鹽巴戟天有效成分在體腸灌流研究

華悅，魏曉峰，李喆，張超，史輯，2，3

1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.國家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點實驗室，遼寧 大連 116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow 的干燥根，是我國四大南藥之一。2020 年版《中華人民共和國藥典》記載巴戟天有補腎壯陽、強筋骨、祛風濕功效，用于治療陽痿遺精、宮冷不孕、少腹冷痛、月經(jīng)不調、筋骨萎軟、風濕痹痛等，其常用炮制品為巴戟肉、鹽巴戟天、制巴戟天[1]。巴戟天主要含蒽醌、環(huán)烯醚萜苷、多糖及寡糖類成分[2-3]，其中環(huán)烯醚萜苷類成分在心血管疾病、抗腫瘤、免疫調節(jié)等方面有很好的作用[4]，寡糖類成分補腎壯陽、抗抑郁作用較好[5]。本課題組前期對巴戟天鹽蒸前后化學成分的體外和體內變化規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)鹽蒸后巴戟天中寡糖類成分和環(huán)烯醚萜苷類成分的變化較大，耐斯糖等寡糖類成分含量明顯增加，而以水晶蘭苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類成分則降低[6]?？诜完祜嬈崛∫汉?，其有效成分的吸收效率可能對臨床療效產(chǎn)生影響。本試驗采用在體單向腸灌流方法對巴戟天鹽制前后的環(huán)烯醚萜苷類和寡糖類成分在小腸不同腸段（十二指腸、空腸、回腸）的吸收規(guī)律進行研究，探索鹽蒸是否對巴戟天有效成分的在體吸收產(chǎn)生影響。

1 儀器、試藥與動物

AE240 型1/10 萬電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），F(xiàn)A1004 電子天平（上海精密科學儀器有限公司），Agilent1100 高效液相色譜儀（Agilent 公司），超純水儀（法國Millipore 公司），DZTW 型調溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），RE52CS 型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），HH-S4 型水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司），電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫(yī)療器械一廠），H-Class/Xevo TQD 型三重四極桿液相質譜聯(lián)用儀（配有Masslynx4.1 色譜工作站，美國Waters 公司）。

巴戟天藥材（批號BJTBZ2013-2），購自安徽亳州藥材市場，產(chǎn)地廣西南寧，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學翟延君教授鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow 的干燥根。水晶蘭苷對照品（批號O0605AS，純度≥98.0%）、去乙酰車葉草苷酸對照品（批號J0329AS，純度≥98.0%），大連美侖生物技術有限公司；耐斯糖對照品（批號292-64121，純度≥99.0%），日本W(wǎng)ako 公司。烏拉坦（批號330H031），北京索萊寶科技有限公司；碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，天津市大茂化學試劑廠；氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀和氯化鎂均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；葡萄糖為分析純，東北制藥總廠；95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇為分析純；水為超純水；乙腈、甲醇為色譜純。

雄性SD 大鼠30 只，體質量180～220 g，購自遼寧長生生物有限公司，動物許可證號SCXK（遼）2017-0001。實驗前于相對濕度30%～50%、溫度25 ℃、12 h 光照/黑暗循環(huán)環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1 周，自由攝食飲水。

2 方法與結果

2.1 鹽巴戟天及其活性部位制備

取凈巴戟天，蒸透，趁熱除去木心，切段，干燥，得巴戟肉。巴戟肉加鹽拌勻（100 g 巴戟肉加入1.5 g鹽），用1.05 倍量水浸泡5.48 h，蒸2.9 h，烘干，即得鹽巴戟天。取鹽巴戟天，依次用10、8、8 倍量80%乙醇回流提取，各1 h，合并提取液，濃縮回收乙醇。浸膏加入適量蒸餾水混懸，依次用相同體積的乙酸乙酯、正丁醇各萃取3～5 次，減壓回收乙酸乙酯和正丁醇，分別得到乙酸乙酯萃取物（總蒽醌）、正丁醇萃取物（總環(huán)烯醚萜苷）和剩余水部分（總寡糖）[7]。

2.2 溶液制備

2.2.1 Krebs-Ringer 試液

稱取氯化鈣0.37 g、葡萄糖1.40 g，分別用適量水溶解。再分別稱取氯化鈉7.80 g、氯化鉀0.35 g、氯化鎂0.02 g、碳酸氫鈉1.37 g、磷酸二氫鈉0.32 g，用適量水溶解，將氯化鈣溶液和葡萄糖混合溶液緩慢加入上述鹽溶液中，定容至1 L，用時以HCl 或NaOH調節(jié)pH 值[8]。

