刺槐多倍體誘導(dǎo)及葉片解剖結(jié)構(gòu)分析

張丞慧，孟冰超，楊茂磊，馬洪崢，胡寶全

刺槐多倍體誘導(dǎo)及葉片解剖結(jié)構(gòu)分析

張丞慧，孟冰超，楊茂磊，馬洪崢，胡寶全通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392）

四倍體刺槐因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、生物量大等特點(diǎn)，被廣泛推廣種植。本研究采用展開(kāi)子葉的刺槐幼苗為材料，通過(guò)5種濃度的秋水仙素處理莖尖，誘導(dǎo)刺槐四倍體，并研究誘導(dǎo)后四倍體葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化。研究發(fā)現(xiàn)0.05%的秋水仙素處理幼苗1 d能取得較好的誘導(dǎo)效果。四倍體刺槐的葉片解剖結(jié)構(gòu)中，上表皮厚度、柵欄組織、海綿組織和葉片厚度等都顯著高于二倍體，四倍體葉片緊實(shí)度顯著提高，表明刺槐四倍體化后有較強(qiáng)的抗逆性。研究結(jié)果可為刺槐多倍體育種提供可靠的技術(shù)支持，并為刺槐的倍性育種工作提供參考和理論支持，同時(shí)為闡述四倍體刺槐抗逆性形成原理提供形態(tài)解剖學(xué)依據(jù)。

刺槐；四倍體；秋水仙素；葉片；解剖結(jié)構(gòu)

多倍體化是植物界的一種普遍現(xiàn)象，廣泛存在于被子植物中，是植物進(jìn)化和新物種形成的重要途徑。因多倍體植物普遍具有營(yíng)養(yǎng)器官巨大、抗逆性高和生活力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，被作為一種重要的育種途徑而廣泛使用。秋水仙素是從百合科植物秋水仙中提取出的一種能抑制紡錘絲的化學(xué)誘變劑，被廣泛用于植物多倍體的人工誘導(dǎo)中，常見(jiàn)的誘導(dǎo)方法包括浸漬法、噴涂法、注射法和培養(yǎng)基誘導(dǎo)法等。

刺槐是蝶形花科二倍體植物，適應(yīng)性、耐鹽性強(qiáng)[1]，用途廣泛，是重要的生態(tài)防護(hù)樹(shù)種。四倍體刺槐最早由韓國(guó)誘導(dǎo)成功，具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[2]。引入我國(guó)的四倍體刺槐，作為用材樹(shù)種其木質(zhì)堅(jiān)韌細(xì)致，作為青飼料來(lái)源其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被廣泛引種到我國(guó)北部地 區(qū)[3]。前人對(duì)四倍體刺槐的栽培、組織培養(yǎng)和生理生化特性進(jìn)行了大量研究，但四倍體刺槐的種質(zhì)創(chuàng)新工作進(jìn)展仍為緩慢[2]。

研究人員通過(guò)對(duì)刺槐人工誘導(dǎo)，獲得了新的四倍體刺槐種質(zhì)資源，如羅曉丹以刺槐愈傷組織和刺槐種子為材料，結(jié)合秋水仙堿浸漬法與低溫處理法，誘導(dǎo)得到刺槐四倍體，其中60mg/L的秋水仙素浸漬法處理刺槐種子2 d后誘導(dǎo)率最高，達(dá)25.71%[4]。姜丹使用0.3%的秋水仙素浸泡刺槐初露白尖的種子3 d后獲得誘導(dǎo)四倍體[5]。馮玥等通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)檢測(cè)穩(wěn)定性，認(rèn)為0.4%的秋水仙素浸漬處理刺槐種子2d，誘導(dǎo)多倍體效率最高[6]。刺槐多倍體的誘導(dǎo)雖然取得了一些進(jìn)展，但組培繁瑣耗時(shí)，且以往的研究缺乏對(duì)獲得的四倍體刺槐的解剖特征的進(jìn)一步分析，而葉片特征的變化能夠更直接反映植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，其抗逆性的強(qiáng)弱可從解剖結(jié)構(gòu)的變化中分析得出。

