以大黃制劑為例的一測(cè)多評(píng)法應(yīng)用研究

潘海娟，林 玲，謝學(xué)建，高 茗

0 引 言

一測(cè)多評(píng)(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)，是通過測(cè)定一個(gè)成分(對(duì)照品容易得到者)實(shí)現(xiàn)多成分(對(duì)照品難以得到或不穩(wěn)定者)同步定量的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[1-2]。該方法2006年提出，至今已有近 15 年時(shí)間，經(jīng)過眾多研究者的共同努力，QAMS已然成為了適合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式[3-5]。同時(shí)其應(yīng)用范圍已不再局限于中藥飲片、成方制劑等的質(zhì)量評(píng)價(jià)，在炮制工藝優(yōu)化、制劑過程考察和一致性評(píng)價(jià)等方面也有應(yīng)用研究[6-7]。我院藥劑科依托醫(yī)院全軍腎臟病研究中心，多品種、多劑型的大黃制劑是科室的一大特色。保腎片、新保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊是我科產(chǎn)值較高的4個(gè)大黃制劑，主要成分均為大黃提取物。本研究通過探討含大黃的成方制劑新保腎片中相同待測(cè)成分的定量分析，建立內(nèi)參物與待測(cè)成分之間的相對(duì)校正因子(f) 并將結(jié)果應(yīng)用于組成成分相似制劑(保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊)的質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)于拓展 QAMS 在科研和生產(chǎn)實(shí)踐中減少重復(fù)勞動(dòng)等的應(yīng)用具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測(cè)器；電子分析天平(FA1204B，上海精密科學(xué)有限公司)；美國(guó)Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器Prominence SIL-20A，二極管陣列檢測(cè)器waters2998和柱溫箱CTO-20A，Empower色譜工作站；萬分之一電子天平(FA1204B，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；百萬分之一電子天平;超聲波清洗機(jī)(AS20500A，Auto Science)。Kromasil 100-5 C18色譜柱：(4.6×250 mm；5 μm)；Agilent TC-18；Accurasil C18；Diamonsil C18；Luna 5μ ODS-2 C18。

1.2 材料蘆薈大黃素(批號(hào)110795-201007)、大黃素甲醚(批號(hào)110758-201013)、大黃酚(批號(hào)110796-201319)、大黃素(批號(hào)110795-201007)、大黃酸(批號(hào)110757-200206)，以上對(duì)照品均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用。上述對(duì)照品經(jīng)面積歸一化法測(cè)定，純度均〉98%。甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)、乙腈(美國(guó)Tedia試劑公司)為色譜醇，水為超純水，95 %醫(yī)用乙醇、磷酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。新保腎片樣品批號(hào)分別為YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811；保腎片YP1-0302、YP2-0320、YP3-0409、YP4-0427、YP5-0521、YP6-0826、YP7-0920、YP8-1015、YP9-1122、YP10-0126；炎黃保腎膠囊YP1-0408、YP2-0505、YP3-0714、YP4-0906、YP5-1012、YP6-1117、YP7-1215；均由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供。

2 結(jié) 果

2.1 色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1 %磷酸水溶液(B)，等度洗脫(0～80 min，A∶B=70∶30)，體積流量1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取各對(duì)照品，加甲醇溶解制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品濃度分別為24.46、33.80、33.60、65.64和106.28 μg/mL的混合對(duì)照品溶液1#備用。再分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液2#～10#，備用。

2.3 供試品溶液的制備取重量差異項(xiàng)下的新保腎片20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，過四號(hào)篩，精密稱取細(xì)粉約0.3 g，置平底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，14 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。 供試品與混合對(duì)照品HPLC圖譜見圖1。

1：蘆 薈大黃素；2：大黃酸；3：大黃素；4：大黃酚；5：大黃素甲醚a(bǔ):供試品;b:混合對(duì)照品圖1 供試品與混合對(duì)照品色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下10個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，得到各成分的回歸方程及線性范圍。見表1。