2.2.2 對照品溶液

精密稱取水晶蘭苷5.11 mg、去乙酰車葉草苷酸2.52 mg、耐斯糖對照品5.08 mg，以Krebs-Ringer 試液定容至5 mL 容量瓶中，制得混合對照品溶液。

2.2.3 腸灌流液

用Krebs-Ringer 試液將鹽巴戟天正丁醇部位和水部位配制成135、270、540 g/L 灌流液，分別含水晶蘭苷17.29、32.25、49.28 g/L，去乙酰車葉草苷酸7.02、12.55、20.11 g/L，耐斯糖10.80、15.78、27.96 g/L。

2.2.4 供試品溶液

取腸灌流液樣品3 mL，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液，按高劑量（540 g/L）1∶8、中劑量（270 g/L）1∶1、低劑量（135 g/L）4∶3 稀釋，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜及質譜條件

2.3.1 環(huán)烯醚萜苷類成分

采用Agilent1100 高效液相色譜儀，Venusil MP C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0→15 min，5∶95→28.8∶71.2），檢測波長235 nm，流速0.8 mL/min，進樣量2.0 μL，柱溫25 ℃。

2.3.2 寡糖類成分

采用H-Class/Xevo TQD 型三重四極桿液相質譜聯(lián)用儀，Masslynx4.1色譜工作站。色譜條件：ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸-乙腈-0.1%甲酸水溶液，洗脫程序見表1，流速0.3 mL/min，進樣量1.0 μL。質譜條件：電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測模式進行負離子掃描，用于定量分析的離子對m/z 665.51→179.13，碰撞能量20 eV，運行時間13 min。

表1 寡糖類成分測定流動相洗脫程序

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗

分別取空白灌流液、對照品溶液、含環(huán)烯醚萜苷類和寡糖類成分的灌流液，按“2.3”項下條件進樣分析，結果見圖1、圖2。

圖1 鹽巴戟天環(huán)烯醚萜苷類成分HPLC 圖

圖2 鹽巴戟天寡糖類成分UPLC-QqQ-MS/MS 總離子流圖

2.4.2 線性關系考察

取“2.2.2”項下對照品溶液，水晶蘭苷和去乙酰車葉草苷酸混合對照品分別進樣2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL，耐斯糖對照品分別進樣1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μL，得到各成分的線性方程，見表2。

表2 3 種成分線性關系考察結果

2.4.3 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液，于1 d 內分別進樣5 次和連續(xù)5 d 每日同一時間各進樣1 次，測得各成分日內峰面積RSD 分別為水晶蘭苷1.7%、去乙酰車葉草苷酸1.6%、耐斯糖1.7%，日間峰面積RSD分別為水晶蘭苷1.7%、去乙酰車葉草苷酸1.7%、耐斯糖1.9%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.3”項下灌流液，按“2.2.4”項下方法處理后分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，將各時間點測得的峰面積與0 h 峰面積比較，考察其穩(wěn)定性。測得峰面積RSD 水晶蘭苷為1.9%，去乙酰車葉草苷酸為1.7%，耐斯糖為1.7%，均小于2.0%，表明此空白灌流液中3 種成分穩(wěn)定性良好。

2.4.5 物理吸附考察

分別取腸段和灌流管，分別置于中劑量灌流液（含水晶蘭苷32.25 g/L，去乙酰車葉草苷酸12.55 g/L，耐斯糖15.78 g/L），37 ℃恒溫水浴孵育30 min，孵育前后的灌流液按“2.2.4”項下方法處理，以孵育后灌流液各組分峰面積與孵育前各成分峰面積比值計算絕對回收率，結果各成分絕對回收率均大于95%，見表3。表明腸壁和灌流管對這3 種成分均無物理吸附。

表3 腸段及灌流管對鹽巴戟天灌流液中3 種成分的 物理吸附回收率（，%，n＝3）

表3 腸段及灌流管對鹽巴戟天灌流液中3 種成分的 物理吸附回收率（，%，n＝3）

2.5 單向腸灌流實驗

參照文獻[8]方法。將生理鹽水、灌流液、Krebs-Ringer 試液和收集瓶置于37 ℃水浴鍋中預熱。雄性SD 大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射20%烏拉坦溶液0.6 mL/100 g 麻醉，背位固定，沿腹中線打開腹腔，取全腸段或待測腸段（十二指腸、空腸、回腸）10～15 cm，于兩端切口插管，用生理鹽水沖洗腸腔，洗凈內容物，將傷口用浸泡過生理鹽水的脫脂棉蓋住保濕，紅外燈保溫。先用Krebs-Ringer試液以1 mL/min速度灌流10 min 平衡，然后用灌流液以1 mL/min 速度灌流10 min 使腸段內充滿灌流液，再調節(jié)速度至0.2 mL/min 灌流2 h，每隔30 min 更換一次收集瓶。灌流結束后剪下腸段，測量其長度（L）和橫截面半徑（r）。每個條件平行處理3 只大鼠。

