基于TGF-β1/Smads通路的鹿紅方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

楊曉利，瞿惠燕，戎靖楓，楊天舒，蘭真真，周華，

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；3.上海市中西醫(yī)結(jié)合心血管病研究所，上海 201203

心力衰竭是一種由于心室收縮或舒張功能受限，導(dǎo)致心室不能正常射血而引起心臟組織灌注不足、靜脈系統(tǒng)淤血等表現(xiàn)的循環(huán)障礙疾病[1]，是各種心臟疾病最終階段。我國約有450 萬心力衰竭患者，并以每年50 萬人速度增長[2]。如何有效防治慢性心力衰竭已成為目前心血管疾病亟需攻克的難題。研究表明，心力衰竭的發(fā)病原因以心肌梗死最為常見，其關(guān)鍵病理機(jī)制為心室重構(gòu)[3]，而心室重構(gòu)的基礎(chǔ)病理變化是心肌纖維化[4]。故尋找防治心肌纖維化，延緩心室重構(gòu)，減少心肌梗死后心力衰竭的藥物尤為重要。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是促進(jìn)膠原和纖維連接蛋白合成與沉積的關(guān)鍵因子，可刺激下游Smads蛋白在心肌纖維化中發(fā)揮重要作用[5-7]。盡管西醫(yī)治療可在一定程度上改善心肌纖維化，降低心力衰竭的發(fā)病率和死亡率，但長期使用存在耐藥性及不良反應(yīng)。中醫(yī)藥治療具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)干預(yù)的優(yōu)勢，可有效改善慢性心力衰竭。鹿紅方是周華教授依據(jù)“心腎相關(guān)”理論及多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的院內(nèi)制劑，具有溫補(bǔ)心腎、活血通絡(luò)功效，與目前臨床常見的陽虛血瘀型心力衰竭契合。課題組前期臨床及基礎(chǔ)研究顯示，鹿紅方能顯著改善心功能、抑制心臟間質(zhì)重構(gòu)、延緩心力衰竭的發(fā)展[8-11]。本研究以心肌梗死后心力衰竭大鼠為模型，基于TGF-β1/Smads 通路探討鹿紅方對心肌纖維化的影響，進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級Wistar 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量（213±27）g，8 周齡，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號SYXK（滬）2017-0014，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號SZY201807001。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（25±1）℃、濕度30%攝食，自由飲水，光照周期12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

鹿紅方（鹿角片15 g，紅花9 g，補(bǔ)骨脂20 g，淫羊藿30 g，女貞子30 g，山萸肉15 g，沉香6 g），飲片均為顆粒劑，江陰天江藥業(yè)有限公司提供；培哚普利片，8 mg/片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號190527-02。

1.3 主要試劑與儀器

TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 引物，上海擎熙生物科技有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox），瑞士Roche 公司，貨號04913 914001；HyPureTMMolecular Biology Grade Water，美國HyClone 公司，貨號SH30538.02；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美國Thermo 公司，貨號#K1622。Masson 組織芯片掃描儀，匈牙利3DHISTECH 公司，型號Pannoramic 250；小型動(dòng)物呼吸機(jī)，江西特力公司，型號TIC-200A；彩色多普勒超聲，美國GE 公司，型號Voluson i；顯微鏡，日本Olympus，型號4kx41；熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司，型號7300。

1.4 造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，術(shù)前12 h 禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉，固定于手術(shù)板上，剪去胸部毛發(fā)，連接心電圖機(jī)，記錄術(shù)前心電圖。持氣管插管向下輕輕按壓大鼠舌根部，充分暴露會(huì)厭區(qū)，待氣管開放迅速插入氣管插管，連接呼吸機(jī)，見胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致為插管成功。消毒心前區(qū)，于左側(cè)胸部第4～5 肋間心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處剪開長約1 cm 皮膚，剝離橫紋肌和豎紋肌，撐開肋間肌，充分暴露心臟，撕開心包膜，找到左心耳，在距左心耳根部1 mm 處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎處心肌顏色由紅轉(zhuǎn)白、心臟跳動(dòng)節(jié)律逐漸減弱、心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST 段呈現(xiàn)弓背向上抬高，表明心肌梗死模型制備成功[12-13]。立即將心臟回位，止血后縫合肌肉、皮膚，大鼠恢復(fù)自主呼吸后撤掉呼吸機(jī)，右側(cè)臥位于恒溫墊上至大鼠蘇醒，予以水和食物并密切觀察術(shù)后情況。術(shù)后14 d 行超聲心動(dòng)圖檢查，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≤50%表明心肌梗死后心力衰竭模型制備完成[14]。假手術(shù)組只縫合不結(jié)扎。