表1 5種大黃游離蒽醌的回歸方程和線性范圍

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一份對(duì)照品(編號(hào)：6#)溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.11%、0.95%、1.03%、1.29%和1.88%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批新保腎片(樣品編號(hào)：YP2-0311)按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算得到各成分含量RSD分別為0.91%、2.277%、2.03%、1.16%、0.94%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同份新保腎片(樣品編號(hào)：YP2-0311)，室溫放置，分別在0、2、4、6、10、12 h時(shí)取樣按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算各成分峰面積，RSD分別為2.64%、2.57%、2.95%、2.78%和2.62%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)取同一批新保腎片(樣品編號(hào)：YP2-0311)按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計(jì)算得到各成分含量RSD分別為0.91%、2.277%、2.03%、1.16 %、0.94%，表明該方法的重復(fù)性良好。

取己知含量的新保腎片制劑樣品(樣品編號(hào)：YP2-0311)，相當(dāng)于蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別為0.335、0.798、0.456、1.407、1.007mg)的粉末0.3 g，精密稱定9份分成3組，各組分別按樣品含量分別加入80%、100%、120%的對(duì)照品，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定5種成分的峰面積，并計(jì)算加樣回收率和RSD。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚加樣回收率分別為102.39%、100.71%、102.31%、102.69%、100.89%，RSD分別為1.39%、2.06%、1.66%、0.94%、2.58%。

2.5 相對(duì)校正因子的確定校正因子的計(jì)算按線性關(guān)系考察項(xiàng)下的試驗(yàn)方法，f=fi/fs=(Ai/Wi)/(As/Ws) ，Ai 為待測(cè)成分的峰面積，Wi 為待測(cè)成分的質(zhì)量；As為內(nèi)參物 s 的峰面積，Ws 為內(nèi)參物 s 的質(zhì)量。取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣體積為 1、2、5、8、10、12、14、16、18、20 μL ，計(jì)算以大黃素為內(nèi)參物時(shí)，5種大黃游離蒽醌間的f值，分別為f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.87、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.39。

2.6 相對(duì)校正因子的耐用性評(píng)價(jià)

2.6.1 不同色譜柱系統(tǒng)對(duì)f的影響采用Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別考察了Agilent1100和Waters e2695共2種不同的高效液相色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果顯示蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚的相對(duì)校正因子的RSD分別為2.28%、1.03%、1.57%和4.29%。

2.6.2 不同柱溫對(duì)f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別在30 ℃、35 ℃和40 ℃對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚相對(duì)校正因子進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示相對(duì)校正因子的RSD分別為1.49%、1.53%、0.23%、3.19%，表明柱溫對(duì)相對(duì)校正因子無顯著性影響。

2.6.3 不同流速對(duì)f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別在不同流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)下對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚相對(duì)校正因子進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示相對(duì)校正因子RSD分別為0.74%、0.88%、0.88%、3.26%，表明流速對(duì)相對(duì)校正因子無顯著性影響。

2.6.4 不同修飾劑對(duì)f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別考察流動(dòng)相中不容修飾劑對(duì)5種蒽醌間相對(duì)校正因子進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示相對(duì)校正因子無顯著性影響，RSD<5%。綜合不同系統(tǒng)、不同色譜柱、不同柱溫、不同流速度、不同修飾劑對(duì)相對(duì)校正因子的影響，最終取所有相對(duì)校正因子的平均值為f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.88、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.25。

