TIMP2 和IGFBP7 的生物學功能及其在腎臟損傷過程中作用的研究進展

張 楊 （綜 述） 王一梅 姜物華 趙 栓 丁小 強 △（審 校）

（1復旦大學附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科 上海 200032；2上海市腎病與透析研究所 上海 200032；3上海市腎臟疾病與血液凈化重點實驗室 上海 200032）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指腎臟功能在短期內(nèi)惡化（以腎小球濾過率快速下降為特點）的一組以代謝廢物毒素蓄積、體液潴留、電解質(zhì)酸堿平衡紊亂等為特征的臨床綜合征。根據(jù)全球AKI 流行病學Meta 分析顯示，成年住院患者發(fā)病率為21.6%，病死率為23.9%。兒童住院患者發(fā)病率高達 33.7%，病死率為 13.8%［1］。2015 年我國一項2 223 230 例的多中心臨床調(diào)查顯示，AKI 住院病死率為12.4%，另有16.1%的住院患者出院時仍有嚴重AKI，高達74.2%的AKI 患者住院期間未被診斷，而被診斷的患者中有17.6%診斷滯后［2］。目前對AKI 仍然沒有有效的治療方法，主要原因在于AKI 發(fā)病原因復雜，難以精確預測或早期診斷。

生物標志物是臨床預測和診斷AKI 的重要指標，主要包括血肌酐、尿素氮、尿中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、腎 損 傷 分 子 1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、尿 IL-18、金屬蛋白酶組織抑制因 子 2（tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP2）和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7（insulinlike growth factor binding protein 7，IGFBP7）等［3］。其 中 ，尿 液 TIMP2 和 IGFBP7 濃 度 的 乘 積（［TIMP2］·［IGFBP7］）在 AKI 早期顯著升高，因此在預測 AKI 發(fā)生方面優(yōu)于其他標志物［3］。［TIMP2］·［IGFBP7］在危重患者及心臟手術(shù)后患者AKI 風險預測中表現(xiàn)良好［4-6］，同時該指標能很好地預測膿毒血癥 AKI 患者的預后結(jié)局［7］，且一般合并癥（如糖尿病、充血性心力衰竭、慢性腎臟病）不會影響這一指標對 AKI 的風險評估［8］，其在 2014 年被 FDA 批準用于 AKI 的臨床預測。但是，TIMP2 和 IGFBP7 的生物學功能是什么，TIMP2 和IGFBP7 為何能夠預測AKI 的發(fā)生，二者在正常以及損傷后的腎臟中有何作用等問題都尚未明確。因此本文通過分析TIMP2 和IGFBP7 所屬蛋白家族的特點及已報道的生物學功能，對TIMP2 和IGFBP7 在腎臟中除生物標志物之外的作用和功能進行深入解析。

TIMP2 的生物學特征和功能

TIMPs 家 族 與 TIMP2 TIMP2 屬 于 TIMPs 家族，該家族由4 個成員組成（TIMP1~4），為內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的抑制因子。各成員對MMPs 的抑制能力和范圍存在差異，TIMP3 的抑制作用最廣泛，TIMP2 其次，而 TIMP1 范圍最窄（表 1）。TIMPs 通過調(diào)控MMPs 的活性調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的代謝、組織的重塑和細胞行為等生物過程；還通過非MMP 依賴性途徑參與細胞增殖、分化、凋亡、遷移、血管形成等生命過程，例如TIMP2/3 具有調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用［9］。

表1 人TIMP 家族成員的生物學功能簡介Tab 1 Biological functions of the human TIMPs

在基因組中，TIMP1、3 和 4 的編碼基因與突觸相關(guān)蛋白編碼基因的內(nèi)含子存在部分重合，而編碼TIMP2 的 基 因 與 編 碼 DDC8（differential display clone 8）基因部分重合。DDC8 在睪丸等組織中表達，與TIMP2 共同參與精子生成、腦皮質(zhì)損傷修復等過程［10］。

TIMP2 的蛋白結(jié)構(gòu)及表達部位 人TIMPs 蛋白由 N 端和 C 端結(jié)構(gòu)域組成［11］：N 端中間區(qū)域的氨基酸序列極為保守，是結(jié)合 MMPs 的主要部位［12］；C端結(jié)構(gòu)域則在pro-MMP2 激活過程中起重要作用［13］。TIMP2 在正常機體內(nèi)的多個器官中表達，多表達于生殖系統(tǒng)及膀胱中，而腎臟中較少［14］。

