顯影響了FtsQ的定位，SRP具有輔助膜蛋白定位的功能，從而為研究依賴SRP性大腸桿菌膜蛋白定位提供理論依據。

大腸桿菌；信號肽識別顆粒；膜蛋白定位；FtsQ

大腸埃希氏菌（簡稱）通常也被稱為大腸桿菌，Escherich在1885年發(fā)現大腸桿菌，且一直把它當作腸道中菌群的正常部分，所以大腸桿菌一開始被認為是非致病菌。到20世紀中期，才發(fā)現一些特殊血清型的大腸桿菌在人類和動物中都具有致病性，特別對于嬰兒和幼畜（禽類），可導致敗血癥或嚴重腹瀉。大腸桿菌是常見的原核生物之一，屬于革蘭氏陰性菌，其代謝活動能夠有效抑制腸道內分解蛋白質的微生物生長，從而減少蛋白質分解后的產物對人體造成的危害。此外，大腸桿菌還可以合成維生素B和維生素K，以及含有殺菌功效的大腸桿菌素[1-3]。

信號肽識別顆粒（SRP）是普遍存在于真核和原核生物體中的蛋白質-RNA（Ffh-4.5S RNA）復合體，可介導共翻譯轉運蛋白的跨膜過程，也可引導翻譯中的肽鏈進入膜上的轉運通道[4-6]。大腸桿菌中SRP途徑，主要識別內膜蛋白，這些蛋白在大腸桿菌中行使多種功能，如共翻譯蛋離子、小分子及生物復合體的轉運、細胞的分裂及細胞代謝等[7]。在大腸桿菌中，SRP識別并綁定核糖體正在翻譯的信號肽。當信號序列從核糖體多肽通道出口出現時，SRP立即通過疏水作用識別信號序列并結合，從而形成SRP核糖體復合物（RNC?SRP），保證翻譯轉運同步正確進行。SRP是大腸桿菌生存所必需的，缺失SRP會對機體造成影響，引發(fā)一系列的生理應激效應，其中很重要的是依賴SRP底物的蛋白的錯誤定位或定位 失敗[7-9]。

探討依賴SRP的底物蛋白一直是國內外研究的熱點。近來通過核糖體圖譜技術，發(fā)現了依賴SRP的蛋白有87%是內膜蛋白，6%是間質/外膜蛋白，3%是細胞質蛋白，4%是未知蛋白[10]。本研究根據靶向膜蛋白生物素酰原理利用Western blot，對大腸桿菌膜蛋白定位進行研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

試驗菌株如MG1655、HDB51 （Ampr，Kanr，基因由阿拉伯糖誘導表達），檢測抗體及質粒包括p15A1-birA、p15A2-birA、pJH29-FtsQ-Avi、pJH29-EspP-Avi均有中科院工生所提供。

1.2 主要試劑

試驗試劑如質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，Thermo公司的DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA連接酶，Solarbio公司的氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG誘導劑、阿拉伯糖、goldview染色劑、SSCS試劑、TBST緩沖液、TAE緩沖液、DAB顯色液和LB培養(yǎng)基均購自Omega Bio-Tek公司。

1.3 質粒轉化

具體方法參照文獻[10]進行。將構建正確的質粒電轉化分別轉入不同感受態(tài)菌株中，獲得含有p15A1-birA的兩株MG1655（pJH29-FtsQ-Avi和pJH29-EspP-Avi）和含有p15A2-birA的兩株HDB51（pJH29-FtsQ-Avi和pJH29-EspP-Avi）細菌。

1.4 蛋白定位的檢測

挑取單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中，加入20 μg/mL的氯霉素。對于菌株HDB51，需要加入0.2%的阿拉伯糖誘導表達，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。以1∶100稀釋，加入到30 mL LB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)。其中HDB51加入或不加0.2%的阿拉伯糖，構建成含有SRP或缺乏SRP的菌株。

當OD值為0.5～0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導蛋白表達。同時加入終濃度為100 μmol/L生物素。培養(yǎng)3 h后，收集菌體，取出 1 mL菌液進行離心，7 000 r/min離心2 min，取上清 40 μL加入10 μL的5×loading buffer，然后用沸水煮20 min。

將獲得的樣品進行Western blot檢測，轉印的纖維膜用TBST稀釋1∶200一抗溫育1～2 h。用 TBST 在室溫脫色搖床上洗3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin室溫孵育1 h，用 TBST 在室溫脫色搖床上洗3次，每次5 min。用DAB顯色試劑盒顯色，觀察到目的條帶。