2.7 待測(cè)成分的色譜峰定位待測(cè)成分色譜峰的定位通常采用相對(duì)保留值法或保留時(shí)間差法輔以待測(cè)成分的紫外吸收特征，一般即能對(duì)色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。相對(duì)保留值即待測(cè)成分i與內(nèi)參物s間的保留時(shí)間的比值，計(jì)算公式：ri/s=tRi/tRs；保留時(shí)間差即待測(cè)成分i與內(nèi)參物s間保留時(shí)間的差值，計(jì)算公式：△tRi/s=tRi-tRs；實(shí)驗(yàn)中分別考察了復(fù)方蒽醌類成分間的相對(duì)保留值和保留時(shí)間差在不同品牌儀器和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，保留時(shí)間差的波動(dòng)較為明顯，相對(duì)保留值的波動(dòng)較小，因此采用相對(duì)保留值法進(jìn)行新保腎片復(fù)方中蒽醌類待測(cè)成分色譜峰的定位較為可行。最終確定5種復(fù)方制劑蒽醌間的相對(duì)保留值分別為r蘆薈大黃素/大黃素=0.36、r大黃酸/大黃素=0.52、r大黃酚/大黃素=1.36、r大黃素甲醚/大黃素=2.13。

2.8 QAMS和外標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較首先采用外標(biāo)法(ESM)對(duì)10批新保腎片(批號(hào)分別為YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811)樣品中的5種蒽醌類成分進(jìn)行多成分同步測(cè)定，再用建立的QAMS法對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定位并計(jì)算含量，最后將2種方法得到的結(jié)果以相對(duì)誤差進(jìn)行評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證QAMS技術(shù)用于新保腎片中蒽醌類多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，2種方法所得結(jié)果無顯著性差異，相對(duì)誤差<5%，表明建立的新保腎片QAMS質(zhì)量評(píng)價(jià)模式具有較好的準(zhǔn)確性與可行性。見表2。

表2 QAMS和ESM測(cè)得新保腎片中5種蒽醌類成分的含量結(jié)果(n=2，mg/g)

2.9 QAMS數(shù)據(jù)在類似制劑中的應(yīng)用將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.88、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.25應(yīng)用到我科保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊的含量測(cè)定中，比較在不同制劑、不同劑型中ESM和QAMS的測(cè)定結(jié)果，結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系應(yīng)用于我院的保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊時(shí)方法所得結(jié)果無顯著性差異，相對(duì)誤差<5 %，表明在主要組成均為大黃提取物的制劑中，即便是不同的劑型，所建立的QAMS質(zhì)量評(píng)價(jià)模式也可以用于不同制劑的質(zhì)量控制。見表3-表5。

表3 QAMS和ESM測(cè)得保腎片中5種蒽醌類成分的定位結(jié)果 (n=2，mg/g)

表4 QAMS和ESM測(cè)得炎黃保腎膠囊中5種蒽醌類成分的定位結(jié)果(n=2，mg/g)

表5 QAMS和ESM測(cè)得炎黃保腎膠囊中5種蒽醌類成分的定位結(jié)果(n=2，mg/g)

3 討 論

QAMS經(jīng)過多年的發(fā)展與實(shí)踐，在中藥材，飲片和提取物質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用已被行業(yè)普遍接受，但應(yīng)用于中成藥仍處于探索和研究階段。建立了QAMS檢測(cè)方法在實(shí)際生產(chǎn)檢測(cè)中操作較EMS方法更加簡(jiǎn)便、快速[8-10]。本研究選擇了主要組成相似，但劑型不同的四個(gè)制劑，以新保腎片為主要研究對(duì)象，建立的QAMS評(píng)價(jià)模式應(yīng)用于保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊，結(jié)果表明ESM與QAMS數(shù)據(jù)無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)在相同色譜條件下待測(cè)成分分離度良好并且無干擾情況下，經(jīng)過系統(tǒng)驗(yàn)證的藥材中目標(biāo)成分的fs 可以直接應(yīng)用于制劑對(duì)應(yīng)成分含量計(jì)算，無需重新進(jìn)行fs 的建立和耐用性考察，可以節(jié)省大量的研究時(shí)間和分析成本[11-12]。研究為大黃制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供數(shù)據(jù)支撐的同時(shí)，并為拓展一測(cè)多評(píng)法在中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制中的應(yīng)用，為組成類似的系列制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了新的研究思路和方法參考[13-15]。