人臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)中的應(yīng)用與進(jìn)展

龐永華綜述，陳偉南審校

0 引 言

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA)是一種常見的慢性關(guān)節(jié)退行性疾病，膝關(guān)節(jié)發(fā)病率最高，主要影響65歲以上的老年人，據(jù)聯(lián)合國估計(jì)，2050年全世界將有1.3億人受OA的影響，其中4000萬人將因該病嚴(yán)重致殘[1-2]。關(guān)節(jié)軟骨的表層分解、磨損以及骨摩擦，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退化，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和僵硬，甚至致殘，給患者帶來了巨大的痛苦[3]。目前，早期膝關(guān)節(jié)OA的治療主要是保守治療，包括減肥、理療、鍛煉、口服非甾體抗炎藥物，效果不佳時也可采取膝關(guān)節(jié)腔注射療法，如關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇、透明質(zhì)酸衍生物和其他生物活性物質(zhì)等；當(dāng)上述治療均無效時，最后選擇手術(shù)干預(yù)，如截骨、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等[4-6]。

從生物學(xué)的角度來看，OA軟骨缺損的治療在臨床上極具挑戰(zhàn)性，因?yàn)檐浌羌?xì)胞天然再生潛力有限，尤其是隨著年齡的增長[7]。因此，針對軟骨進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)研究成為OA治療的新趨勢。目前有許多用于軟骨修復(fù)的治療方法，如微骨折、自體骨軟骨移植、自體軟骨細(xì)胞植入(autologous chondrocyte implantation，ACI)等，然而，這些技術(shù)在治療上都有著各種限制，如缺乏再生透明軟骨的潛力，與自身軟骨組織的整合不規(guī)則，軟骨細(xì)胞來源有限，且可能引起正常軟骨病變等，都不能夠令患者達(dá)到滿意的效果[4,8]。

近年來，以間充質(zhì)干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療因其良好的自我更新和再生能力，為再生和重建醫(yī)學(xué)提供了巨大的前景[9]。間充質(zhì)干細(xì)胞主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等[9]。最近在人臍帶組織中發(fā)現(xiàn)了人臍帶Wharton膠間充質(zhì)干細(xì)胞(Wharton’s jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs，以下簡稱“WJ-MSCs”)，相關(guān)研究表明其在臨床再生工程及早期干預(yù)膝關(guān)節(jié)OA的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，故本文對WJ-MSCs的特點(diǎn)及在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)中的相關(guān)應(yīng)用作一綜述，以期未來臨床上為膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)提供一種新的臨床路徑。

1 WJ-MSCs的生物學(xué)優(yōu)勢

1.1 來源及作用Thomas Wharton于1656年首次觀察到Wharton’s jelly(Wharton膠)，Wharton膠是臍帶的原始黏液結(jié)締組織，位于羊膜上皮和臍帶血管之間，這種膠狀物質(zhì)由蛋白多糖和各種膠原亞型組成，其主要作用是隔離、保護(hù)臍帶，防止臍帶血管的壓縮、扭轉(zhuǎn)和彎曲，從而提供氧氣、葡萄糖和氨基酸的雙向流動平臺，同時也消耗胎兒和胎盤的二氧化碳和其他廢物[11]。1991年，McElreavey等[12]首次從臍帶Wharton膠部分中分離出MSCs。

1.2 形態(tài)特征MSCs的典型特征是塑性粘附。Ranjbaran等[13]在倒置相差顯微鏡下可見紡錘形的MSCs和成纖維細(xì)胞，WJ-MSCs呈現(xiàn)為均勻的單層貼壁梭形細(xì)胞；并發(fā)現(xiàn)在原代傳代中，細(xì)胞以梭狀成纖維細(xì)胞的形式迅速增殖，當(dāng)傳代培養(yǎng)至第七代之后細(xì)胞特征發(fā)生了明顯改變，故WJ-MSCs培養(yǎng)至第七代之前均較適合于臨床應(yīng)用。

1.3 細(xì)胞表面標(biāo)記Karahuseinoglu等[14]研究表明，WJ-MSCs表面不僅表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)記，如CD44、CD13、CD29、CD105；還表達(dá)CD10、CD73、CD49、CD166、CD90和CD146；同時不表達(dá)CD14和CD34,此外還表達(dá)與移植免疫排斥反應(yīng)相關(guān)的表面標(biāo)記，如CD86、CD80和CD40。Ramanathan等[15]研究同樣發(fā)現(xiàn)，WJ-MSCs的表面標(biāo)志物CD90、CD73、CD105陽性,造血標(biāo)志物CD14、CD34和CD45陰性。且WJ-MSCs不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞抗原CD31，與BM-MSCs表型一致，表明WJ-MSCs可能具有與BM-MSCs相似的功能[16]。在WJ-MSCs中SH2、CD106和HLA-1的表達(dá)均低于BM-MSCs，這表明WJ-MSCs可能是一個更原始的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，具有更強(qiáng)的定向分化能力[17]。