試驗中添加了不同濃度的IPTG（0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L）誘導蛋白表達。

1.5 缺失SRP對膜蛋白定位的影響

試驗采用大腸桿菌HDB51，此菌株的基因由阿拉伯糖誘導表達。在添加或不添加阿拉伯糖情況下，構成含有或缺乏Ffh的菌株，即含有SRP或缺乏SRP的菌株。在0.1 mmol/L IPTG作用下檢測膜蛋白定位。

2 結果與分析

2.1 膜蛋白定位檢測

本研究成功構建了表達生物素連接酶BirA和融合有標簽Avi-tag（15個氨基酸，GLNDIFEAQKIEWHE）的靶蛋白EspP的質粒，且都在啟動子Ptac作用下，由IPTG誘導表達。靶蛋白還融合有FLAG-tag作為內參，同時將兩個質粒，轉入野生菌MG1655。EspP是依賴SecA/B途徑的底物蛋白，其C端位于細胞質，C端融合Avi-tag，可被生物素?；妶D1。在不表達生物素連接酶BirA時，以FLAG標簽可以檢測到EspP蛋白的表達，但是沒有檢測到生物素?；腅spP。

2.2 不同濃度 IPTG對FtsQ的生物素酰化的 影響

采用不同濃度的IPTG誘導，蛋白FtsQ最終的表達量無明顯區(qū)別。但是，隨著IPTG濃度增加，FtsQ的生物素酰化水平逐步升高，見圖2，說明FtsQ的定位水平逐步降低。因此推測，高濃度的IPTG使部分FTsQ蛋白在胞內不能正確折疊，形成包涵體，從而在胞內積累，不能正確定位到膜上，造成生物素?；缴摺Ｔ囼炛羞x取的IPTG最佳濃度為0.1 mmol/L，此時FtsQ蛋白剛好能全部定位到膜上，生物素酰化水平幾乎為零。

2.3 缺失SRP對膜蛋白定位的影響

在添加或不添加阿拉伯糖情況下，構成含有或缺乏的菌株，即含有SRP或缺乏SRP的菌株，生長曲線如圖3所示，在不添加阿拉伯糖時，菌株的生長受到明顯抑制，說明大腸桿菌缺乏，蛋白的SRP轉運途徑有可能被阻斷，導致有些膜蛋白不能準確定位，可能影響細胞的功能。

在野生型菌株MG1655及添加阿拉伯糖的HDB51菌株中，沒有檢測到生物素?；腇tsQ，而在不添加阿拉伯糖的菌株HDB51，即缺乏SRP的菌株中，檢測到了明顯的條帶，蛋白FtsQ定位水平約為60%，說明SRP的缺失導致FtsQ部分蛋白不能定位。作為對照的依賴SecA/B途徑的蛋白EspP，無論是在野生型還是在缺乏SRP的菌株中定位水平基本一致，都在50%左右，見圖4，說明SRP的缺失不會對非依賴SRP途徑的底物蛋白產生影響。

3 討論

基因融合系統被廣泛應用于研究蛋白的分泌及膜蛋白的拓撲結構，例如融合堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及β-丙酰胺酶[11]。在這些研究中，采取的普遍策略是確定融合蛋白是否穿過細胞質 膜[12]。這些方法雖能夠定性檢測肽鏈是否穿過膜，但不能分辨膜突變體與野生型菌株的蛋白定位的速度變化，試驗可選取可被生物素?；慕Y構作為融合標簽，來檢測這種微妙變化[10]。若融合蛋白在穿過內膜之前，轉運速度減慢，可以檢測到明顯的蛋白生物素?；?。通過構建靈敏檢測膜蛋白定位的方法，探索SRP菌株的蛋白定位情況，已成為研究大腸桿菌中SRP功能的重要技術手段[13]。

