阿托伐他汀抑制代謝綜合征誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu)

蔡嘉莉 汪 霞 尹安雯 沈燁嬌 肖青青 沈玲紅 何 奔

（上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心血管內(nèi)科 上海 200030）

心血管代謝綜合征（cardiometabolic syndrome，CMS）是指一系列代謝性疾病和心血管疾病，包括肥胖、葡萄糖耐量降低和高血壓等疾病。隨著人口老齡化以及不良生活方式流行，CMS 患者數(shù)量占全世界人口的25%［1］，且持續(xù)上升，這增加了心力衰竭的發(fā)病風(fēng)險［2］。代謝綜合征會引起機體代謝紊亂，繼而引起系統(tǒng)性炎癥和心臟重構(gòu)，最終發(fā)展為心力衰竭［3］。目前，對于合并代謝綜合征的心力衰竭患者缺乏有效的治療手段。

阿托伐他?。ˋtorvastatin，ATO）是羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶抑制劑，是降低血清膽固醇水平和臨床預(yù)防心血管疾病的最常用處方藥物之一，主要作用是通過降脂、抗炎、抗氧化應(yīng)激和改善內(nèi)皮功能等發(fā)揮心血管保護作用［4］。他汀對心力衰竭的作用存在悖論：能夠預(yù)防心力衰竭的進展，但是不能降低心力衰竭的發(fā)病率和死亡率［5］。這可能與他汀在合并代謝綜合征的心力衰竭和慢性心力衰竭中作用效果不一致有關(guān)。臨床數(shù)據(jù)顯示，他汀能夠降低合并代謝綜合征的心力衰竭患者的死亡率［6-7］，合并代謝綜合征的心力衰竭通常是射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭。兩項大型隨機對照臨床試驗CORONA和GISSI-HF 結(jié)果顯示他汀對慢性心力衰竭的作用效果不佳，使我們忽略了它可能在特定亞型心力衰竭中的作用。

目前對于ATO 的研究主要集中在單因素發(fā)病的疾病模型中，如糖尿病［8］、高脂［9］和自發(fā)性高血壓［10］等引起的心臟重構(gòu)。本研究采用雙打擊模型［11］，該模型更符合臨床代謝綜合征誘導(dǎo)心臟重構(gòu)的動物模型，從而探究ATO 是否能夠延緩代謝綜合征誘導(dǎo)心臟重構(gòu)的進展。

資料和方法

實驗動物及分組本研究使用8~10 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，購自北京維通利華公司，生產(chǎn)許可號：SCX（滬）2017-0011。小鼠飲食供應(yīng)充足，飼養(yǎng)環(huán)境室溫和相對濕度恒定。24 只小鼠使用隨機數(shù)字法分為4 組，每組6 只。每組之間的小鼠初始體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。動物實驗符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物福利倫理委員會的要求。通過給予高脂飲食（high fat diet，HFD）（60 kcal%脂肪+20 kcal% 碳水化合物+20 kcal% 蛋白質(zhì)，Research Diet D12492）和含 0.5 g/L N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME，美國Sigma 公司）的飲用水造模（圖1）。對照組（Chow）給予正常飲食和飲水，每日給予等體積溶劑灌胃；模型組給予HFD 和L-NAME 飲水，每日給予等體積溶劑（Vehicle）灌胃；低劑量組（ATO10）給予HFD 和 L-NAME 飲 水 ，每 日 給 予 10 mg·kg?1·d?1ATO（MCE 目錄號：HY-17379）灌胃；高劑量組（ATO20）給予 HFD 和 L-NAME 飲水，每日給予20 mg·kg?1·d?1ATO 灌胃。動物造模時間和給藥時間均為12 周，小鼠無死亡。

圖1 代謝綜合征誘導(dǎo)下小鼠心臟重構(gòu)模型建立Fig 1 The establishment of cardiac remodeling model induced by metabolic syndrome in mice

血壓測量造模結(jié)束前1 周開始進行血壓監(jiān)測，讓小鼠適應(yīng)測血壓的過程，減少后續(xù)應(yīng)激反應(yīng)對實驗的影響。采用尾靜脈壓測量法測量小鼠血壓。