1.4 免疫原性干細(xì)胞治療的一個重要要求是低免疫原性。WJ-MSCs的治療效用與其免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，WJ-MSCs具有免疫抑制和免疫回避的能力，是同種異體移植細(xì)胞治療的最佳選擇之一。WJ-MSCs不僅表面顯示出人I類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的較低表達(dá)和HLA-DR的缺失[18]；且可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增，有助于抑制機(jī)體對抗原的免疫反應(yīng)[19]；還有研究發(fā)現(xiàn)WJ-MSCs不引起異體T細(xì)胞產(chǎn)生體外免疫應(yīng)答，表明WJ-MSCs具有特異性低免疫原性，在異體移植中可耐受[19]。WJ-MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用涉及免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞介導(dǎo)成分和體液成分；然而，WJ-MSCs對B細(xì)胞的影響還未得到很好的研究，需要進(jìn)一步驗(yàn)證[21]。

1.5 分泌特性WJ-MSCs還具有旁分泌功能，可分泌多種生物活性分子，作為細(xì)胞間重要的信號傳遞物質(zhì)，參與WJ-MSCs介導(dǎo)的損傷修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)。如MSCs分泌的生長因子、趨化因子和細(xì)胞因子，可通過細(xì)胞膜、囊泡和粘附分子遷移到受損組織發(fā)揮其組織修復(fù)功能[22]。WJ-MSCs分泌的可溶性分子，如肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)，前列腺素E2，TGF-β1和吲哚胺23-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)可能介導(dǎo)MSCs對T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[23]。越來越多的證據(jù)表明，WJ-MSCs療效的機(jī)制主要取決于細(xì)胞分泌物，而不是早期的細(xì)胞替換和分化[22]。

2 WJ-MSCs在應(yīng)用中的優(yōu)勢

2.1 可行性大部分干細(xì)胞的收集(如BM-MSCs)都需要侵入性操作，且大規(guī)模提取比較困難。但WJ-MSCs的收集則是一種無創(chuàng)操作，較易進(jìn)行；而且臍帶屬于胚胎外組織，目前大多數(shù)醫(yī)院將臍帶作為醫(yī)療廢物處理，提取WJ-MSCs不涉及倫理問題。因此，WJ-MSCs來源豐富，易于收集，對供體無不良影響[24]。

2.2 保存WJ-MSCs具有良好的凍融性能，可長期冷凍在液氮杜瓦瓶中，需要時解凍即可。該特性便于WJ-MSCs的基本實(shí)驗(yàn)工作，為今后建立“臨床資源庫”提供了良好的理論依據(jù)[25]。

2.3 低免疫原性WJ-MSCs表面共刺激分子CD86和CD40數(shù)量少，缺乏HLA-DR和CD80，表明其具有較低的免疫原性表型；另外，WJ-MSCs還表達(dá)一些具有免疫調(diào)節(jié)功能的分子，如IDO-1、IL-10、LIF、PD-L1、COX-2、TGF-β1、TSG-6、CD200、HGF、非經(jīng)典HLA1類分子HLA-E和HLA-G以及HO-1，這種抑制分子的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了WJ-MSCs的低免疫原性特征[26]。

2.4 增殖與分化潛能BM-MSCs是組織工程中最常用的細(xì)胞來源，與BM-MSCs相比，WJ-MSCs具有更強(qiáng)的增殖能力，特別是在培養(yǎng)7天后，后者出現(xiàn)累積群體倍增的顯著差異；且BM-MSCs在達(dá)到100%表面匯合后便停止增殖，WJ-MSCs則未出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象[27]。Reppel等[28]在不添加生長因子的情況下，在三維支架上培養(yǎng)WJ-MSCs，并在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上評價其軟骨分化能力，并將其結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)BM-MSCs進(jìn)行了比較；發(fā)現(xiàn)經(jīng)過28天的支架培養(yǎng)后，WJ-MSCs軟骨特異性標(biāo)記在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)明顯上調(diào)，表明WJ-MSCs在軟骨分化能力方面優(yōu)于骨髓等其他來源的干細(xì)胞。

3 目前世界范圍內(nèi)使用WJMSCs治療骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展

近年來，關(guān)于如何運(yùn)用WJ-MSCs進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的研究在世界范圍內(nèi)逐漸得以開展，主要分為以下幾個方面。