TIMP2 對細胞增殖的影響及機制 TIMP2 能夠促進細胞增殖。在細胞質(zhì)中，TIMP2 的C 端結(jié)構(gòu)域與MMP2 前體（pro-MMP2）結(jié)合形成復合物，在MMP14 的作用下成為成熟的 MMP2［13］。TIMP2 同時對MMP2 活性具有抑制作用，這受到細胞膜中TIMP2、細胞外基質(zhì)以及MMP14 三者含量的調(diào)控［9］。研究發(fā)現(xiàn) TIMP2 通過激活蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）及 磷 脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號途徑促進細胞生長［15］。游離在細胞外的TIMP2 通過結(jié)合細胞表面的MMP14，激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2），促進細胞生長［16］。在肺腺癌中，TIMP2 通過 c-Src 激酶的活化，激活黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）、PI3K/AKT、ERK1/2 通路，促進腫瘤細胞增殖［17］。TIMP2基因敲除小鼠表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌生成缺陷，如神經(jīng)元分化延遲、運動系統(tǒng)功能異常、肌力降低等［9］。

另一方面，TIMP2 具有抑制細胞增殖的功能。TIMP2 通過結(jié)合內(nèi)皮細胞表面的 α3β1整合素，抑制血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）和成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）的激活，同時激活腺苷酸環(huán)化酶，增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，激活含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase-1，SHP-1），使 VEGF/FGF 受體去磷酸化［9，18］。TIMP2 通過促進 p27Kip1的合成進而抑制 CDK4（cyclin-dependent kinase 4）和CDK2，最 終 使 內(nèi) 皮 細 胞 周 期 停 滯 于 G1 期［18］。TIMP2 通過抑制細胞周期蛋白B 和D 的表達，促進CDK 抑制因子p21Cip的生成，抑制神經(jīng)元細胞進入細胞周期，促進細胞分化［19］。TIMP2 還可以通過抑制 Wnt （wingless-type MMTV integration site family）/β-catenin 通路來抑制腫瘤細胞的增殖［20］。除通過上述MMP 非依賴機制外，TIMP2 還可以通過抑制MMPs 調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，進而抑制血管形成［9，18，21］。

TIMP2 在腎臟中的作用及其機制 TIMP2 參與腎臟發(fā)育過程。輸卵管芽通過分泌TIMP2 抑制MMPs 的活性，導致細胞外基質(zhì)沉積，從而抑制輸尿管芽的生長。膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor 7，F(xiàn)GF7）在腎臟發(fā)育早期通過促進輸尿管芽分泌TIMP2，抑制腎間充質(zhì)干細胞的凋亡［22］。

TIMP2 參與腎臟免疫調(diào)節(jié)過程。在脂多糖誘導的人近端腎小管上皮細胞損傷以及AKI 小鼠模型中，下調(diào)TIMP2 可以抑制p65 磷酸化，進而抑制NFκB（nuclear factor kappa B）通路，減少細胞因子釋放和細胞凋亡，因而TIMP2 下調(diào)在內(nèi)毒素引起的AKI 中對腎臟具有保護作用［23］。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血或甘油誘導的腎損傷小鼠模型中，尿液TIMP2、IGFBP7 含量明顯上升，但腎臟中TIMP2 和IGFBP7 的 mRNA 水平并未增加，因而 AKI 發(fā)生時腎小管濾過增加、重吸收減少使近曲小管TIMP2 和IGFBP7 分泌量增加，而并非由TIMP2 和IGFBP7表達量增加所致［24］。

IGFBP7 的生物學特征和功能

IGFBPs 家族與IGFBP7 胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）的結(jié)構(gòu)與胰島素相似，具有有絲分裂原的作用，可調(diào)控細胞增殖和代謝。根據(jù)與IGF的親和性，IGF結(jié)合蛋白（IGF binding protein，IGFBP）超家族主要分為高親和性的IGFBP1~6 和低親和性的IGFBP 相關(guān)蛋白（IGFBP-related protein，IGFBP-rP），IGFBP7 屬于后者［25］。

IGFBPs 結(jié)構(gòu)和功能 傳統(tǒng)意義上的IGFBPs（IGFBP1~6）富含半胱氨酸，由 N 端、中間區(qū)域、C端這3 個結(jié)構(gòu)域組成。其中N 端、C 端高度保守，中間區(qū)域具有可變性。N 端含有一段極為保守的“GCGCCXXC”氨基酸序列，與 IGF 親和力有關(guān)［26-29］。