1.5 分組及給藥

大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、培哚普利組和鹿紅方低、中、高劑量組，每組10 只。成模后灌胃給藥，給藥劑量參照成人每日常用劑量進(jìn)行換算[15]，鹿紅方低劑量組0.625 g/kg、中劑量組1.25 g/kg、高劑量組2.5 g/kg，培哚普利組2 mg/kg，假手術(shù)組和模型組予等體積生理鹽水。給藥體積1 mL/kg，每日1 次，連續(xù)8 周。

1.6 心臟功能觀察

藥物干預(yù)8 周后，稱量大鼠體質(zhì)量，1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，彩色多普勒超聲檢測各組大鼠LVEF 及縮短分?jǐn)?shù)（FS）。

1.7 病理觀察

大鼠麻醉后開胸，剪斷主動(dòng)脈，取出心臟，PBS沖洗，切除部分心臟組織放入多聚甲醛溶液中，經(jīng)脫水、包埋、切片等程序后進(jìn)行HE 和Masson 染色?；贛asson 染色結(jié)果，使用Image Pro Plus 6.0 計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），即心肌膠原面積占全視野面積的百分比。

1.8 轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)檢測

取大鼠心肌組織，Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA 濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，按PCR 試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，循環(huán)40 次，75～95 ℃每20 s 升溫1 ℃，繪制融解曲線。以GAPDH 為內(nèi)參，運(yùn)用PCR 儀分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到樣品的Ct 值，并計(jì)算ΔCt，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.9 轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達(dá)檢測

取100 mg 心肌組織，剪碎后加入1 mL RIPA 裂解液（含10 μL PMSF），冰上勻漿10 s×3 次，靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度；上樣，電泳（75 V、20 min，120 V、20 min），200 mA 轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h；滴加TGF-β1 一抗（1∶200）、Smad2 一抗（1∶400）、Smad3 一抗（1∶400）和Smad7 一抗（1∶400），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜5 min×3 次，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育30 min，TBST 洗膜5 min×3 次；ECL 發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，以GAPDH 為內(nèi)參，使用Alpha3.2.0.8 分析目的蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)死亡情況，模型組大鼠因水腫較重死亡4 只，培哚普利組死亡2 只，鹿紅方低劑量組死亡2 只，鹿紅方中、高劑量組各死亡1 只。模型組大鼠術(shù)后食欲明顯減退，毛發(fā)缺乏光澤，活躍度明顯降低，體質(zhì)量明顯減輕，各給藥組大鼠上述情況較模型組均有所改善。

2.2 鹿紅方對模型大鼠心功能的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、FS 明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠LVEF、FS 明顯升高（P＜0.01）；與培哚普利組比較，鹿紅方中、高劑量組大鼠LVEF、FS 明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠LVEF、FS 比較（，%）

表2 各組大鼠LVEF、FS 比較（，%）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與培哚 普利組比較，▲P＜0.05

2.3 病理觀察結(jié)果

HE 染色顯示，假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列較緊密，分界輪廓較清晰，未見細(xì)胞壞死，間質(zhì)內(nèi)有少量肥大細(xì)胞浸潤；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂無序，局部出現(xiàn)心肌細(xì)胞消失，被大量增生的結(jié)締組織替代，心肌細(xì)胞明顯水腫甚至壞死，結(jié)締組織內(nèi)存在大量淋巴細(xì)胞浸潤，局部可見較多肥大細(xì)胞；鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠結(jié)締組織增生相對減少，可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞水腫、壞死及纖維化程度均有不同程度減輕。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織形態(tài)（HE 染色，×100）

Masson 染色顯示，模型組大鼠心臟組織出現(xiàn)大量膠原纖維沉積，心肌纖維化病變比較明顯，局部有大量肌纖維斷裂、萎縮變性，梗死區(qū)域附近存在大量炎性細(xì)胞浸潤；鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠心臟組織膠原纖維沉積減少，炎性細(xì)胞浸潤減輕，局部肌纖維斷裂和萎縮變性程度均有所改善。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織形態(tài)（Masson 染色，×20）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠CVF 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠CVF 顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠CVF 比較（，%）

表3 各組大鼠CVF 比較（，%）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.4 鹿紅方對模型大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)顯著升高，Smad7 mRNA表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方中、高劑量組及培哚普利組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)明顯降低，Smad7 mRNA 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），鹿紅方低劑量組大鼠心肌組織Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