葡萄糖耐量實驗禁食12 h 后，通過鼠尾靜脈血測量空腹血糖水平，腹腔注射2 g/kg葡萄糖溶液后15、30、60 和120 min，分別測量血糖水平（mg/L）。

血脂四項測定眼球取血法留取全血，靜置離心，分離血清，測定血清中膽固醇（cholesterol，CHO）、三酰甘油（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的含量（mmol/L）。

小鼠心臟超聲將頻率為5.0~11.0 MHz 的超聲心動圖探頭置于胸骨旁短軸。記錄左室乳頭肌水平M 型超聲心動圖，測量左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左心窒的短軸縮 短 率（fractional shortening，F(xiàn)S）、心 輸 出 量（cardiac output，CO）和每搏輸出量（stroke volume，SV）等指標(biāo)。

動物取材、心臟病理造模12 周后，稱量小鼠終末體質(zhì)量。小鼠麻醉后進行心臟灌注，用濾紙吸干多余水分，稱量心臟重量（heart weight，HW）后多聚甲醛固定。取小鼠左側(cè)脛骨（tibia length，TL），用游標(biāo)卡尺測量脛骨長度。固定好的心臟組織進行石蠟包埋，從冠狀面進行切片，厚度為6 μm。切片進行HE 染色、馬松化學(xué)染色和WGA 免疫熒光染色。

Western blot 檢測提取心臟組織蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品上樣后電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉后，與一抗Collagen Ⅰ（Ab270993 1∶1 000）、α-SMA（Ab124964 1∶1 000）、α-Tubulin（Beyotime AF0001 1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗去一抗后，室溫下二抗孵育60 min。TBST 洗去二抗后進行顯影。

統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)用表示。各組間差異采用One-way ANOVA 方法分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠糖代謝異常和肥胖造模12 周后，模型組小鼠空腹血糖較對照 組 升 高［Chowvs.Vehicle：（4.98±0.91）mmol/Lvs.（5.57±0.26）mmol/L，P=0.005］。 ATO10 組 和ATO20 組的空腹血糖均較模型組降低［ATO10vs.Vehicle：（4.77±0.60）mmol/Lvs.（5.57±0.26）mmol/L，P=0.002；ATO20vs. Vehicle：（5.07±0.43）mmol/Lvs. （5.57±0.26）mmol/L，P=0.003；F=5.56］（ 圖2A）。IGTT 結(jié)果顯示，模型組引起的血糖波動大于 ATO10 組和 ATO20 組，ATO10 組在注射葡萄糖15 min 后，血糖升高程度較模型組降低（P=0.006），ATO20 組在注射葡萄糖 15 min（P=0.002）及 30 min（P=0.010）后均能降低血糖波動幅度（圖2B、2C）。ATO 降低高脂引起的體質(zhì)量增加程度［Chowvs.Vehicle：（28.78±1.99）gvs. （40.03±3.76） g，P<0.05； ATO10vs. Vehicle：（34.10±4.06） gvs.（40.03±3.76） g，P=0.025；ATO20vs. Vehicle：（34.32±2.92）gvs.（40.03±3.76）g，P=0.015；F=11.75］（圖2D），且與攝食量無關(guān)。

圖2 ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠糖代謝異常和肥胖Fig 2 ATO inhibited abnormal glucose metabolism and obesity induced by HFD+L-NAME in mice

ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠脂質(zhì)代謝異常造模12 周后，測定各組小鼠4 項血脂水平（表1）：與 模 型 組 相 比 ，ATO10 組 和 ATO20 組 抑 制HFD+L-NAME 誘 導(dǎo) 的 循環(huán) CHO、TG 和 HDL 含量升高（P<0.05，圖 3A~3C）。4 組小鼠的血清LDL 含量未見差異（圖3D）。

圖3 ATO 改善HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠血脂紊亂Fig 3 ATO inhibited abnormal lipid metabolism induced by HFD-L-NAME in mice

表1 ATO 改善HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠血脂紊亂Tab 1 ATO inhibited abnormal lipid metabolism induced by HFD-L-NAME in mice （）

表1 ATO 改善HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠血脂紊亂Tab 1 ATO inhibited abnormal lipid metabolism induced by HFD-L-NAME in mice （）

CHO：Cholesterol；TG：Triglycerides；HDL：High density lipoprotein；LDL：Low density lipoprotein.（1）vs. Chow group，（2）vs. Vehicle group，P<0.05（n=6）.