采用重量法計算灌流液進出體積。精密稱取0.5 mL灌入液質量（min），計算其密度ρin，再精密稱取0.5 mL接出液質量（mout），計算其密度ρout，則灌流液流入體積Vin＝min/ρin，灌流液流出體積Vout＝mout/ρout。按下列公式計算藥物表觀滲透系數(shù)（Papp）、吸收速率常數(shù)（Ka）及每小時單位面積腸壁各組分累計吸收量（A）。

式中，Vin、Vout為灌流液流入和流出體積（mL），Cin和Cout為流入和流出灌流液的藥物濃度（g/L），L和r 為被測腸段的長度和橫截面半徑（cm），Qin為灌流速度（0.2 mL/min），t 為灌流時間（h）。測定結果用表示，采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.6 pH 值對鹽巴戟天中3 種成分在體腸吸收的影響

分別以pH 5.4、6.8、7.4 的中劑量（270 g/L）灌流液（含水晶蘭苷32.25 g/L、去乙酰車葉草苷酸12.55 g/L、耐斯糖15.78 g/L）對全腸段進行灌流，考察pH 值對環(huán)烯醚萜苷類成分和寡糖類成分全腸段吸收的影響，結果見表4。水晶蘭苷和去乙酰車葉草苷酸在pH 7.4 灌流液中的Papp和Ka與pH 5.4 灌流液比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與pH 6.8 灌流液比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；耐斯糖在pH 7.4、6.8、5.4 灌流液中的Papp差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Ka差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖在pH 7.4 灌流液中的Papp和Ka均大于pH 6.8 和pH 5.4 灌流液，表明巴戟天中環(huán)烯醚萜苷類成分在酸性條件下腸吸收較弱，原因可能是水晶蘭苷在酸性條件下不穩(wěn)定，會部分轉化成去乙酰車葉草苷酸[9]。因此灌流液pH 值選擇7.4。

表4 鹽巴戟天中3 種成分在不同pH 值灌流液中的 吸收參數(shù)比較（，n＝6）

表4 鹽巴戟天中3 種成分在不同pH 值灌流液中的 吸收參數(shù)比較（，n＝6）

注：與同組pH 7.4 比較，*P＜0.05

2.7 灌流液濃度對鹽巴戟天中3 種成分在體腸吸收的影響

分別以135、270、540 g/L 灌流液（pH 7.4）對全腸段灌流，考察灌流液的濃度對環(huán)烯醚萜苷類成分和寡糖類成分的全腸段吸收影響，結果見表5。水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸在中劑量（270 g/L）灌流液中的Papp和Ka與高劑量（540 g/L）比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中劑量（270 g/L）與低劑量（135 g/L）比較，水晶蘭苷和去乙酰車葉草苷酸差異無統(tǒng)計學意義，耐斯糖差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其藥物累積吸收量在中劑量時最高，表明這3 種成分存在自身濃度抑制現(xiàn)象。

表5 鹽巴戟天中3 種成分在不同濃度灌流液中的吸收參數(shù)比較（，n＝6）

表5 鹽巴戟天中3 種成分在不同濃度灌流液中的吸收參數(shù)比較（，n＝6）

注：與同組270 g/L 比較，*P＜0.05

2.8 鹽巴戟天中3 種成分在小腸不同腸段的吸收特性

取pH 7.4 的中劑量灌流液，分別對十二指腸、空腸和回腸進行灌流，考察環(huán)烯醚萜苷類成分和寡糖類成分在3 個腸段的吸收狀況，結果見表6。水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖在十二指腸、空腸、回腸的吸收參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義。比較Ka發(fā)現(xiàn)，水晶蘭苷在空腸部位吸收速率較大，不同腸段依次為空腸＞十二指腸＞回腸，表明水晶蘭苷的主要吸收部位在空腸；去乙酰車葉草苷酸在回腸部位吸收速率較大，不同腸段依次為回腸＞空腸＞十二指腸，表明去乙酰車葉草苷酸的主要吸收部位在回腸；耐斯糖在回腸部位吸收速率較大，不同腸段依次為回腸＞十二指腸＞空腸，表明耐斯糖的主要吸收部位在回腸。