3.1 體外基礎(chǔ)試驗(yàn)Aleksander-Konert等[29]從臍帶Wharton膠中分離出WJ-MSCs，用兩種常見的透明質(zhì)酸水凝膠(HyStem和HyStem-C)將培養(yǎng)的WJ-MSCs和軟骨細(xì)胞以每100微升15000和30000個細(xì)胞的密度進(jìn)行球形封裝；與在二維培養(yǎng)物中相比，WJ-MSCs和軟骨細(xì)胞在該透明質(zhì)酸水凝膠中的平均活力約為前者的67%，且WJ-MSCs和軟骨細(xì)胞的存活率均較高; Alcian藍(lán)和蕃紅O染色顯示W(wǎng)J-MSCs在水凝膠產(chǎn)生了大量蛋白聚糖；實(shí)時PCR顯示在該水凝膠中Ⅱ型和Aggrecan膠原表達(dá)增加；提示W(wǎng)J-MSCs具有較高的向軟骨細(xì)胞分化的能力。該研究表明WJ-MSCs在透明質(zhì)酸水凝膠中具有一定程度的軟骨形成潛力，為軟骨損傷修復(fù)組織工程中支架的選擇提供了一定的指導(dǎo)作用。

3.2 動物實(shí)驗(yàn)解光越等[30]利用臍帶WJ-MSCs復(fù)合藻酸鈉水凝膠成功修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損，病理學(xué)染色提示修復(fù)組織以透明軟骨為主，且與周圍正常組織整合良好，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)事件，提示人臍帶WJ-MSCs在利用組織工程技術(shù)軟骨修復(fù)中具有巨大前景和潛力。Liu等[31]研究探討了利用人臍帶WJ-MSCs對兔軟骨全層缺損進(jìn)行組織修復(fù)的試驗(yàn)。在16個月的研究過程中，觀察到hWJ-JMSCs有序重塑為軟骨組織，其重塑特征包括：新生軟骨層主要為透明軟骨，表面具有良好的規(guī)律性，與鄰近宿主軟骨完全整合且軟骨下骨再生；并且在兔軟骨缺損處植入人臍帶WJ-MSCs，未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)；在評估再生軟骨的大體外觀和組織學(xué)分級評分后，發(fā)現(xiàn)人臍帶WJMSCs的修復(fù)結(jié)果優(yōu)于軟骨誘導(dǎo)的人臍帶WJ-MSCs。該研究提示與利用轉(zhuǎn)化生長因子誘導(dǎo)的分化型WJ-MSCs進(jìn)行體內(nèi)組織工程治療相比，使用未分化人臍帶WJMSCs作為種子細(xì)胞可能是一種更好的選擇。

Wu等[32]探討了利用人臍帶WJ-MSCs和透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合材料對豬OA模型軟骨修復(fù)的研究。運(yùn)用相同的手術(shù)操作對同一只豬的雙膝關(guān)節(jié)制造相同的全層軟骨缺損模型，實(shí)驗(yàn)組將1.5 mL的WJ-MSCs(5×106細(xì)胞)和透明質(zhì)酸水凝膠(濃度4%)復(fù)合材料移植將到右膝軟骨缺損處，左膝作為空白對照。移植12周后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組透明軟骨再生改善明顯，且膝關(guān)節(jié)組織學(xué)評分明顯高于對照組。該研究提示使用人臍帶WJ-MSCs和透明質(zhì)酸水凝膠的復(fù)合材料進(jìn)行軟骨再生可能是未來臨床早期治療膝關(guān)節(jié)OA軟骨缺損的有效方法，但相關(guān)研究結(jié)果仍需進(jìn)一步完善。

3.3 臨床試驗(yàn)Park等[33]對應(yīng)用同種異體人臍帶血MSCs(hUCB-MSCs)與透明質(zhì)酸水凝膠復(fù)合材料治療的骨關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行了長達(dá)7年的隨訪。該研究將Kellgren-Lawrence 3級和國際軟骨修復(fù)協(xié)會(ICRS)4級軟骨缺損的骨關(guān)節(jié)炎患者納入臨床試驗(yàn)，hUCB-MSCs和透明質(zhì)酸水凝膠組成的復(fù)合材料通過關(guān)節(jié)鏡微創(chuàng)手術(shù)植入病變部位。有7名參加者參加了為期7年的長期隨訪，在術(shù)后12周的關(guān)節(jié)鏡評估中觀察到成熟的修復(fù)組織；術(shù)后24周時，VAS和IKDC評分均有所改善，且改善的臨床結(jié)果在7年的隨訪中是穩(wěn)定的；術(shù)后1年再生軟骨組織學(xué)表現(xiàn)為透明軟骨，術(shù)后3年的MRI顯示再生軟骨持續(xù)存在。該隨訪僅觀察到5例輕中度治療——緊急不良事件，7年隨訪內(nèi)無成骨或腫瘤發(fā)生病例。該隨訪提示這種新型的基于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的藥用產(chǎn)品，在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨再生的治療上似乎是安全有效的，但是隨訪時間不長且病例數(shù)不夠多，后續(xù)需要更長久的隨訪和更多病例的研究。且人臍帶血與Wharton膠屬于臍帶內(nèi)的不同區(qū)域，該研究對后者的研究有一定的提示意義。