本試驗(yàn)采用改進(jìn)的方法誘導(dǎo)刺槐四倍體，并對(duì)誘導(dǎo)后的刺槐四倍體的葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探究四倍體化對(duì)刺槐葉片結(jié)構(gòu)的影響，以期為探索四倍體刺槐優(yōu)勢(shì)的形成提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以剛展開(kāi)子葉的刺槐幼苗為材料，種子采自天津農(nóng)學(xué)院校園經(jīng)鑒定為二倍體的成年刺槐。刺槐種子經(jīng)60℃溫水浸種，自然冷卻到室溫后浸泡過(guò)夜，置于培養(yǎng)皿中覆蓋紙巾，于22 ℃溫箱中催芽，保持濕潤(rùn)，待種子展開(kāi)子葉未抽真葉時(shí)進(jìn)行處理。

1.2 四倍體刺槐誘導(dǎo)

以5種不同濃度的秋水仙素（0.40 %、0.20 %、0.10 %、0.05%、0.01%）溶液，22 ℃下浸泡刺槐幼苗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)24h，蒸餾水清洗后，種植于基質(zhì)（草碳∶蛭石∶珍珠巖＝1∶1∶1）中培養(yǎng)，每個(gè)處理梯度20～25株，對(duì)照5株，重復(fù)3次。

1.3 染色體鑒定

取莖尖于飽和對(duì)二氯苯溶液中，20℃浸泡 3h，取出莖尖經(jīng)蒸餾水清洗后，固定于卡諾固定液中，固定24h后取出，蒸餾水清洗3次，于1mol/L鹽酸中55 ℃酸解10min，蒸餾水清洗3次后，置于卡寶品紅溶液中染色1h。取染色后的莖尖分生區(qū)組織，于載玻片上經(jīng)蓋玻片壓片后，顯微鏡鏡檢，選取5個(gè)視野對(duì)染色體計(jì)數(shù)。

1.4 氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞測(cè)量

撕取刺槐葉片表皮于載玻片上，于顯微鏡下測(cè)量氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)寬，每個(gè)植株選取5片葉片，選取5個(gè)視野，每個(gè)視野下統(tǒng)計(jì)5個(gè)氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)寬，未處理植株作為對(duì)照，數(shù)據(jù)使用SPSS19.0，采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.5 葉片及莖的解剖結(jié)構(gòu)觀察

每株刺槐取健康葉片，以主脈為對(duì)稱(chēng)軸，切成寬度為5mm的小段，于FAA固定液中處理24h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，于LeicaRM2235切片機(jī)上切片，番紅固綠染色，中性樹(shù)膠封片，LeicaDM4000B顯微鏡觀察，LAS4.2軟件測(cè)量，每株葉片樣本分別測(cè)量10次。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對(duì)刺槐幼苗的抑制作用

不同濃度秋水仙素處理刺槐幼苗后，存活幼苗見(jiàn)表1，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度越高，植株死亡率越高，0.40%秋水仙素處理幼苗存活率僅為8.3%，0.01%處理存活率為60.0%，明顯觀察到秋水仙素對(duì)刺槐幼苗的抑制作用，且抑制程度與秋水仙素濃度成正比。

表1 秋水仙素處理結(jié)果 %

2.2 刺槐多倍體誘導(dǎo)結(jié)果

通過(guò)刺槐對(duì)照株與變異株的觀察，變異植株，葉片明顯增大，發(fā)現(xiàn)同一生長(zhǎng)階段的變異株葉片氣孔長(zhǎng)度、寬度，保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度、寬度與對(duì)照株相比差異均達(dá)到極顯著水平，且變異株葉片氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度相較于對(duì)照株大一倍左右（表2）。對(duì)照株和變異株刺槐分別統(tǒng)計(jì)10個(gè)分裂中期細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照株染色體數(shù)為2＝22，變異株的染色體數(shù)為4＝44。通過(guò)氣孔分析結(jié)果和染色體計(jì)數(shù)，確定變異株為四倍體（圖1）。

統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)成功的刺槐發(fā)現(xiàn)，0.05%和0.01%的秋水仙素處理刺槐幼苗，成功率為30.7%和29.3%，但0.01%誘導(dǎo)后，植株存活率高，0.05%處理組誘導(dǎo)成功的占存活刺槐的75.9%且存活率較高，因此浸泡法誘導(dǎo)刺槐幼苗多倍體的最佳秋水仙素濃度為0.05%。