本研究發(fā)現添加過量的IPTG時，雖然蛋白總體表達量并無明顯區(qū)別，但蛋白的定位情況受到明顯影響，推測過量的IPTG可能會對細胞產生毒性，同時使蛋白非正確折疊，不具有活性，在胞內積累，不能定位到膜上，影響試驗結果。IPTG添加量在較低濃度時，膜蛋白FtsQ幾乎全部定 位[9]。在大腸桿菌中，SRP識別并綁定核糖體正在翻譯的信號肽，當信號序列從核糖體多肽通道出口出現時，SRP立即通過疏水作用識別信號序列并結合，從而形成RNC?SRP復合物，保證翻譯轉運同步的正確進行。SRP是大腸桿菌生存所必需的，缺失SRP會對機體造成毒性，引發(fā)一系列的生理應激效應，其中很重要的是依賴SRP底物蛋白的定位錯誤或失敗[14]。本研究利用構建的膜蛋白定位方法，以FtsQ為模式蛋白，檢測出SRP具有輔助膜蛋白定位的功能，為研究此類依賴SRP膜蛋白定位提供參考依據。

[1] 黃傳中.大腸桿菌膜蛋白的亞蛋白質組學分析及其膜蛋白相關復合物研究[D].廈門：廈門大學，2007.

[2] 古鵬飛.利用重組大腸桿菌生產L-色氨酸的研究[D].濟南：山東大學，2013.

[3] 呂磊，宋國田，劉永飛，等.L-色氨酸重組高產菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J].天津農學院學報，2018，25（3）：60-64.

[4] 王誠祺.基于序列信息的膜蛋白結構、功能預測研究[D].蘭州：蘭州大學，2012.

[5] WANG C L，ZADA B，WEI G Y，et al.Metabolic engineering and synthetic biology approaches driving isoprenoid production in Escherichia coli[J].Bioresource Technology，2017，17（3）：241.

[6] 鄭靜，董惠鈞，王春霞，等.原核生物信號識別顆粒（SRP）介導蛋白識別轉運途徑的研究進展[J].微生物學報，2005，45（6）：974-977.

[7] ZHANG D，SWEREDOSKI M J，GRAHAM R L，et alNovel proteomic tools reveal essential roles of SRP and importance of proper membrane protein biogenesis[J].Mol Cell Proteomics，2012，11（2）：111.

[8] WICKSTROM D，WAGNER S，BAARS L，et alConsequences of depletion of the signal recognition particle in[J].J Biol Chem，2011，286（6）：4598-4609.

[9] SCHIBICH D，GLOGE F，POHNER I，et alGlobal profiling of SRP interaction with nascent polypeptides[J].Nature，2016，536：219-223.

[10] 崔艷艷，張士彬，謝能中，等.信號識別顆粒調控蛋白轉運系統[J].微生物學通報，2016，43（6）：1358-1365.

[11] LI Y F，RUI S.Expression and purification ofBirA biotin ligase for in vitro biotinylation[J].Protein Expression and Purification，2012，82（12）：162–167.

[12] 李菁菁.信號識別顆粒蛋白SRP68和SRP72結合組蛋白H4活性及轉錄調控功能的研究[D].上海：華東師范大學，2012.

[13] RAPOPORT T A.Protein translocation across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial plasma membranes[J].Nature，2007，450（7170）：663-669.

[14] 陳麗娥.信號肽對膜蛋白定位的影響[D].武漢：武漢理工大學，2012.

Localization ofmembrane proteins dependent on SRP

Cui Boxian1, Zhao Liuqun2, Zhao Sheng1, Yang Jiande1,CorrespondingAuthor, Liu Yanfei1, Zhang Dawei2,CorrespondingAuthor

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300380, China）

In,signal recognition particle（SRP）recognizes and binds signal peptides being translated by ribosome to guide the new peptide chain to the cell membrane.In this experiment, localization ofmembrance protein in HDB51 and MG1655 was studied by Western blot based on biotinylation for membrane proteins targeting.By comparing the presence or absence of SRP in different, the substrate protein FtsQ that depended on SRP in the strainHDB51 was localized.The location of FtsQ was significantly affected without SRP.This verifies that SRP helps membrane protein localization.It can provide references for the study of localizingmembrane proteins dependent on SRP.

; signal recognition particle; membrane protein localization; FtsQ

1008-5394（2021）03-0061-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.013

Q816

A

2019-10-22

天津市自然科學基金（16JCYBJC23500）

崔博顯（1996—），男，本科在讀，研究方向：微生物發(fā)酵。E-mail：sealmp5@qq.com。

楊建德（1969—），男，教授，博士，研究方向：預防獸醫(yī)學。E-mail：jiandeyang@126.com。

張大偉（1978—），男，研究員，博士，研究方向：微生物發(fā)酵。E-mail：zhang _dw@tib.cas.cn。

責任編輯：張愛婷