F value 28.04 8.46 13.15 0.41 Lipid CHO（mmol/L）TG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）Chow group 2.13±0.17 0.88±0.18 1.16±0.14 0.49±0.11 Vehicle group 4.98±0.49（1）1.45±0.27（1）2.18±0.35（1）1.43±0.05 ATO10 group 2.53±0.95（2）0.92±0.32（2）1.36±0.39（2）0.43±0.15 ATO20 group 2.63±0.47（2）0.85±0.12（2）1.39±0.28（2）0.43±0.15

ATO 降低HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠血壓升高造模12 周后，模型組收縮壓明顯升高，ATO20組能夠降低HFD+L-NAME 引起的收縮壓升高［ATO20vs. Vehicle：（128.46±6.79） mmHgvs.（141.52±4.42）mmHg，P=0.003］（圖 4A）。模型組的平均動脈壓較對照組升高，ATO10 組和ATO20 組的平均動脈壓均有下降［ATO10vs. Vehicl：（109.18±4.88）mmHgvs.（117.53±3.48）mmHg，P=0.007；ATO20vs.Vehicle：（97.17±7.51）mmHgvs.（117.53±3.48）mmHg，P<0.001；F=59.76］（圖 4B）。與模型組比較，ATO10 組和ATO20 組均能降低HFD+L-NAME 引起的舒張壓升高［ATO10vs.Vehicle：（94.89±6.85）mmHgvs.（104.29±5.18）mmHg，P=0.023；ATO20vs. Vehicle：（83.53±7.66）mmHgvs.（104.29±5.18）mmHg，P<0.001；F=32.16］（圖 4C）。

圖4 ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠血壓升高Fig 4 ATO inhibited HFD+L-NAME induced hypertension in mice

ATO 改善HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠心輸出量下降各組小鼠之間的LVEF 和FS 均未見明顯差異（圖5A、5B）。模型組的CO 和SV 較對照組下降（P<0.05）。ATO10 組 和 ATO20 組 CO［ATO10vs.Vehicle：（0.50±0.06）mg·kg?1·d?1vs.（0.43±0.06）mg·kg?1·d?1，P=0.003；ATO20vs. Vehicle：（0.50±0.09） mg·kg?1·d?1vs.（0.43±0.06） mg·kg?1·d?1，P=0.017；F=23.56］（圖 5C）和 SV（ATO10vs. Vehicle：（1.01±0.10）μL/gvs.（0.89±0.11）μL/g，P=0.002；ATO20vs. Vehicle：（1.05±0.20） μL/gvs.（0.89±0.11）μL/g，P=0.012；F=16.42］水平均提高（圖5D）。

圖5 ATO 改善HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠心輸出量下降Fig 5 ATO alleviated heart output reduction induced by HFD-L-NAME in mice

ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu)形態(tài)學(xué)改變通過HE 和Masson 染色觀察心臟組織病理學(xué)改變：與對照組比較，模型組出現(xiàn)明顯的室壁增厚和心臟纖維化；與模型組比較，ATO10 組和 ATO20 組的心臟室壁厚度（P<0.001，F(xiàn)=27.06）（圖6A）和Masson 染色陽性區(qū)域均減少（P=0.002，F(xiàn)=10.95）（圖 6B）。造模 12 周后，WGA 染色結(jié)果顯示，模型組的心肌橫截面積較對照組增大。ATO10組和ATO20 組的心肌橫截面積均較模型組縮?。跘TO10vs. Vehicle：（543.65±43.24） μm2vs.（698.41±79.34）μm2，P=0.002；ATO20vs. Vehicle：（469.24±31.94）μm2vs. （698.41±79.34）μm2，P<0.05；F=40.08］（圖6C）。

