UPLC-MS測(cè)定動(dòng)物組織中氯霉素過(guò)程中測(cè)量不確定度的評(píng)定

何莉媛，陳 煜，王洪健，李思柔，譚文鳳，劉瑩瑩

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司湖南分公司，湖南長(zhǎng)沙 410006；2.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；3.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；4.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

氯霉素是一種酰胺醇類抗生素，因其優(yōu)越的抗菌性能，曾被廣泛的運(yùn)用到畜牧、家禽以及水產(chǎn)的養(yǎng)殖過(guò)程中，能有效控制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌以及厭氧菌的生長(zhǎng)[1-3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)氯霉素對(duì)人體的毒副作用明顯，美國(guó)、歐盟及中國(guó)等國(guó)家相繼出臺(tái)政策[3-6]，在動(dòng)物源性食品中限制氯霉素的檢出。我國(guó)已于2002年對(duì)動(dòng)物源性食品中氯霉素的殘留量明確了限量標(biāo)準(zhǔn)[7]，2019年再次發(fā)布公告明令禁止[8]，但食品安全監(jiān)督抽檢時(shí)，仍不乏氯霉素殘留量不合格的現(xiàn)象[9-13]。獸藥殘留超標(biāo)是動(dòng)物源性食品的最大安全隱患，高效準(zhǔn)確地檢測(cè)藥物殘留，不僅有助于食品安全的提升，也有助于規(guī)范畜禽水產(chǎn)的養(yǎng)殖。

在檢測(cè)過(guò)程中檢驗(yàn)員無(wú)法消除儀器測(cè)量結(jié)果與實(shí)際真值之間的差距[14-15]。通過(guò)賦予被測(cè)量值分散性、評(píng)定被測(cè)量值與測(cè)量結(jié)果之間聯(lián)系，得到待測(cè)物質(zhì)的測(cè)量不確定度[16-17]。測(cè)量不確定度可為檢驗(yàn)合格判定提供真實(shí)有效的依據(jù)，完整的測(cè)量結(jié)果表述時(shí)應(yīng)包含測(cè)量不確定度。尤其是當(dāng)測(cè)量結(jié)果接近標(biāo)準(zhǔn)限值時(shí)，將測(cè)量不確定度納入合格判定的考量范圍，有助于檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)評(píng)判產(chǎn)品是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求[17]。隨著《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則（2021版）》的實(shí)施和推廣，相較其他檢測(cè)方法，《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留檢測(cè)》（GB 22338—2008）[18]的適用性更強(qiáng)，覆蓋的樣品基質(zhì)類型更多，目前暫未有研究評(píng)定該方法的測(cè)量不確定度。本文依據(jù)GB 22338—2008研究雞肉中的氯霉素檢測(cè)，評(píng)定檢測(cè)過(guò)程中的測(cè)量不確定度，依據(jù)相關(guān)準(zhǔn)則[18-21]建立氯霉素測(cè)定的測(cè)量不確定度分析模型，分析檢測(cè)過(guò)程中的相對(duì)擴(kuò)展不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?。氯霉素?biāo)準(zhǔn)品（100±0.11）μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所；氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品（100.1±3）mg/L，安譜；乙腈、丙酮、正丙醇、正己烷（色譜級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRIPLE QUAD 4500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLCMS）：配有電噴霧離子源（美國(guó)AB SCIEX公司）；ME204E/02分析天平（精密度：0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；SPE-24固相萃取裝置（上海汗諾儀器有限公司）等。

本次實(shí)驗(yàn)中所涉及的天平，超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，量具等儀器均經(jīng)過(guò)湖南省計(jì)量院計(jì)量溯源，儀器狀態(tài)滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留檢測(cè)》（GB/T 22338—2008）[22]中第3點(diǎn)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，對(duì)草魚(yú)進(jìn)行前處理，測(cè)定氯霉素含量。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液（100.0 ng/mL）：用 100 μL移液槍移取濃度為100.0 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL至100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度。

（2）氯霉素 -D5標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.001 μg/mL）：準(zhǔn)確移取濃度為100.1 μg/mL的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL至10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度后準(zhǔn)確移取1 mL至10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度。

（3）氯霉素 -D5標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.100 1 μg/mL）：準(zhǔn)確移取濃度為1.001 μg/mL的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL至10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度。

（4）氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取氯霉素中間液（100.0 ng/mL）0.025 mL、0.050 mL、0.100 mL、0.200 mL、0.500 mL、1.00 mL、2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，各加入氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液（1.001 μg/mL）1 mL，用V（水）∶V（乙腈）∶V（10 mmol/L乙酸銨）=70∶25∶5定容至刻度，混勻。此標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度分別為0.25 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為10.01 ng/mL。

1.3.2 氯霉素殘留量測(cè)定

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定試樣中氯霉素殘留量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，定量結(jié)果按式（1）計(jì)算：

式（1）中：X為試樣中氯霉素的含量，μg/kg；C為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，ng/mL；Csi為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，ng/mL；Ci為樣液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，ng/mL；As為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積；A為樣液中氯霉素的峰面積；Asi為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai為樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V為試樣定容體積，mL；W為樣品稱樣量，g。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

本文中測(cè)試的數(shù)據(jù)，其平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均用Excel計(jì)算。

2 不確定度分量的分析與計(jì)算

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)測(cè)定方法的主要步驟，動(dòng)物組織中氯霉素含量分析的不確定度主要來(lái)源于：①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；②標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；③樣品處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；④在重復(fù)條件下，進(jìn)行6次測(cè)量的結(jié)果重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；⑤最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。不確定度主要來(lái)源詳情如圖1所示。

