革胡子鯰干擾素α基因?qū)S氏氣單胞菌感染的應答分析

顧晨刊，王曉梅，李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，馮苗苗，陳成勛

革胡子鯰干擾素α基因?qū)S氏氣單胞菌感染的應答分析

顧晨刊，王曉梅通信作者，李轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，馮苗苗，陳成勛

（天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392）

應用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了革胡子鯰感染維氏氣單胞菌前后其脾臟、腎臟、頭腎、鰓、腸道、皮膚中干擾素α基因的表達譜。結(jié)果顯示：該基因在健康（對照組）革胡子鯰的6種組織中均有表達，但以脾臟表達量最高，顯著高于除腎臟和皮膚以外的其他組織；感染病原菌后3～96 h，該基因在上述6種組織中的時序表達模式相似，即：表達水平首先顯著上調(diào)、之后回到對照組水平，但到達峰值的時間不同；此外，在感染病原菌后的相同時間點，該基因的表達水平有組織差異性。

革胡子鯰；維氏氣單胞菌；干擾素α；基因表達；熒光定量PCR擴增

脊椎動物擁有非特異性免疫和特異性免疫系統(tǒng)，魚類作為低等的脊椎動物，在抵抗病原微生物感染時,主要依賴于非特異性免疫系統(tǒng)[1]。1957年英國科學家ISAACS和LINDENMANN利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒時發(fā)現(xiàn)一種抗病毒蛋白，將其命名為干擾素（interferon，IFN）[2]。IFN是一類具有多種功能的免疫活性糖蛋白，屬于細胞因子家族，能夠啟動非特異性免疫系統(tǒng)的抗病毒反應，在病原微生物感染時被誘導表達[3]。目前已知的IFN分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型[4]，其中Ⅰ型包括IFNα、IFNβ和IFNω等；Ⅱ型只有IFNγ一種；Ⅲ型由IFNλ1、IFNλ2和IFNλ3組成。1965年GRAVELL和MALSBERGER[5]首次發(fā)現(xiàn)魚類中存在IFN活性物質(zhì)，魚類的IFN主要是Ⅰ、Ⅱ型[6]，2003年首次在斑馬魚（）中克隆得到第一個Ⅰ型IFN基因（）[7]；隨后，2004年魚類的Ⅱ型IFN基因（）被發(fā)現(xiàn)[8]。研究顯示IFN在生物體中普遍存在，不同類型IFN的作用機理有所差異，但最終的作用效果相似，其主要的生物學作用為抗病毒和調(diào)節(jié)免疫應答[9]。

革胡子鯰（）隸屬鯰形目（Siluriformes）、胡子鯰科（Clariidae）、胡鯰屬（），該魚的生長速度快、對水質(zhì)適應性強、具有較強的抗病能力[10-11]。目前，分子水平上對革胡子鯰抗病能力的研究報道較少，因此本試驗通過腹腔注射法應用維氏氣單胞菌（）感染革胡子鯰，采用熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測分析在感染病原菌前后該魚的淋巴組織（脾臟、腎臟和頭腎）和粘膜相關(guān)的淋巴組織（鰓、腸道和皮膚）中基因的表達譜，探討該基因?qū)Σ≡腥镜膽鸱磻瑸楦锖遇T的抗病機理和免疫防御機制研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗魚和攻菌試驗

本試驗用魚及攻菌試驗與LI等[12]的研究方法相同，簡述如下：革胡子鯰（）取自天津市德仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，實驗室暫養(yǎng)10 d，挑選體重（63.84±5.91）g、體長（18.51±1.34）cm的個體用于攻菌試驗。采用腹腔注射法，感染組每尾魚注射200 μL濃度為4×108CFU/mL的維氏氣單胞菌（），對照組注射等量的0.65%的生理鹽水。

在注射后3、6、12、24、36、48、72、96 h分別取15尾魚，經(jīng)200 mg/L MS-222麻醉后解剖，分別取其脾臟、腎臟、頭腎、鰓、腸道、皮膚6種組織，液氮速凍后將其轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