表6 鹽巴戟天3 種成分在小腸不同腸段的吸收參數(shù)比較（，n＝6）

表6 鹽巴戟天3 種成分在小腸不同腸段的吸收參數(shù)比較（，n＝6）

注：與同腸段水晶蘭苷比較，*P＜0.05；與同腸段去乙酰車葉草苷酸 比較，#P＜0.05

比較3 種成分在同一腸段的吸收速率發(fā)現(xiàn)，在十二指腸和空腸，水晶蘭苷與去乙酰車葉草苷酸的吸收參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而二者在回腸的Ka差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。耐斯糖與另2 種成分比較，不同腸段Ka差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且均大于另2 種成分，吸收速率依次為耐斯糖＞去乙酰車葉草苷酸＞水晶蘭苷。

2.9 巴戟天鹽蒸前后3 種成分在小腸中的吸收特性

按“2.6”“2.7”項下篩選出的最佳pH 值和最佳給藥濃度，即pH 7.4 的中劑量（270 g/L）灌流液（含水晶蘭苷32.25 g/L，去乙酰車葉草苷酸12.55 g/L，耐斯糖15.78 g/L），分別對小腸3 個腸段進行灌流，考察巴戟肉和鹽巴戟天中環(huán)烯醚萜苷類成分和寡糖類成分的Papp，結果見表7。在小腸不同腸段中，鹽巴戟天中3 種成分的Papp均大于巴戟肉，其中水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），耐斯糖在十二指腸和空腸差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明巴戟天經(jīng)鹽制后水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸及耐斯糖在小腸的腸吸收增加。

表7 鹽巴戟天與巴戟肉中3 種成分Papp 比較（，×10-3 cm?s-1，n＝6）

表7 鹽巴戟天與巴戟肉中3 種成分Papp 比較（，×10-3 cm?s-1，n＝6）

注：與鹽巴戟天同一成分比較，*P＜0.05

3 討論

腸吸收是中藥的主要吸收途徑，研究中藥在腸道中的吸收狀況對改善生物利用度、給藥劑量等具有指導意義[10]。對于炮制研究，比較炮制前后飲片中的有效成分的吸收特性，有助于解析其炮制機理。目前常用的在體腸吸收模型有腸襻法和腸灌流法[11]。腸灌流法是最接近體內腸道吸收狀態(tài)的一種模型，分為在體單向腸灌流和在體循環(huán)腸灌流[12-13]。單向灌流法結合人體腸灌流實驗灌流速度，以人體實驗1/10 的灌流速度（0.2～0.3 mL/min）對大鼠進行實驗，灌流時間較短（不超過2 h）。此狀態(tài)接近大鼠腸道正常蠕動狀態(tài)，且與人體具有良好相關性，因此本實驗選用在體單向腸灌流法進行測定[14]。

小腸既能吸收藥物，也能吸收水分。傳統(tǒng)方法采用加入難吸收標記物如酚紅等標記灌流液，以便計算時校正灌流液體積[15]。但酚紅可被少量吸收，且對一些藥物的吸收測定產(chǎn)生影響[16]，故目前多采用重量法對藥物及水分的吸收進行評價，操作更加簡便、安全。依據(jù)Papp可將腸道對藥物的吸收分為三類：當Papp＜0.03×10-4cm?s-1時，表明腸道對此物質基本不吸收；當Papp＞0.2×10-4cm?s-1時，表明此物質在腸道中吸收良好；當Papp介于上述兩者之間時，表明有吸收但吸收不完全[17]。本研究顯示，水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、耐斯糖Papp均大于0.2×10-4cm?s-1，表明這3 種成分在小腸段吸收良好，但吸收腸段各有不同，水晶蘭苷的主要吸收部位在空腸，去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖的主要吸收部位在回腸。

鹽巴戟天中環(huán)烯醚萜苷類成分和寡糖類成分在小腸中吸收良好，且經(jīng)鹽制后這兩類成分的腸吸收特性均優(yōu)于巴戟肉。但水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸和耐斯糖在小腸吸收時存在自身濃度抑制現(xiàn)象，應注意給藥劑量。另外，腸道菌群對藥物的腸吸收特性也會產(chǎn)生一定影響，為更好闡釋鹽巴戟天的炮制機理，還需深入進行相關研究。