圖1 動(dòng)物組織中氯霉素含量分析不確定度的主要來(lái)源

2.2 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配制標(biāo)準(zhǔn)中間液時(shí)引入的測(cè)量不確定度如圖1所示。配制過(guò)程中所使用的量器均經(jīng)過(guò)湖南省計(jì)量研究院檢定且合格，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及量具所帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表1所示。

表1 配制過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線所用內(nèi)標(biāo)溶液為同一氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)中間液，加入的量一致，因此內(nèi)標(biāo)溶液配制過(guò)程中稱取、稀釋體積及純度的不確定度的分量可忽略不計(jì)，只考慮內(nèi)標(biāo)溶液取樣體積的不確定度。

移取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過(guò)程中在（20±4）℃條件下進(jìn)行，與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度20 ℃存在溫度偏差，且液體的體積膨脹明顯大于玻璃容器的體積膨脹，因此只考慮前者即可。采用乙腈溶解、定容氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，所以應(yīng)當(dāng)考慮乙腈的體系膨脹。乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，由溫度波動(dòng)引起溶解體積偏差為u（vt1）、定容體積偏差為u（vt2），假設(shè)為均勻分布k=，則溫度變化引入的溶解相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（2），定容對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（3）。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成見(jiàn)式（4）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)不確定度由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)不確定度合成見(jiàn)式（5）。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程中引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來(lái)源為容量瓶定容體積、移液槍移取溶液、實(shí)驗(yàn)室溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度之間的差距。實(shí)驗(yàn)在（20±4）℃條件下進(jìn)行，配制用容量瓶具經(jīng)鑒定均為A級(jí)，且移液槍和容量瓶均由湖南省計(jì)量研究院檢定合格，按均勻分布計(jì)算，k=，定容溶液中，水占的比例較大，以水的膨脹系數(shù)計(jì)算，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，容量瓶和移液槍的最大允差及溫度變化引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的如表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制時(shí)使用容量瓶、移液器和溫度偏差引入的相對(duì)不確定度

配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

配制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)不確定度為：

2.2.3 樣品處理過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度

稱量過(guò)程中所使用的電子天平及F1砝碼均經(jīng)過(guò)湖南省計(jì)量研究院檢定且合格，天平及砝碼引入的相對(duì)不確定度，詳見(jiàn)表3。用該天平重復(fù)秤量一份樣品6次，得到5.018 5 g、5.018 9 g、5.016 7 g、5.020 4 g、5.017 3 g 和 5.019 9 g，均值為5.018 6 g，方差為1.03×10-5g2，稱取樣品產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（9）。

表3 天平和砝碼引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品按照標(biāo)準(zhǔn)[18]要求完成前處理后，加入100 μL內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)中間液，在（20±4）℃條件下，用移液槍加入1 000 μL的水，樣品處理過(guò)程中所用量器及溫度引入不確定度見(jiàn)表4。

表4 樣品處理過(guò)程中所用量器及溫度引入的相對(duì)不確定度

樣品處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（10）

2.2.4 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

選用一份陽(yáng)性的樣品，樣品中氯霉素的含量為0.101 μg/kg，從中選取6份（n=6），經(jīng)處理后，進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，測(cè)量結(jié)果重復(fù)性偏差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（11）。

表5 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差（峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測(cè)定3次（m=3），得到氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液峰面積之比，取平均值。以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度與氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度之比為X坐標(biāo)，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液峰面積之比作為Y坐標(biāo)，用最小二乘法擬合求出一元回歸方程及相關(guān)系數(shù)，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液3次測(cè)定的結(jié)果

采用最小乘法擬合濃度-峰面積之比的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為y=0.042 1x＋0.000 1；相關(guān)系數(shù)為：r=1.000 0＞0.995，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）標(biāo)準(zhǔn)要求，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液峰面積之比和氯霉素的濃度具有顯著的線相關(guān)性。根據(jù)貝塞爾公式，標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差SY見(jiàn)式（12），測(cè)量樣品溶液6次（p=6）詳見(jiàn)表5，平均濃度為0.498 μg/mL，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度時(shí)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（13）。

式中：yij為儀器實(shí)測(cè)各點(diǎn)峰面積之比；a為為線性回歸方程的截距；b為線性回歸方程的斜率；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量點(diǎn)數(shù)，n=7；m為標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的重復(fù)次數(shù)，m=3；C標(biāo)ij為氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度與氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度之比，ng/mL；為C標(biāo)ij的平均值，ng/mL。

最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（14）。

2.3 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

2.3.1 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合以上由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)曲線配制、樣品處理、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度、測(cè)量重復(fù)性5個(gè)方面引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，得到合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)式（15）。

2.3.2 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

假設(shè)該測(cè)量誤差屬于正態(tài)分布，置信區(qū)間為95%時(shí)，取包含因子k為2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度見(jiàn)式（16）。

樣品中氯霉素檢測(cè)為0.101 μg/kg，則其擴(kuò)展不確定度見(jiàn)式（17）。

3 結(jié)論

分析得出，本文所用雞肉樣品中氯霉素殘留量可表示為W=（0.101±0.008 76）μg/kg，其中包含因子k=2，不符合中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告（第250號(hào)）《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》[8]對(duì)動(dòng)物組織中氯霉素最大殘留量的限制。雞肉中氯霉素殘留量測(cè)量不確定度的評(píng)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)已分析的不確定度來(lái)源中，所占比重最大是標(biāo)準(zhǔn)曲線配制，其次是最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中多次使用容量瓶及移液槍的前處理步驟引入相對(duì)不確定度最大。在測(cè)量重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀儀器性能穩(wěn)定，有較好的重復(fù)性。因此，保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)狀態(tài)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確可靠、提高人員操作規(guī)范性，可有效提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，增加多次測(cè)量等質(zhì)量控制手段也能有效降低不確定度，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。