圖6 ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變Fig 6 ATO inhibited morphological changes of cardiac remodeling in mice induced by HFD+L-NAME

ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu)相關(guān)蛋白改變Collagen Ⅰ和α-SMA 是心臟重構(gòu)的重要標(biāo)記物。模型組Collagen Ⅰ和α-SMA 蛋白表達水平均升高（圖 7A），使用 ATO 后，ATO10 組和ATO20 組Collagen Ⅰ蛋白表達水平較模型組下降 （ATO10vs. Vehicle：P=0.013；ATO20vs.Vehicle：P=0.022；F=4.49）（圖 7B），ATO10 組 和ATO20 組的α-SMA 蛋白表達水平均較模型組下降（ATO10vs.Vehicle：P=0.010；ATO20vs.Vehicle：P=0.018；F=6.28）（圖 7C）。ATO10 組和 ATO20 組的HW/TL 均較模型組降低［ATO10vs.Vehicle：（8.18±0.54）mg/mmvs.（8.98±0.57） mg/mm，P=0.030；ATO20vs.Vehicle：（8.09±0.45）mg/mmvs.（8.98±0.57）mg/mm，P=0.013；F=11.41］（圖 7D）。

圖7 ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu)的相關(guān)蛋白改變Fig 7 ATO inhibited the proteins changes of cardiac remodeling in mice induced by HFD+L-NAME

討 論

本研究的結(jié)果顯示ATO 對HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的代謝紊亂有調(diào)節(jié)作用，可抑制心臟重構(gòu)進展。本研究采用的是雙打擊模型［11-12］，L-NAME 可引起小鼠高血壓，高脂飲食可引起肥胖以及糖耐量受損，多種高危因素同時存在，更符合合并代謝紊亂的心力衰竭患者的臨床表現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明ATO 可改善小鼠葡萄糖耐量受損和降低高脂引起的體重增加。目前關(guān)于ATO對于血糖的調(diào)節(jié)還存在爭議。不同研究中使用的不同類型的他汀類藥物、給藥時間長短不同以及對應(yīng)人群和動物模型不同對胰島素抵抗程度的影響也隨之改變。本研究的結(jié)果顯示：在血糖調(diào)節(jié)方面，ATO 能夠降低小鼠空腹血糖，維持血糖穩(wěn)態(tài)，降低血糖升高的峰值，但是血糖下降無明顯差異。由于未檢測胰島素分泌水平且未行胰島素抵抗試驗，調(diào)節(jié)血糖的具體機制不明。本研究采用雙打擊模型，L-NAME 和高脂飲食均會引起iNOS 表達增高，從而引起胰島素抵抗［11］。iNOS 是重要的代謝調(diào)節(jié)酶，與胰島素抵抗密切相關(guān)［3］。該模型不僅模擬了代謝綜合征誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)，同時合并有非酒精性脂肪肝［12］。他汀影響血糖代謝的兩個主要機制可能：增加胰島素抵抗和影響胰島素分泌。有研究表明，ATO 可能通過抑制脂肪組織的增加和脂肪細(xì)胞肥大及其炎癥因子的釋放，從而改善糖耐量受損［13-14］。同時，ATO 可能抑制 iNOS 表達升高［15］，從而改善胰島素抵抗。文獻報道，ATO 影響小鼠胰腺β 細(xì)胞的數(shù)量和合成分泌功能，最終引起血糖升高，增加新發(fā)糖尿病的風(fēng)險［16］。結(jié)合本研究的結(jié)果：ATO 抑制HFD+L-NAME 誘導(dǎo)的小鼠血糖升高和糖代謝紊亂，說明ATO 對抑制iNOS 從而改善胰島素抵抗的作用大于阿托伐他汀對胰腺β 細(xì)胞數(shù)量和合成分泌功能的抑制作用。