表2 刺槐對(duì)照株與變異株氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞大小比較μm

注：***表示在＜0.001水平上差異顯著

注：A為四倍體刺槐；B為對(duì)照二倍體

2.3 葉片解剖結(jié)構(gòu)比較

對(duì)二倍體刺槐和四倍體刺槐的葉片解剖結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)（表3），四倍體刺槐除下表皮厚度與二倍體植株差異不顯著外，上表皮厚度、柵欄組織、海綿組織、葉肉厚度、葉片厚度、維管束面積和最大導(dǎo)管面積均顯著高于對(duì)照二倍體（＜0.05），其中柵欄組織、葉肉厚度、葉片厚度和維管束面積達(dá)到極顯著水平（＜0.001）。內(nèi)含大量葉綠體的柵欄組織變厚，表明四倍體刺槐可能含有更多的葉綠體，提高了單位面積葉片的光合作用效率，積累生物量的速度加快。而四倍體刺槐葉片維管束面積的極顯著增加，則表明四倍體刺槐在水分和無(wú)機(jī)鹽的運(yùn)輸上可能比二倍體效率 更高。

表3 不同倍性刺槐葉片細(xì)胞指標(biāo)差異分析 μm

注：＜0.05、＜0.01和＜0.001分別表示為*、**、***。下同

進(jìn)一步比較葉片組織結(jié)構(gòu)的緊密度、結(jié)構(gòu)疏松度和上下表皮相對(duì)厚度（圖2），結(jié)果表明，四倍體刺槐只有葉片緊密度顯著高于二倍體，其他3個(gè)指標(biāo)均差異不顯著（表4）。這表明四倍體葉片變厚的過(guò)程中，組織變得緊密，這種緊密的組織排列可能是多倍體抗逆性提高的體現(xiàn)。

注：A為對(duì)照二倍體；B為四倍體刺槐

表4 不同倍性刺槐葉片細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)差異分析 %

3 討論

倍性育種是林木遺傳育種工作中一種重要的種植創(chuàng)新手段，如通過(guò)多倍體誘導(dǎo)結(jié)合雜交育種，我國(guó)選育出了速生優(yōu)質(zhì)三倍體毛白楊。在多倍體誘導(dǎo)中，秋水仙素作為最有效的細(xì)胞有絲分裂阻斷劑，被廣泛用于林木多倍體的誘導(dǎo)。但秋水仙素處理植物材料，本身對(duì)植物存在毒害作用，處理后造成幼苗生長(zhǎng)緩慢、器官畸形等問(wèn)題[7]，甚至發(fā)育停止并死亡。因此在林木多倍體的誘導(dǎo)中，選取適宜的秋水仙素的濃度和處理時(shí)間，成為影響多倍體誘導(dǎo)效果的重要因素。本試驗(yàn)獲取四倍體刺槐的過(guò)程中，觀測(cè)到經(jīng)過(guò)秋水仙素處理后的部分幼苗中，存在明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，且抑制作用和致死率與秋水仙素的濃度呈正相關(guān)。

以往研究中，對(duì)刺槐多倍體的誘導(dǎo)多采用組織培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加秋水仙素誘導(dǎo)四倍體[3]，步驟繁瑣耗時(shí)。而由于刺槐易萌發(fā)，浸泡種子誘導(dǎo)操作簡(jiǎn)便，是研究人員誘導(dǎo)刺槐四倍體的主要方式[5-6]。但以往誘導(dǎo)種子的時(shí)期均為種子初露白時(shí)，進(jìn)行秋水仙素浸泡處理，需要秋水仙素的濃度高，需要0.3%或0.4%的秋水仙素處理2～3 d才能取得較好的誘導(dǎo)效果[5-6]。本試驗(yàn)采用初展開(kāi)子葉的刺槐為處理材料，秋水仙素的處理濃度和時(shí)間明顯減少，0.05%處理1 d即可較好的獲得加倍的刺槐，提高了誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單且時(shí)間短。造成這種現(xiàn)象的原因，可能與種子種皮對(duì)秋水仙素滲透速度的影響有關(guān)，去掉種皮的初萌動(dòng)種子或子葉展開(kāi)的幼苗，秋水仙素更容易滲透到分生組織。