IGFBP 作為 IGFs 的轉(zhuǎn)運蛋白，調(diào)節(jié) IGFs 的功能與活性，延長IGFs 在體液中的半衰期。IGFs 若被定位在細胞膜上，IGFBP 募集則有助于與IGF 受體結(jié)合，而若被胞外游離的IGFBP 結(jié)合則不利于與IGF 受體結(jié)合［30］。這些作用通過 IGFBP 中間區(qū)域的磷酸化［31］和IGFBP 蛋白酶降解等機制進行調(diào)節(jié)。IGFBP 可以直接通過調(diào)節(jié)細胞分泌生長因子、與細胞表面非IGF 受體直接作用、入核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及鞘磷脂作用途徑等多種機制調(diào)控細胞凋亡、增殖、存活、衰老和自噬等過程［32-34］。

IGFBP-rP 在結(jié)構(gòu)和功能上與IGFBP1~6 類似，因此也被列入IGFBP 家族。IGFBP-rP 具有保守的N 端結(jié)構(gòu)域，但是缺少C 端結(jié)構(gòu)域和中間結(jié)構(gòu)域，雖然能夠結(jié)合IGF 但親和力比IGFBP1~6 低，因而被稱為IGFBP-rP。成員包括IGFBP7、結(jié)締組織 生 長 因 子（connective tissue growth factor，CTGF）、IGFBP-rP3 和 IGFBP-rP4［35-38］等。

IGFBP7 的分布 IGFBP7 分布非常廣泛，在外周神經(jīng)、平滑肌細胞（包括血管壁、消化道、膀胱、前列腺）、呼吸系統(tǒng)纖毛、附睪以及輸卵管中都有較強的免疫熒光染色，各臟器中腎臟表達最多［14］。幾乎所有的上皮細胞都有不同程度的IGFBP7 表達，在血漿、尿液、羊水、腦脊液等體液中IGFBP7 均可被檢測到［39］，但脂肪細胞、漿細胞和淋巴細胞內(nèi)沒有表達。腎臟中IGFBP7 在不同細胞類型中的分布不同，其中腎小球表達量最低，遠曲小管中的表達高于近端小管［40］。也有研究發(fā)現(xiàn)IGFBP7 在近端小管表達較強，并且定位在部分近曲小管的刷狀緣［41］。

IGFBP7 的結(jié)構(gòu) IGFBP7 的 N 端結(jié)構(gòu) 域具有IGFBP 家族特點，含有“GCGCCXXC”肽段，而 N 端結(jié)構(gòu)域之外的序列與IGFBP 家族其他成員的同源性僅為15%［25］。近N 端有一段氨基酸序列與Kazal家族絲氨酸蛋白酶相似，稱為KI（Kazal-type serine proteinase inhibitor）結(jié)構(gòu)域［25］，這段序列還與卵泡抑素高度同源。KI 結(jié)構(gòu)域之后的序列與成纖維細胞生長因子受體中的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)類似，該序列與硫酸乙酰蛋白肝素具有同源性［42］（圖1）。傳統(tǒng)IGFBP 與IGF 的結(jié)合需要N 端和C 端結(jié)構(gòu)域共同參與。由于 IGFBP7 缺少 C 端結(jié)構(gòu)域，IGFBP7 與IGF 的親和力僅為傳統(tǒng) IGFBPs 的 1%［43］。C 端結(jié)構(gòu)域的缺失還造成N 端結(jié)構(gòu)域中的胰島素結(jié)合位點暴露［44］（圖 2），因而 IGFBP7 與胰島素的親和力比IGFBP 家族其他成員更強。綜上，IGFBP7 可能通過非IGF 途徑發(fā)揮生物學功能。

圖1 IGFBPs 和IGFBP-rPs 的構(gòu)成與簡化結(jié)構(gòu)Fig 1 The composition and simplified structure of IGFBPs and IGFBP-rPs

圖2 IGFBP/GFBP-rP 與胰島素結(jié)合機制Fig 2 The mechanism of IGFBP/IGFBP-rP binding to IGF