應用Trizol試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取6種組織的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，分光光度法分析純度和濃度，同一時間點每3尾魚的總RNA等量混合，之后用RevertAid cDNA第一條鏈合成試劑盒（美國Thermo公司）合成cDNA第一條鏈。

1.3 引物的設(shè)計與評估

基于本實驗室獲得的革胡子鯰脾臟轉(zhuǎn)錄組文庫中注釋為基因的CDS區(qū)序列，利用NCBI在線設(shè)計擴增基因片段的引物，擴增內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）的引物序列引自LI等[12]的研究。引物經(jīng)過常規(guī)PCR和qPCR檢測與評估后，用于基因表達的qPCR分析，引物序列見表1，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 應用的引物信息

1.3.1 引物的常規(guī)PCR檢測

應用2×PCR MasterMix試劑盒（美國Quanta biotech公司）進行常規(guī)PCR擴增，擴增反應依據(jù)產(chǎn)品說明書進行。擴增體系包括：2×PCR MasterMix預混液12.5 μL、引物IFNα-F和IFNα-R（5 μmol/L）各1.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8.5 μL；循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次；72 ℃補平延伸6 min。擴增后的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.2 引物的qPCR檢測

使用iQ SYBR Green Supermix試劑盒（美國Quanta biotech公司）進行qPCR擴增，擴增反應依據(jù)產(chǎn)品說明書進行。擴增體系包括：iQ SYBR Green Supermix預混液10 μL、引物IFNα-F和IFNα-R（5 μmol/L）各0.8 μL、cDNA 1 μL、dd H2O 7.4 μL；循環(huán)擴增采用兩步法，即：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 10 s、56 ℃退火和延伸30 s，共40個循環(huán)；在擴增過程中，每個樣本均設(shè)置3個技術(shù)重復。擴增循環(huán)之后，進行熔解曲線分析（65～95 ℃），檢測引物的特異性。將脾臟的cDNA原液進行10倍倍比稀釋，獲得5個不同濃度的cDNA模板進行qPCR擴增，建立標準曲線，檢測引物的擴增效率。

1.4 IFNɑ基因表達及數(shù)據(jù)分析

qPCR擴增同1.3.2，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，采用2△CT法分析革胡子鯰的脾臟、腎臟、頭腎、鰓、腸道、皮膚6種組織中基因的相對表達量。數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，利用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，Duncan法檢驗差異顯著性，＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的評估結(jié)果

以革胡子鯰脾臟、腎臟、頭腎和鰓的cDNA為模板進行常規(guī)PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示引物IFNαF-IFNαR的擴增片段長度約為130 bp，其大小與理論值132 bp相符合，且無雜帶。

經(jīng)qPCR擴增得到的熔解曲線峰值圖顯示為單一尖銳峰（圖2-A）。倍比稀釋法得到的標準曲線顯示：擴增效率為103.8%，2值為 0.993（圖2-B）。此結(jié)果表明，所用引物具有良好的特異性和擴增效率，可用于后續(xù)樣本分析。

（A）

（B）

圖2基因片段qPCR擴增的熔解曲線峰值圖（A）和標準曲線（B）

2.2 IFNα基因表達分析

革胡子鯰脾臟、腎臟、頭腎、鰓、腸道、皮膚6種組織中基因的表達既呈現(xiàn)出組成型表達，又受維氏氣單胞菌感染的影響。

2.2.1 健康革胡子鯰6種組織基因表達

如圖3所示，健康（對照組）革胡子鯰中，脾臟的基因表達量顯著高于腸道、鰓和頭腎，但與皮膚和腎臟的表達量差異不顯著。

注：以腸道為對照，圖中字母不同表示差異顯著（＜ 0.05）；字母相同表示差異不顯著（0.05）

2.2.2 感染病原菌后革胡子鯰相同組織基因的時序表達

如圖4（A）所示，脾臟的表達量在3 h顯著上調(diào)，24 h達到最大值，且顯著高于其他時間點的表達水平，是對照組表達量的10.42倍；腎臟在6 h的表達量最高，顯著高于其他時間點，是對照組的12.97倍；頭腎在3 h表達量顯著上調(diào)并達到峰值，是對照組表達量的28.06倍。圖4（B）可以看出，腸道的表達量在3 h顯著上調(diào)且達到峰值，是對照組表達量的6.85倍，但與6 h的表達量差異不顯著；皮膚的表達量在3 h顯著上調(diào)，24 h達到最高，是對照組的2.91倍；鰓在3 h的表達量顯著高于對照組和感染組的其他時間點，為對照組的4.63倍。