植物葉片是對(duì)環(huán)境變化最敏感的器官[8]，對(duì)植物葉片的解剖結(jié)構(gòu)分析可反映植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。植物多倍化能引起植物的葉片厚度等方面發(fā)生明顯變化[9-10]。這與本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，刺槐四倍體化后，上表皮厚度、柵欄組織、海綿組織和葉片厚度等都顯著高于二倍體，這表明四倍體刺槐葉片的結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，刺槐四倍體的緊實(shí)度顯著高于二倍體，而疏松度、上表皮相對(duì)厚度和下表皮相對(duì)厚度都變化不顯著，這說(shuō)明刺槐四倍體葉片器官巨大化過(guò)程中基本是同比例變化。這種變化也可能與基因組加倍后的復(fù)雜性和個(gè)體差異有關(guān)。有研究認(rèn)為多倍化不一定導(dǎo)致所有植物葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)發(fā)生顯著變化[11]，如楊桂英等對(duì)不同倍性的山茶葉片解剖結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，六倍體山茶葉片厚度和海綿組織厚度與二倍體比較變化不顯著[12]。邱芬等分析多倍體化滇楊發(fā)現(xiàn)個(gè)別多倍體材料葉片緊實(shí)度和上表皮相關(guān)對(duì)厚度等指標(biāo)并不顯著高于二倍體[11]，說(shuō)明多倍化對(duì)葉片的巨大化受個(gè)體本身基因組差異的影響，多倍體誘導(dǎo)育種過(guò)程需要進(jìn)行較細(xì)致的性狀測(cè)定比較。

植物的葉片長(zhǎng)期與環(huán)境接觸，環(huán)境脅迫的壓力會(huì)影響葉片的解剖結(jié)構(gòu)，因此，研究葉片的解剖結(jié)構(gòu)可以反映其抗逆性的強(qiáng)弱[13]。如不同倍性的滇山茶的上下表皮厚度可作為評(píng)價(jià)耐寒性的指標(biāo)[14]。而四倍體刺槐的柵欄組織極顯著高與二倍體，強(qiáng)化的柵欄組織被認(rèn)為可提高葉片的緊實(shí)程度，試驗(yàn)中也檢測(cè)到四倍體刺槐葉片的緊實(shí)度顯著高于二倍體。這種緊密的葉片結(jié)構(gòu)在低溫環(huán)境下為葉片提供更好的防護(hù)[15]。因此，分析認(rèn)為，四倍體刺槐的抗逆性應(yīng)強(qiáng)于二倍體，尤其在抗寒性等方面優(yōu)于二倍體。本研究獲得的刺槐四倍體加倍成功的是地上部分，要獲得完整的四倍體尚需經(jīng)過(guò)扦插生根過(guò)程。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用展開(kāi)子葉的刺槐幼苗為材料，通過(guò)不同濃度秋水仙素的處理，誘導(dǎo)刺槐四倍體，并研究誘導(dǎo)后四倍體葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)0.05%的秋水仙素處理幼苗1 d能取得較好的誘導(dǎo)效果，四倍體刺槐的葉片解剖結(jié)構(gòu)，上表皮厚度、柵欄組織、海綿組織和葉片厚度等都顯著高于二倍體，四倍體葉片緊實(shí)度顯著提高，表明其有較強(qiáng)的抗逆性。結(jié)果可為刺槐的倍性育種工作提供參考和理論支持。

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Induction of polyploidL.and analysis of anatomical structure of leaves

Zhang Chenghui, Meng Binchao, Yang Maolei, Ma Hongzheng, Hu BaoquanCorresponding Author

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

TetraploidL. has been widely planted because of its strong adaptability and large biomass. In this study, the seedlings ofwere treated with 5 different concentrations colchicine to induce tetraploid, and the changes of the anatomical structure of the tetraploid leaves after induction were studied. It was found that 0.05% colchicine could achieve better induction effect in one day. The thickness of the upper epidermis, the palisade tissue, sponge tissue and leaf thickness of the tetraploidleaves were significantly higher than those of diploid, and the cell tense ratio of tetraploid ones were significantly improved, which indicated thathad strong resistance to stress after tetraploidization. The results can provide reliable technical support for the polyploid breeding of,provide reference and theoretical support for the ploidy breeding of,and provide morphological and anatomical basis for explaining the formation principle of the resistance of tetraploid.

L.; tetraploid; colchicine; leaves; anatomical structure

1008-5394（2021）03-0018-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.004

Q944.52；S722.3

A

2020-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（3180011064）；天津市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810061251）

張丞慧（1998—），男，本科在讀，主要從事林木倍性育種方面的研究。E-mail：18149296066@126.com。

胡寶全（1982—），男，助理研究員，博士，主要從事林木遺傳育種方面的研究。E-mail：baoquan-hu@126.com。

責(zé)任編輯：楊霞