高效液相色譜法測(cè)定山杏內(nèi)種皮磷脂類化合物

鮑宇宏

【摘 要】以山杏內(nèi)種皮為原料，高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法測(cè)定磷脂含量，采用ZORBAX Rx-SIL型硅膠柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動(dòng)相為乙腈-甲醇（15：85，體積比），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)得山杏內(nèi)種皮中磷脂酰乙醇胺（PE）含量為0.393 4 mg/g。

【關(guān)鍵詞】磷脂；高效液相色譜分析；山杏內(nèi)種皮

山杏是我國(guó)北方干旱山地丘陵區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，目前對(duì)山杏的研究主要集中在對(duì)山杏仁的研究，山杏內(nèi)種皮通常作為杏仁加工廢料被丟棄，未見(jiàn)有對(duì)磷脂類物質(zhì)提取及分析的報(bào)道。本文以山杏內(nèi)種皮為原料，研究山杏內(nèi)種皮磷脂類化合物，利用高效液相色譜法測(cè)定含量，以便為生產(chǎn)中提取、測(cè)定山杏內(nèi)種皮磷脂類化合物提供技術(shù)依據(jù)，為山杏資源的充分開(kāi)發(fā)利用提供參考。

一、材料與方法

1.1儀器

AR1140型電子天平：梅特勒-托利多公司；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司； TGL16M型高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DGG-9023A電熱恒溫真空干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JP-500C粉碎機(jī)：永康市久品工貿(mào)有限公司； Milli-Q Academic超純水儀：美國(guó)密理博公司；ZORBAX Rx-SIL：美國(guó)安捷倫公司；LC-16高效液相色譜儀：日本島津公司；SPD-16檢測(cè)器：日本島津公司。

1.2 材料與試劑

山杏仁，浸泡去皮，種皮洗凈，風(fēng)干，粉碎，過(guò)篩（80目），干燥器中保存。

磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；甲醇、乙腈、正己烷、無(wú)水乙醇：天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯仿、氯化鈉：天津市津科精細(xì)化工研究所。液相色譜所用試劑均為色譜純，且經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾并超聲脫氣。其他試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1 制備磷脂類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取一定量的磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰膽堿（PC）標(biāo)準(zhǔn)品分別置于2 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為PG：1.60 mg/mL，PC：1.60 mg/mL，PE：1.40 mg/mL。分別移取一定量的各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于2 mL容量瓶中，用甲醇定容得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 制備樣品

稱取樣品1.000 0 g，加入正己烷-甲醇（1：1，體積比）試劑15 mL，超聲功率450 W，超聲提取50 min，放置至室溫，加正己烷-乙醇提取試劑補(bǔ)至原重，6 000 r/min離心10 min，取上清液用適量的0.75 %氯化鈉溶液萃取2次，收集有機(jī)相。將有機(jī)相旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用甲醇定容至10 mL。取樣品溶液1 mL，甲醇稀釋至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Rx-SIL柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈：甲醇=15：85（體積比）；等度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

二、結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)考察了流動(dòng)相為乙腈、甲醇、乙腈-甲醇等不同組成及比例時(shí)3種磷脂類化合物的分離情況。試驗(yàn)結(jié)果可知，由流動(dòng)相為100 %甲醇或100 %乙腈時(shí)，PG和PE出峰時(shí)間相近，分離度差，最終確定乙腈-甲醇（15：85，體積比）為流動(dòng)相。

2.2 流速的選擇

試驗(yàn)中選取流速分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min，考察流速的不同對(duì)磷脂各組分的分離度、出峰時(shí)間及信號(hào)強(qiáng)度的影響。流速越小，出峰越慢，且峰形不好，分叉或跟有若干小峰，流速越大，出峰時(shí)間越快，峰形越好，但PE與PG出峰時(shí)間越接近。綜合考慮，確定流速為1.0 mL/min。

2.3 柱溫的選擇

試驗(yàn)考察了不同柱溫對(duì)分離效果的影響。色譜柱溫度升高，柱壓下降，色譜峰與雜質(zhì)分離充分，峰形良好，利于檢測(cè)結(jié)果的分析，但長(zhǎng)時(shí)間保持較高溫度，磷脂易發(fā)生氧化或分解反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。試驗(yàn)結(jié)果表明，在 35 ℃的條件下檢測(cè)效果最好。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，高效液相色譜法分析磷脂類化合物的條件：流動(dòng)相為乙腈-甲醇（15：85，體積比），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃。在此條件下，3種磷脂類化合物標(biāo)準(zhǔn)品色譜分離情況最佳。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取1.3.1制備的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積×10-6值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。以信噪比S/N=3測(cè)定的結(jié)果計(jì)算檢出限。

2.6 精密度試驗(yàn)

將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次，3種磷脂化合物峰面積的RSD值分別為：PG1.53 %， PC1.01 %， PE1.17 %，儀器精密度良好。

2.7 樣品測(cè)定

精密稱取山杏內(nèi)種皮樣品，按1.3.2試驗(yàn)方法處理，在1.3.3色譜條件下測(cè)定，平行測(cè)定6次。根據(jù)回歸方程計(jì)算山杏內(nèi)種皮PE含量為0.3934mg/g。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將樣品溶液按1.3.3色譜條件每隔2小時(shí)測(cè)定一次，重復(fù)6次，PE峰面積的RSD值為1.23 %，樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

稱取山杏內(nèi)種皮樣品1.0000g置于具塞錐形瓶中，分別加入一定體積的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，按1.3.2試驗(yàn)方法處理樣品，按1.3.3色譜條件測(cè)定。

三、結(jié)論

本文探討了高效液相色譜檢測(cè)山杏內(nèi)種皮中磷脂類化合物的方法。采用ZORBAX Rx-SIL型硅膠柱（4.6 mm×250 mm， 5μ m），檢測(cè)磷脂類化合物條件為：流動(dòng)相為乙腈-甲醇（15：85，體積比），等度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，山杏內(nèi)種皮磷脂酰乙醇胺（PE）含量為0.393 4 mg/g。本研究為山杏資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

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