（A）

（B）

圖4 感染病原菌后3～96 h革胡子鯰6種組織基因的時序表達譜

注：以注射生理鹽水組為對照，圖中字母不同為差異顯著（＜0.05）；字母相同為差異不顯著（＞0.05）

2.2.3 感染病原菌后革胡子鯰不同組織間IFNα基因的表達

以腸道的表達量為對照，如圖5所示，感染病原菌后3 h基因在頭腎的表達量最高，顯著高于除脾臟外的其余4種組織；6 h腎臟和脾臟的表達量顯著高于其余4種組織；12～36 h和72 h均以脾臟的表達量最高，顯著高于其余5種組織；48 h 6種組織間的表達水平差異不顯著；而感染96 h，又以脾臟的表達量最大，但僅顯著高于鰓和頭腎兩種組織的表達量。

（A）

（B）

圖5 感染病原菌后8個時間點革胡子鯰6種組織間基因相對表達分析

注：以腸道為對照，圖中字母不同表示差異顯著（＜0.05）；字母相同表示差異不顯著（＞0.05）

3 討論

3.1 健康革胡子鯰IFNα基因的表達分析

本研究發(fā)現(xiàn)，基因在沒有病原菌刺激的健康（對照組）革胡子鯰的6種組織中均有表達，但不同組織的表達水平有差異。肖攀[13]運用qPCR法分析健康翹嘴鱖（）的胸腺、頭腎、鰓、脾臟、肝臟、腸道、體腎、血液共8種組織中基因的表達，發(fā)現(xiàn)該基因在健康翹嘴鱖血液中的表達量最高，頭腎、脾臟次之，肝臟、胸腺、體腎和鰓的表達量較低，最低為腸道；周永澤[14]運用qPCR技術(shù)檢測出基因在健康異育銀鯽（）的肝臟、脾臟、腸道、頭腎、心臟、鰓、皮膚、腦和肌肉共9種組織中均有表達，其中在肝臟中的表達量最高，在腸道、脾臟、頭腎、肌肉和心臟中表達量適中，在腦和鰓中表達量較低，在皮膚中表達量為最低。本研究和他人的研究結(jié)果均顯示，基因在健康魚類的多種組織器官中均可表達，說明該基因在魚體內(nèi)呈組成型表達，但表達水平具有組織差異性。

3.2 革胡子鯰感染病原菌后同一組織IFNα基因的時序表達分析

本研究發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌可誘導革胡子鯰6種組織基因的上調(diào)表達，在感染病原菌后 3 h頭腎、腸道和鰓基因的表達量最高，腎臟的表達量在6 h最大，而脾臟和皮膚的表達量在24 h達到峰值。劉毅等[15]利用RT-PCR方法對經(jīng)腹腔注射福爾馬林滅活的柱狀黃桿菌（）菌苗的草魚（）的脾臟、頭腎和肝臟3種組織中Ⅰ型基因的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)感染后1～28 d，頭腎中Ⅰ型基因的表達峰值較高，脾臟次之，肝臟較低，但與對照組均無顯著差異。肖攀[13]發(fā)現(xiàn)：翹嘴鱖經(jīng)聚肌胞苷酸（Poly I：C）腹腔注射刺激后3～72 h，其胸腺、頭腎、脾臟、肝臟、腎臟和血液中（Ⅰ型）基因的表達顯著上調(diào)，其中頭腎、脾臟分別在12、48 h達到最大值，肝臟在3 h上調(diào)且達到峰值，胸腺在6 h表達量最高。周永澤[14]研究得出：異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒（cyprinid herpesvirus 2）后0～120 h，頭腎中基因的表達量在12、24和48 h顯著下降，但在120 h又顯著上升；脾臟中基因的表達量在24、48和120 h均顯著下降。本研究結(jié)果與上述他人的研究結(jié)果均說明：病原微生物或其類似物在侵染魚機體的過程中，可影響魚類多種組織器官基因表達，但不同組織基因的時序表達譜存在差異。