IGFBP7 的功能及作用機制 IGFBP7 參與細胞黏附和腫瘤細胞增殖等過程。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）和維甲酸等能上調(diào)前列腺上皮細胞中的IGFBP7［25］。同時，IGFBP 降解后的N 端片段仍具有細胞膜黏附的作用［45］。IGFBP7 能夠與 Activin 結(jié)合，調(diào)節(jié)腺體組織的生長發(fā)育和卵泡刺激素的生成［46］。IGFBP7 能夠與Ⅳ型膠原結(jié)合，促進臍靜脈內(nèi)皮細胞的黏附和形態(tài)改變［47］。IGFBP7 定位于細胞表面，與蛋白聚糖作用，促進細胞黏附于纖連蛋白和黏連蛋白5 等［48］（圖3）。IGFBP7 通過調(diào)控細胞周期參與細胞增殖。在腫瘤領(lǐng)域，IGFBP7 可以通過抑制細胞周期蛋白D1 和 p21 的表達，并促進細胞周期蛋白 A、E、p16、p27 表 達［48-50］，或 通 過 抑 制 Akt 的 激 酶 活 性 ，引 起CDK 抑制因子 p27Kip1和 p21Cip1上調(diào)［51］，誘導細胞停滯于G0/G1 期。細胞內(nèi)過表達或細胞培養(yǎng)液中添加外源IGFBP7，可以通過非IGF-I 受體、AKT、ERK 途徑誘導細胞停滯于G2 期，進而導致細胞凋亡［52］。IGFBP7 還可以通過提高SMARCB1（SWI/SNF related，matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily B，member 1）水平，進而提高BNIP3L（BCL2 interacting protein 3 like）水平，同時抑制 BRAF-MEK-ERK 通路，誘導細胞衰老和凋亡［53］。IGFBP7 還可以通過絲裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路抑制IGF 對細胞的促分化作用，但不影響 IGF 的促增殖作用［54］。

圖3 IGFBP7 的作用與調(diào)節(jié)Fig 3 The functions and regulation of IGFBP7

IGFBP7 在腎臟損傷中的作用 IGFBP7 參與多種腎臟病的發(fā)生發(fā)展。敗血癥引起的AKI 中，IGFBP7 通過激活ERK1/2 及通路相關(guān)蛋白，如細胞 周 期 蛋 白 D、p21、Bcl-2、Bax（BCL2 associated X），誘導細胞停滯于 G0/G1 期［55］。在糖尿病腎病中，TGF-β1 通過SMAD2（a family of proteins similar to the drosophila mothers against decapentaplegic，member 2）和 SMAD4 上調(diào) IGFBP7 表達，同時上皮標志物E-cadherin 下調(diào)，間充質(zhì)標志物α 平滑肌肌動蛋 白（α smooth muscle actin，α -SMA）上 調(diào) 。IGFBP7 的敲除可以抑制TGF-β1 誘導的上皮向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，緩解腎纖維化［56］，這與 IGFBP7 在肝纖維化中的實驗結(jié)果一致［57］，這一機制在糖尿病腎病的腎纖維化中也存在［58］。

綜上所述，TIMP2 和IGFBP7 都參與細胞的增殖和凋亡過程［59-60］，目前研究集中在腫瘤領(lǐng)域，而缺少腎損傷領(lǐng)域的研究。 今后的研究重點：（1）TIMP2 和 IGFBP7 在 AKI 引起細胞周期停滯中的作用；（2）TIMP2 和 IGFBP7 為何上調(diào)，如何反映腎臟損傷，能否作為治療靶點；（3）基于TIMP2、IGFBP7 細胞周期抑制/促進機制、表達分布差異、隨腎損傷程度的變化、蛋白分布的變化等研究，有助于指導對腎損傷不同病因、不同程度、不同部位（如近端小管、遠端小管、集合管或間質(zhì)）的診斷。

結(jié)語TIMP2 和IGFBP7 本身功能多樣、作用機制復雜，與細胞增殖和凋亡的關(guān)系密切。在AKI發(fā)生早期，二者在尿液中的含量顯著升高，TIMP2可 能 通 過結(jié)合 α3β1整 合 素 受 體、促進 p27Kip1和 p21Cip合成、Wnt/β-catenin 通路等機制調(diào)控細胞周期；IGFBP7 可能通過與Ⅳ型膠原結(jié)合、與蛋白聚糖作用參與細胞黏附，通過調(diào)節(jié)p21、p27、ERK1/2 等蛋白參與細胞增殖。尿液中二者的增加也可能是由腎小管上皮細胞分泌/重吸收功能的異常所引起。在AKI 中下調(diào)TIMP2 對腎臟有潛在的保護作用，上調(diào)IGFBP7 則具有潛在促進纖維化的作用。TIMP2 與IGFBP7 作為目前 FDA 認證的臨床 AKI早期標志物，研究其在AKI 過程中的生物學功能，對AKI 的早期診斷及治療具有重要的指導意義。

作者貢獻聲明張楊 文獻調(diào)研，圖表繪制，論文構(gòu)思、撰寫和修訂。王一梅，姜物華 論文校審和修訂。趙栓，丁小強 論文指導和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。