在血脂調(diào)節(jié)方面，本研究結(jié)果顯示：ATO 抑制HFD+L-NAME 會 引 起 小鼠 血 清 中 CHO、TG 和HDL 水平升高，但并不改變LDL 水平。本模型對血脂的改變主要由HFD 引起的。脂質(zhì)代謝異常引起的心臟脂毒性也是重要的致病因素之一［18］。文獻報道［9，13］，ATO 抑制 HFD 誘導(dǎo)的小鼠血漿 CHO、LDL 和TG 水平，HDL 水平未出現(xiàn)明顯改變。本模型的LDL 水平未發(fā)生明顯改變，模型組HDL 水平升高，主要是由于模型組總CHO 水平升高。

另外，ATO 能夠降低高脂飲食誘發(fā)的小鼠體質(zhì)量增加，與文獻報道ATO 降低小鼠體質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪是一致的［9］，其引起的體質(zhì)量減少與攝食量無關(guān)。本模型的高血壓機制不同于Ang Ⅱ誘發(fā)的RAS 系統(tǒng)激活的高血壓，更傾向于是一種內(nèi)皮和血管功能受損和容量性高血壓［11］。ATO 通過上調(diào)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 的表達，改善內(nèi)皮功能，維持內(nèi)皮的NO 穩(wěn)態(tài)，從而起到降壓的作用。也可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖從而抑制血管重構(gòu)。臨床研究顯示，將他汀類藥物加入降壓治療可進一步改善心血管健康［17］。

心臟的舒張功能異常通常早于收縮功能異常。不同于缺血性心力衰竭引起的射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）下降，本文主要研究EF 值正常情況下心臟出現(xiàn)舒張功能異常，是心力衰竭的一種亞型，或者說是心力衰竭的早期階段。本模型的小鼠EF和FS 正常，但心臟的僵硬度升高，心臟的順應(yīng)性變差，使舒張末期心室直徑下降，小鼠的心臟博出量和每博輸出量均下降。由于ATO 對小鼠體質(zhì)量有影響，通過體質(zhì)量來較正 CO 和 SV［9］，發(fā)現(xiàn) ATO 對HFD+L-NAME 引起的小鼠CO 和SV 下降均有改善作用。

本研究中，高劑量組ATO 對代謝綜合征的調(diào)節(jié)作用及對心臟重構(gòu)的抑制作用優(yōu)于低劑量組，但兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在小鼠體內(nèi)低劑量組和高劑量組均達到有效的血藥濃度，且趨于飽和濃度。而且無論是哪種他汀，藥物劑量加倍只能使LCL-D 降低幅度增加6%，但不良反應(yīng)卻大幅增加。所以，對于降脂效果不達標(biāo)的患者，考慮合用非他汀類降脂藥物（如依折麥布、PCSK9 抑制劑等）聯(lián)合降脂。

近年代謝誘導(dǎo)心臟重構(gòu)和心力衰竭呈上升趨勢，而ATO 是臨床常用的抗動脈粥樣硬化的藥物。從循證醫(yī)學(xué)角度考慮，我們?nèi)孕枰笮偷呐R床試驗證明ATO 在CMS 患者中的獲益情況，以期為早期和可持續(xù)的循證治療提供證據(jù)，以促進心臟代謝健康并減輕心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本文不足之處：（1）可設(shè)置更低的ATO 藥物濃度；（2）ATO 對心臟代謝綜合征的具體調(diào)控機制仍有待進一步研究；（3）本研究缺乏相關(guān)臨床資料支持。

綜上所述，代謝紊亂會誘導(dǎo)心臟重構(gòu)，ATO 通過調(diào)節(jié)代謝紊亂、抑制心肌肥大和心臟間質(zhì)纖維化，對心臟重構(gòu)有延緩作用。

作者貢獻聲明蔡嘉莉 文獻調(diào)研和整理，研究構(gòu)思和設(shè)計，數(shù)據(jù)整理和分析，論文撰寫。汪霞，尹安雯 研究構(gòu)思和設(shè)計。沈燁嬌，肖青青 論文修訂。沈玲紅，何奔 課題構(gòu)思，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。