3.3 革胡子鯰感染病原菌后不同組織間IFNα基因表達的比較分析

感染病原菌后3 h革胡子鯰頭腎中基因的表達量最高，顯著高于除脾臟以外的其他組織；6 h腎臟的表達量為最高，其次是脾臟，兩者之間的表達差異不顯著，但均顯著高于其他組織；12～36 h以及72 h均是脾臟的表達量顯著高于其他5種組織的表達量；48 h時6種組織的表達水平差異不顯著；96 h脾臟的表達量在6種組織中再次為最高，但僅顯著高于鰓、頭腎的表達量。草魚經(jīng)poly Ⅰ：C刺激后，I型基因在其肝臟、脾臟、腎臟、腸道、鰓和心臟組織中的表達水平上調(diào)，且脾臟、腎臟和腸道中的表達水平的上調(diào)相對強[16]。解文杰等[17]分析經(jīng)腹腔注射poly Ⅰ：C的青鳉（）的脾臟、腎臟、腦、鰓、肝臟、腸道、卵巢和精巢8種組織中（Ⅰ型）基因的表達情況時發(fā)現(xiàn)，注射后6 h，該基因在脾臟中的表達量最高，其次為腎臟，腸道和鰓中的表達量較低，肝臟、腦、卵巢和精巢中幾乎檢測不到基因表達。青魚（）感染草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus）后33 h，基因的表達水平在腸道、鰓、肝臟和皮膚中升高，特別是在肝臟和皮膚中明顯升高，而脾臟中明顯下降；但感染鯉春病毒（Spring viremia of carp virus）后33 h，基因在肝臟中的表達水平明顯升高，而在脾臟、腸道和鰓中的表達水平明顯降低[18]。這些研究均說明：不同組織基因?qū)Σ≡⑸锘蚱漕愃莆锏膽饛姸扔胁町悺?/p>

總之，本研究結(jié)果表明：革胡子鯰多種組織中的基因?qū)S氏氣單胞菌感染具有應答反應，但不同組織基因?qū)υ摬≡膽鸱磻俣群蛷姸扔胁町?；此外，革胡子鯰在抵御維氏氣單胞菌侵染的過程中，多種組織器官能協(xié)同 作用。

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Response of interferon α gene toinfection in

Gu Chenkan, Wang XiaomeiCorrespondingAuthor, Li Zhuanzhuan, Feng Miaomiao, Chen Chengxun

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In this paper, real-time quantitative PCR technique was used to assess the expression profiles of interferon alpha（IFNα）gene inspleen, kidney, head kidney, gill, intestine and skin offollowing an intraperitoneal injection of.The results showed that the IFNα gene was expressed in all tissues of the healthy（control）individuals, and the highest expression was found in spleen, which was significantly higher than those in other tissues except kidney and skin.After.challenge during 3-96 h, the temporal expressions profiles of IFNα gene in the six tissues were similar, namely, transcripts were up-regulated firstly and then recovered back to the baseline, but the expression peaked at different time points.Furthermore, the expression levels of IFNα gene were different among the tissues at the same time points of post infection.

;;interferon α; gene expression; real-time quantitative PCR

1008-5394（2021）03-0056-05

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.012

S917；S965.128

A

2020-08-06

天津市應用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（重點項目）（15JCZDJC33500）

顧晨刊（1996—），女，本科在讀，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖學的學習與研究。E-mail：1035824210@qq.com。

王曉梅（1962—），女，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動物分子生物學的研究。E-mail：xiaomeiw@tjau.edu.cn。

責任編輯：張愛婷