2.5 鹿紅方對模型大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），Smad7蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，鹿紅方低、中、高劑量組及培哚普利組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2 蛋白表達(dá)明顯降低，Smad7 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），鹿紅方中、高劑量組及培哚普利組大鼠心肌組織Smad3 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。結(jié)果見表5、圖3。

表5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達(dá)比較（）

表5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

圖3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白免疫印跡圖

3 討論

心肌損傷后，心肌組織纖維化改變導(dǎo)致的心室重構(gòu)是心力衰竭的主要病理機(jī)制[16-17]，亦是構(gòu)成心力衰竭患者預(yù)后不佳的主要因素。研究顯示，TGF-β1/ Smads 信號通路是引起心肌纖維化的經(jīng)典途徑，其中TGF-β1 是心肌纖維化引起心室重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)控因子，具有強(qiáng)促纖維化作用，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原增生與合成及纖維連接蛋白的沉積[18]。TGF-β1 通過激活Smads 蛋白促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，引起細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，導(dǎo)致心肌纖維化，誘發(fā)心力衰竭[19-21]。研究表明，以Smad2、Smad3 為代表的受體調(diào)節(jié)蛋白被磷酸化后，可與Smad4 通用蛋白結(jié)合[22]，TGF-β1 可刺激進(jìn)入細(xì)胞核的Smad4，激活纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)心肌纖維化。Smad7 能使Smad2、Smad3 的磷酸化受到抑制，發(fā)揮抗纖維化作用，TGF-β1 可通過抑制Smad7 激活Smad2 和Smad3而起到負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)[23]。因此，基于TGF-β1/ Smads 信號通路尋求防治心肌纖維化的策略為心力衰竭治療提供了新方向。

心力衰竭屬中醫(yī)學(xué)“心痹”“水腫”等范疇，其基本病因可概括為心氣虛，以虛、瘀、水為特點(diǎn)。鹿紅方方中鹿角片溫腎益精、行血消腫，紅花活血祛瘀止痛，二者同用達(dá)到通利心脈、溫陽活血效果，共為君藥；補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽、納氣平喘，淫羊藿溫腎壯陽、強(qiáng)筋健骨，二者聯(lián)用增強(qiáng)鹿角溫補(bǔ)腎陽的作用，共為臣藥；山萸肉補(bǔ)益肝腎、收斂固澀，女貞子補(bǔ)益肝腎、清除虛熱，沉香溫腎降逆、納氣平喘，三者共為佐藥。全方以補(bǔ)虛為本，兼顧瘀血，滋陰補(bǔ)陽，重在補(bǔ)陽，達(dá)到陰中求陽的目的。心腎相交，心本乎腎，從而達(dá)到溫腎強(qiáng)心的作用。以上藥物相互配合使用，與心腎兩臟陽氣不足，無力行血導(dǎo)致血脈不暢，水飲停滯的病機(jī)相對應(yīng)。臨床上鹿紅方可改善慢性心力衰竭患者臨床癥狀及心功能，顯著改善心肌纖維化[24]?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，鹿紅方可有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心臟間質(zhì)重構(gòu)[25-27]，其中鹿角能增強(qiáng)心肌收縮力，改善冠脈血流和心肌重構(gòu)，調(diào)節(jié)心肌能量代謝，進(jìn)而延緩心力衰竭進(jìn)程補(bǔ)充文獻(xiàn)[28]；紅花可抑制心臟重構(gòu)，延緩脂多糖誘導(dǎo)的心肌纖維化[29]；補(bǔ)骨脂能增強(qiáng)大鼠超氧化物歧化酶活性，使心肌組織中丙二醛含量與體內(nèi)氧自由基減少，從而抑制慢性心力衰竭心肌損傷[30]；淫羊藿苷可改善心功能，延緩心肌纖維化，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[31]；山萸肉、女貞子中齊墩果酸等成分可增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌纖維化[32]。

本研究發(fā)現(xiàn)，鹿紅方能提高模型大鼠LVEF 和FS，改善心功能，減少心肌組織炎性細(xì)胞浸潤、結(jié)締組織增生、心肌纖維化，下調(diào)TGF-β1、Smad2 及Smad3 mRNA 和蛋白表達(dá)，上調(diào)Smad7 mRNA 和蛋白表達(dá)，以鹿紅方中、高劑量組效果最明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，鹿紅方對心肌纖維化具有良好的抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smads 通路有關(guān)，可為中醫(yī)藥防治心肌纖維化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。