楊孝兵等[34]發(fā)現(xiàn)通過移植人臍帶WJ-MSCs(1×107/mL,約2.5 mL)治療嚴(yán)重OA較透明質(zhì)酸鈉能夠明顯、較持久地緩解關(guān)節(jié)疼痛、改善關(guān)節(jié)功能，且4次注射療效優(yōu)于2次注射，但該研究似乎僅證明了注射人臍帶WJ-MSCs可改善患者的臨床癥狀，生物學(xué)角度對于軟骨缺損修復(fù)的療效缺乏佐證，可能需要更進(jìn)一步的研究。Matas等[35]同樣也評價了利用人臍帶WJ-MSCs單次或多次關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療膝骨關(guān)節(jié)炎的安全性和有效性。試驗(yàn)組患者膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)每6個月注射劑量為2×107，3 mL的WJ-MSCs，對照組僅注射HA，在術(shù)后12個月內(nèi)的隨訪中，發(fā)現(xiàn)注射WJ-MSCs的患者疼痛和功能得到明顯改善，臨床評分明顯比對照組高；且未見死亡、腫瘤或感染等嚴(yán)重不良反應(yīng)；影像學(xué)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。雖然該研究提示多次注射WJ-MSCs治療骨關(guān)節(jié)炎短期內(nèi)能緩解疼痛且具有良好的安全性，但是研究周期短，缺乏遠(yuǎn)期療效的隨訪，安全性有待進(jìn)一步論證。

4 結(jié) 語

近年來，隨著干細(xì)胞療法在各種疾病模型中研究的逐漸深入，關(guān)于膝關(guān)節(jié)OA治療的相關(guān)研究也逐漸得以開展，人臍帶WJ-MSCs具有來源廣泛、獲取簡單、不涉及倫理問題、低免疫原性、強(qiáng)增殖能力、多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)能力、無致瘤性等優(yōu)勢，在未來臨床應(yīng)用人臍帶WJ-MSCs治療OA方面，顯示出良好的應(yīng)用前景。尤其是組織工程學(xué)中利用人臍帶WJ-MSCs治療膝關(guān)節(jié)OA軟骨缺損，根據(jù)目前國內(nèi)外相關(guān)研究報道，使用WJ-MSCs治療膝關(guān)節(jié)OA短期內(nèi)是安全且有效的。然而有些地方仍需進(jìn)一步研究，如：①誘導(dǎo)WJ-MSCs定向分化的信號通路及相關(guān)機(jī)制不夠了解，如何提高其定向軟骨分化能力是目前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，提高其軟骨定向分化的常見方法包括：與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)可提高WJ-MSCs的軟骨定向分化能力，其次分化培養(yǎng)基中添加生長因子，如胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和TGF- β也可增強(qiáng)其軟骨分化，此外還可通過在3D支架組合MSC和生物材料刺激或通過操縱氧張力來提高其軟骨定向分化；另外最近證據(jù)表明，microRNA(miRNA)在軟骨分化中起著重要作用，因此，在軟骨分化過程中研究miRNA可能有助于了解MSCs中軟骨分化的調(diào)控機(jī)制，關(guān)于軟骨分化中的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究完善；②關(guān)節(jié)軟骨損傷程度與干細(xì)胞治療的相關(guān)性沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)；③臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、注射和移植選擇時機(jī)的缺乏一定的標(biāo)準(zhǔn)；④臨床試驗(yàn)缺乏遠(yuǎn)期隨訪結(jié)果；⑤動物試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒉荒芡耆MOA的微環(huán)境，更優(yōu)化的模型有待進(jìn)一步完善。因此，在之后的研究中應(yīng)著力解決這些不足之處，為廣泛應(yīng)用WJ-MSCs治療膝關(guān)節(jié)OA軟骨缺損提供進(jìn)一步的理論依據(jù)，以期未來能夠成功的修復(fù)膝關(guān)節(jié)OA軟骨缺損并逆轉(zhuǎn)其進(jìn)程。